《一种用于抗肿瘤和抗转移治疗的胆固醇－低分子量肝素的纳米制剂及制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种用于抗肿瘤和抗转移治疗的胆固醇－低分子量肝素的纳米制剂及制备方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810604630.8 (22)申请日 2018.06.08 (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 慈天元 柯学 曹丁凌格 李锦 冯淑君 (51)Int.Cl. A61K 9/107(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 31/727(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61。
2、P 35/04(2006.01) (54)发明名称 一种用于抗肿瘤和抗转移治疗的胆固醇 低分子量肝素的纳米制剂及制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于抗肿瘤和抗转移治疗 的负载抗肿瘤药物的胆固醇低分子量肝素的 纳米制剂及制备方法。 具体为将具有优异生物相 容性的胆固醇作为疏水片段和疏水药物储库， 包 载抗肿瘤药物， 外壳为具有抗转移活性的亲水性 低分子量肝素， 以制备一种用于术后防复发的新 型纳米制剂， 在杀灭肿瘤细胞的同时实现抑制肿 瘤细胞转移的作用。 该纳米制剂的载药量在 5wt-20wt之间， 所制备的纳米制剂具有可注 射性， 通过尾静脉注射给药， 可以在提高药物抗 癌效果的同时， 。
3、发挥低分子量肝素的抗转移活 性。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 108451906 A 2018.08.28 CN 108451906 A 1.一种纳米胶束制剂， 其特征在于， 药物载体材料为胆固醇修饰的低分子量肝素衍生 物， 在水性条件下， 形成以低分子量肝素为亲水外壳、 胆固醇为疏水内核的纳米胶束， 可包 载抗癌药物， 在化疗药物发挥抗肿瘤作用的同时发挥低分子量肝素的抗转移活性。 本发明 的纳米制剂， 其粒径在20nm-200nm之间， 可用于尾静脉注射， 被动浓集在肿瘤部位， 提高药 物药效， 减少毒副作用。 2.根据权利要求1所述的聚合物载体材料， 低分子量肝素的分子量在。
4、1000-10000之间。 3.根据权利要求1所述的聚合物载体材料， 胆固醇的修饰率在3-20之间。 4.根据权利要求1所述的聚合物载体材料， 胆固醇通过连接臂修饰至低分子量肝素， 连 接臂的末端可以为氨基、 酯键或腙键， 连接臂结构为烷基链。 5.根据权利要求1所述的纳米制剂， 包载的抗肿瘤药物可为阿霉素、 表阿霉素、 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 顺铂、 甲氨蝶呤、 阿糖胞苷、 吉西他滨、 喜树碱、 丝裂霉素、 5-氟脱氧尿苷、 斑蝥 素等。 6.根据权利要求1所述的纳米胶束制剂， 其特征在于， 采用透析法制备载药的纳米胶 束， 包封率在50-99之间， 载药量在5wt-20wt之间。 7.根据。
5、权利要求1所述的纳米胶束制剂， 其特征在于， 溶媒可以为纯水、 缓冲溶液、 体 液、 组织培养液或其他不以有机溶剂为主体的溶剂介质。 8.一种如权利要求1-7之一所述的胆固醇-低分子量肝素负载抗肿瘤药物的纳米胶束 制剂的制备其制备方法选自下列之一： (1)先配制聚合物材料的水溶液， 在搅拌下逐滴加入一定量的抗肿瘤药物溶液， 然后探 头超声30min， 再转入透析袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏水， 得到载药纳米胶束制剂。 冷 冻干燥后储存备用， 使用前复溶、 体内注射； (2)用有机溶媒溶解聚合物和抗肿瘤药物， 然后旋转蒸发除去有机溶剂， 再加入蒸馏水 搅拌复溶， 探头超声30min再转透析。
