技术领域
本发明属于医药领域，涉及β-As4S4在制备用于治疗血液系统恶性肿瘤的药物中的用途。
背景技术
雄黄是传统矿物药，始载于《神农本草经》，列为中品。中医临床常用于治疗痈肿疔疮，虫积腹痛等症，近年雄黄及其复方制剂用于治疗急性粒细胞性白血病取得了很好的效果。
研究发现雄黄的晶型共有四种：α-As4S4、β-As4S4、χ-As4S4和拟雄黄(pararealgar)。采用拉曼光谱和X射线衍射法，结合文献研究判定，湖南石门雄黄矿所产雄黄为α构型，以该矿矿石为基源的我国药用雄黄的晶体结构为α-As4S4(张志杰等人，光谱学与光谱分析，2011年2月，第31卷第2期第291-296页)。也就是说，目前仅局限于天然雄黄类物质-天然硫化砷化合物(如α-As4S4)的应用。众所周知，天然雄黄难溶甚至不溶于水，不溶于常见稀酸(仅可溶于浓硝酸)，难溶于稀碱，使雄黄用于临床时生物利用度极低；天然雄黄加工、使用方法不同，用量差异极大，给临床带来风险。
2000年前后兴起雄黄纳米微粒(宁凝等人，中国中药杂志，2005年1月，第30卷第2期第136-140页)。但是，由于制备难度大，雄黄纳米微粒尚难以应用于临床。其他新兴制备技术，尚处于探索阶段(张景红等人，中华中医药杂志，2010年8月，第25卷第8期，第1321-1323页)。因此，有必要研究雄黄的其他晶型，以克服天然雄黄存在的问题。
固体溶出是一个固-液界面反应，硫化砷的溶出过程是一个多相反应，其中包含的可能步骤有：
(1)溶剂对硫化砷颗粒的润湿；
(2)As4S4的溶剂化；
(3)As4S4溶剂化产物扩散进入溶剂中；
(4)溶剂化产物的进一步变化。
硫化砷的溶出过程的示意图见图1。
然而，天然雄黄分子间有较强的范德华力，使(1)溶剂对硫化砷颗粒的润湿及(2)As4S4的溶剂化都非常困难，天然雄黄在水中尤其难以润湿，以致天然雄黄在水及绝大部分水溶液呈现强烈的粉末团聚。
β-As4S4具有与α-As4S4相同的分子结构，但由于空间堆积方式的不同，形成C2/c空间群。β型空间结构中，As4S4分子间的范德华力远远小于其在α型中，使上述溶出步骤中(1)溶剂对硫化砷颗粒的润湿；及(2)As4S4的溶剂化的难度大大降低，从而使β-As4S4在水及水溶液中的溶出速率及溶出度都大大增加(E.J.Porter,and G.M.Sheldrick.J.Chem.Soc.,Dalton Trans.,1972,1347-1349)。
β-As4S4有3种来源:①将纯砷和纯硫按照1∶1物质的量比混合后加热,当温度控制在252～306℃时,单质砷和单质硫和化合产物；②将原矿雄黄(α-As4S4)加热,温度控制在295℃,持续加热约24小时后,冷却到室温所得到产物；③将拟雄黄(pararealgar)加热，温度控制在220～230℃,持续加热约5分钟后所得到产物(关君等人，北京中医药大学学报，2010年9月，第33卷第9期，第623-627)。
然而，在现有技术中，没有使用β-As4S4治疗血液系统恶性肿瘤的报道。
发明内容
发明人经过一系列研究发现，作为一种高温晶型，β-As4S4在纯水、人工胃液、人工肠液中的溶出速率及溶解度都显著高于天然雄黄。进一步研究发现，相比于天然雄黄，β-As4S4对血液系统恶性肿瘤细胞的诱导凋亡效果更好。
因此，本发明的目的是β-As4S4在制备用于治疗血液系统恶性肿瘤的药物中的用途。
β-As4S4的晶体结构：单斜晶系；环状分子型结构；空间群C2/c(15)；a0＝9.95700nm，b0＝9.33500nm，c0＝8.88900nm，β＝102.380。
在本文中，所述血液系统恶性肿瘤选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓增生异常综合征、难治性贫血伴幼稚细胞增多和在转化为白血病过程中的难治性贫血。
所述白血病选自急性成淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞B-细胞白血病、急性成淋巴细胞T-细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性原始粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性成单核细胞白血病、急性红白血病性白血病、急性成巨核细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和慢性粒-单细胞性白血病。优选地，所述白血病选自急性早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病。
所述淋巴瘤选自重度淋巴瘤、中度淋巴瘤和轻度淋巴瘤。优选地，所述淋巴瘤选自非何杰金氏病淋巴瘤。
β-As4S4的有效剂量根据许多参数，例如所选择的施用途径、所治疗受试者的体重、年龄、性别和敏感性而变化。因此，最佳剂量应该由相关专科医生根据其所认为的相关参数来确定。尽管有效剂量可以在很大比例上变化，但是对于平均体重70kg的成年人，一次或多次剂量的日剂量可以在每24小时0.1mg至2000mg之间变化，并且优选在1至500mg之间变化。
在本发明中，术语“药学上可接受的”指当被施用于人时分子实体和组合物不产生任何不良反应或变态反应或任何其它不需要的反应。当在本文中使用时，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”包括任何稀释剂、佐剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、抗菌剂或抗真菌剂、或允许延迟吸收以及肠的和消化的再吸收的试剂。这些介质或载体的使用是本领域技术人员所熟知的。
β-As4S4可以与一种或多种其它活性剂如抗癌剂一起施用，或者与放射治疗或外科治疗联合，或者与放射治疗和外科治疗组合。施用可以是与其它治疗同时的、分开的或交错的。所述抗癌剂选自顺铂、紫杉酚、紫杉醇、春花碱、长春新碱、长春瑞滨、喜树碱、表鬼臼毒素、秋水仙碱和5-氟尿嘧啶。
β-As4S4可以施用于人类。可以通过经口、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、局部、直肠或鼻腔内途径施用含有β-As4S4的药物组合物。在这种情况下，可以单一剂型(与常规药学载体混合)向人类施用活性成分。合适的单一剂型包括口服形式如片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂和口服溶液或混悬剂、舌下和口腔剂型、皮下或经皮