6、袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏水， 得到载药纳米胶 束制剂， 冷冻干燥后储存备用， 使用前复溶、 体内注射； (3)用有机溶媒溶解聚合物和抗肿瘤药物， 再转入透析袋中透析48小时， 透析介质为蒸 馏水， 得到载药纳米胶束制剂， 冷冻干燥后储存备用， 使用前复溶、 体内注射。 9.一种如权利要求1-8之一所述的胆固醇-低分子量肝素负载阿霉素的纳米胶束制剂 的应用， 其特征在于， 所述纳米胶束在提高抗肿瘤药物抗癌效果的同时， 发挥低分子量肝素 的抗转移活性， 为原发性肿瘤、 转移性肿瘤及术后防复发的治疗提供更好的选择。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108451906 A 2 一种。
7、用于抗肿瘤和抗转移治疗的胆固醇-低分子量肝素的纳 米制剂及制备方法 技术领域 0001 本发明属药物技术领域， 具体涉及一种以胆固醇为疏水内核， 低分子量肝素为亲 水外壳并包载抗肿瘤药物的纳米胶束及其制备方法。 背景技术 0002 肿瘤转移现已成为癌症病人死亡的重要原因之一。 肿瘤细胞转移是一个复杂的多 步骤级联过程， 一般包括以下几个连续的步骤： 最初的原发性肿瘤细胞获得基因表型的改 变后， 获得转移潜能从肿瘤组织中脱离， 通过血管壁屏障后， 外渗进入邻近血管， 在血液循 环的帮助下侵入其它组织和器官， 进而在次级组织器官形成新转移灶。 阻断上述步骤中任 意一步均可能抑制肿瘤转移。 目前， 。
8、利用新型的纳米药物递送系统解决肿瘤转移的难题已 经成为如今重要的研究方向。 0003 纳米胶束是在水中自组装形成的两亲性嵌段共聚物的一种热力学稳定性的胶体 溶液， 其具有纳米级粒径及球形核壳结构。 纳米胶束具有许多独特的优点， 因此作为一种递 药系统呈现出广阔的应用前景。 0004 目前对于纳米药物递送系统的药物载体的设计， 不仅需对药物有优良的包载能 力、 可实现药物控制释放并具有一定靶向性等， 更强调载体的生物相容性和生物可降解性， 以保证载体进去体内无毒、 无免疫原性。 天然多糖类材料如透明质酸、 壳聚糖和肝素等因其 优良的无毒、 无免疫原型而应用于药物载体的设计中。 在众多的天然多糖类。
9、材料中， 肝素因 其独特的抗转移活性而受到研究者们广泛关注， 因为肝素可以干扰肿瘤转移过程中的多种 通路， 例如： 抑制肿瘤转移相关酶(乙酰肝素酶)的活性； 抑制粘附因子介导的细胞粘附； 抑 制肿瘤新生血管生成； 抑制血小板介导的上皮细胞向间质细胞转化等。 由于肝素链中特定 的五糖序列能够识别并结合体内抗凝血酶， 自20世纪30年代以来， 肝素一直作为抗凝剂在 临床上使用， 造成使用肝素发挥抗转移活性时易产生出血、 血小板减少等副作用， 从而极大 地限制了肝素的临床应用。 研究人员因此开发了低分子量肝素(low molecular weight heparin， LMWH)， 它由肝素酶解而得。
10、， 其分子量较低， 一般为40007000。 相比肝素， LMWH具 有口服易吸收、 生物利用度高、 体内半衰期长、 出血倾向小同时甚至表现出更好的抗血管生 成、 抗肿瘤转移等活性， 从而受到研究者们的广泛青睐。 0005 乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一， 其发病率在大城市稳居女性恶性肿 瘤前列。 尽管近年来诊疗技术有所提高， 但仍有大多数或者死于复发和转移。 化疗药物已被 广泛用于抗肿瘤的治疗， 主要是基于它们破坏快速生长的癌细胞的能力。 然而， 化疗的范围 和效率是极为有限的。 由于化疗药物毒性较大， 长期服用会产生不可逆心肌病变、 骨髓抑 制、 白细胞和血小板减少等严重不良反应。。
11、 为了克服化疗药物的临床限制， 近年来研究者们 借助纳米载体负载抗肿瘤药物， 改变其生物分布， 达到减毒增效的目的。 0006 基于以上背景， 将胆固醇接枝到低分子量肝素上， 将具有优异生物相容性的胆固 醇作为疏水片段和疏水药物储库， 包载抗肿瘤药物， 外壳为具有抗转移活性的亲水性LMWH， 说 明 书 1/5 页 3 CN 108451906 A 3 制备一种高生物相容性的新型纳米制剂， 在抗肿瘤的同时实现抗肿瘤转移的双重作用。 胆 固醇是体内生物膜的重要组成部分， 而LMWH是临床上经常使用的多糖类药物， 二者均具有 高生物相容性、 无毒无免疫原性和生物可降解性， 采用胆固醇-LMWH纳米。
12、胶束作为药物载体 包载抗肿瘤药物， 不仅可以利用胆固醇的强疏水结构实现高效包载， 而且可以借助LMWH亲 水外壳实现长循环， 延长抗肿瘤药物和LMWH的半衰期。 另外， 利用疏水片段对肝素上的羧基 进行修饰， 拟降低其抗凝血， 减小患者用药时的出血风险。 该药物递送系统可以用于治疗乳 腺癌及其肺转移， 实现高效能、 低毒性的治疗效果。 发明内容 0007 本发明目的在于提出一种药物载体材料为胆固醇修饰的低分子量肝素衍生物， 在 水性条件下， 形成以低分子量肝素为亲水外壳、 胆固醇为疏水内核的纳米胶束， 可包载抗癌 药物， 在化疗药物发挥抗肿瘤作用的同时发挥低分子量肝素的抗转移活性。 0008 。
13、本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 其粒径在20nm-200nm之间， 可用于尾静脉注 射， 被动浓集在肿瘤部位， 提高药物效果， 减少毒副作用。 0009 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 聚合物载体材料的低分子量肝素的分子量 在1000-10000之间。 0010 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 聚合物载体材料的胆固醇的修饰率在3- 20之间。 0011 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 聚合物载体材料中的胆固醇通过连接臂修 饰至低分子量肝素， 连接臂的末端可以为氨基、 酯键或腙键， 连接臂结构为烷基链。 0012 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 包载的抗肿瘤药物可为。
14、阿霉素、 表阿霉素、 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 顺铂、 甲氨蝶呤、 阿糖胞苷、 吉西他滨、 喜树碱、 丝裂霉素、 5-氟脱氧尿 苷、 斑蝥素等。 0013 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 采用透析法制备载药的纳米胶束。 包封率在 50-99之间， 载药量在5wt-20wt之间。 0014 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 溶媒可以为纯水、 缓冲溶液、 体液、 组织培养 液或其他不以有机溶剂为主体的溶剂介质。 0015 本发明纳米胶束制剂的制备方法选自下列之一： 0016 (1)先配制聚合物材料的水溶液， 在搅拌下逐滴加入一定量的抗肿瘤药物溶液， 然 后探头超声30min， 再转入透析袋。
15、中透析24小时， 透析介质为蒸馏水， 得到载药纳米胶束制 剂。 冷冻干燥后储存备用。 使用前复溶、 体内注射； 0017 (2)用有机溶媒溶解聚合物和抗肿瘤药物， 然后旋转蒸发除去有机溶剂， 再加入蒸 馏水搅拌复溶， 探头超声30min再转入透析袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏水， 得到载药 纳米胶束制剂。 冷冻干燥后储存备用。 使用前复溶、 体内注射； 0018 (3)用有机溶媒溶解聚合物和抗肿瘤药物， 再转入透析袋中透析48小时， 透析介质 为蒸馏水， 得到载药纳米胶束制剂。 冷冻干燥后储存备用。 使用前复溶、 体内注射； 0019 本发明的纳米胶束制剂， 其特征在于， 所述纳米胶束在提。
16、高抗肿瘤药物抗癌效果 的同时， 发挥低分子量肝素的抗转移活性， 为原发性肿瘤、 转移性肿瘤及术后防复发的治疗 提供更好的选择。 说 明 书 2/5 页 4 CN 108451906 A 4 附图说明 0020 图1.纳米胶束在细胞内发挥抗肿瘤和抗转移活性图例。 0021 图2.胆固醇-低分子量肝素衍生物的合成路线。 0022 图3.MTT法考察体外细胞毒性。 0023 图4.游离DOX和DOX/LHC大鼠体内血药浓度经时曲线。 0024 图5.评价肺转移的活体荧光图像。 具体实施方式 0025 实施例1 0026 2.3g胆固醇氯甲酸酯(Chol， 5mmol)溶于50mL无水二氯甲烷中， 在。
17、氮气和冰浴条件 下， 将上述溶液缓慢滴加至6.7mL(100mmol)乙二胺和0.7mL(5mmol)三乙胺混合溶液中， 继 续反应10h。 反应结束后， 过滤除去沉淀， 滤液用去离子水洗三次， 加入无水硫酸镁干燥并过 滤， 滤液减压干燥过夜， 得到连接臂为乙二胺的白色固体胆固醇-乙二胺。 0027 实施例2 0028 2.3g胆固醇氯甲酸酯(Chol， 5mmol)溶于50mL无水二氯甲烷中， 在氮气和冰浴条件 下， 将上述溶液缓慢滴加至100mmol胱胺二盐酸盐和0.7mL(5mmol)三乙胺混合溶液中， 继续 反应10h。 反应结束后， 过滤除去沉淀， 滤液用去离子水洗三次， 加入无水硫。
18、酸镁干燥并过 滤， 滤液减压干燥过夜， 得到连接臂为胱胺的白色固体胆固醇-胱胺。 0029 实施例3 0030 精密称取100mg(0.25mmol)分子量为1000的低分子量肝素于圆底烧瓶中， 加入 10mL甲酰胺， 50油浴加热磁力搅拌使其溶解， 冷却至室温后加入143.8mg(0.8mmol)碳二 亚胺盐酸盐(EDC)和101.6mg(0.8mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)搅拌15min， 然后加入胆固 醇-乙二胺或胆固醇-胱胺或(0.05mmol)室温搅拌反应24h。 转移至透析袋水中透析48h， 透 析介质依次为DMF和蒸馏水。 冷冻干燥得到白色疏松固体粉末为胆固醇-低分子量肝。
19、素接枝 共聚物， 反应步骤如图2。 使用硫酸铁铵比色法测定胆固醇取代度为20.0。 0031 实施例4 0032 精密称取100mg(0.25mmol)分子量为4500的低分子量肝素于圆底烧瓶中， 加入 10mL甲酰胺， 50油浴加热磁力搅拌使其溶解， 冷却至室温后加入143.8mg(0.8mmol)碳二 亚胺盐酸盐(EDC)和101.6mg(0.8mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)搅拌15min， 然后加入胆固 醇-乙二胺(0.1mmol)室温搅拌反应24h。 转移至透析袋水中透析48h， 透析介质依次为DMF和 蒸馏水。 冷冻干燥得到白色疏松固体粉末为胆固醇-低分子量肝素接枝共聚物， 。
20、反应步骤如 图2。 使用硫酸铁铵比色法测定胆固醇取代度为7.8。 0033 实施例5 0034 精密称取100mg(0.25mmol)分子量为10000的低分子量肝素于圆底烧瓶中， 加入 10mL甲酰胺， 50油浴加热磁力搅拌使其溶解， 冷却至室温后加入143.8mg(0.8mmol)碳二 亚胺盐酸盐(EDC)和101.6mg(0.8mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)搅拌15min， 然后加入胆固 醇-乙二胺(0.3mmol)室温搅拌反应24h。 转移至透析袋水中透析48h， 透析介质依次为DMF和 蒸馏水。 冷冻干燥得到白色疏松固体粉末为胆固醇-低分子量肝素接枝共聚物， 反应步骤如 说 。
21、明 书 3/5 页 5 CN 108451906 A 5 图2。 使用硫酸铁铵比色法测定胆固醇取代度为3.1。 0035 实施例6 0036 先配制10mg/mL聚合物材料的水溶液5mL， 在搅拌下逐滴加入0.3mL的10mg/mL的阿 霉素(DOX)药物溶液， 然后探头超声30min， 再转入透析袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏 水， 得到载药纳米胶束制剂。 0028 用DMSO将载药纳米粒稀释至适宜浓度， 利用紫外分光光度计测定样品在482nm处 的吸光度值， 并计算出聚合物中DOX的质量， 根据公式： 计算载药量为5.0wt。 0037 实施例7 0038 先配制10mg/mL聚合物材。
22、料的水溶液5mL， 在搅拌下逐滴加入0.75mL的10mg/mL的 阿霉素(DOX)药物溶液， 然后探头超声30min， 再转入透析袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏 水， 得到载药纳米胶束制剂。 0039 用DMSO将载药纳米粒稀释至适宜浓度， 利用紫外分光光度计测定样品在482nm处 的吸光度值， 并计算出聚合物中DOX的质量， 根据公式： 计算载药量为12wt。 0040 实施例8 0041 先配制10mg/mL聚合物材料的水溶液5mL， 在搅拌下逐滴加入1.5mL的10mg/mL的阿 霉素(DOX)药物溶液， 然后探头超声30min， 再转入透析袋中透析24小时， 透析介质为蒸馏 水，。
23、 得到载药纳米胶束制剂。 0042 用DMSO将载药纳米粒稀释至适宜浓度， 利用紫外分光光度计测定样品在482nm处 的吸光度值， 并计算出聚合物中DOX的质量， 根据公式： 计算载药量为19.8wt。 0043 实施例9 0044 使用有机溶媒配置10mg/mL聚合物材料5mL， 并加入5mg的喜树碱， 然后旋转蒸发除 去有机溶剂， 再加入蒸馏水搅拌复溶， 然后探头超声30min， 再转入透析袋中透析24小时， 透 析介质为蒸馏水， 得到载药纳米胶束制剂。 0045 用DMSO将载药纳米粒稀释至适宜浓度， 利用紫外分光光度计测定样品的吸光度 值， 并计算出聚合物中喜树碱的质量， 根据公式：计。
24、算 载药量为5wt。 0046 实施例10 0047 使用有机溶媒配置10mg/mL聚合物材料5mL， 并加入10mg的紫杉醇， 再转入透析袋 中透析48小时， 透析介质为蒸馏水， 得到载药纳米胶束制剂。 0048 用DMSO将载药纳米粒稀释至适宜浓度， 利用紫外分光光度计测定样品的吸光度 值， 并计算出聚合物中紫杉醇的质量， 根据公式：计算 载药量为8wt。 说 明 书 4/5 页 6 CN 108451906 A 6 0049 实施例11 0050 去对数生长期的4T-1细胞悬液， 按1104个/孔浓度接种于96孔细胞培养板中， 过 夜生长。 吸弃培养基， 加入系列浓度的游离DOX和DOX。
25、/LHC， 分别培养24h和48h。 培养结束后 吸弃培养基加入100 L培养基和20 L MTT溶液， 继续培养4h。 最后吸弃培养基后加入150 L 的DMSO， 用酶标仪在491nm波长下测吸光度， 按以下公式计算细胞存活率， 如图3。 0051 实施例12 0052 SD大鼠6只， 随机分成2组， 每组3只。 称重后分别尾静脉注射游离DOX和DOX/LHC溶 液， 给药剂量为2.5mg DOX/kg。 给药后分别于0.08、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24h于眼后静 脉丛取血0.5mL左右， 装于肝素化的离心管中。 全血离心(1500rpm， 10mi。
26、n)分离血浆。 于激发 波长494nm， 发射波长587nm处测量样品荧光强度， 绘制大鼠体内血药浓度经时曲线如图4， 并计算得到主要药动学参数。 表1尾静脉注射后DOX的药动学参数(n3) 0053 实施例13 0054 40只Balb/c小鼠尾静脉接种浓度为5105个/只的4T1-Luc细胞悬液建立乳腺癌 肺转移模型。 12h后， 将小鼠分为5组， 每组8只， 分别尾静脉注射生理盐水、 游离肝素、 空白纳 米胶束LHC、 游离DOX和DOX/LHC溶液(DOX5mg/kg， LMWH 20mg/kg)， 每三天给药一次， 分别在 第11天和第17天用活体成像仪采集照片， 观察肺转移情况， 如图5。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108451906 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 108451906 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 108451906 A 9 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 108451906 A 10 。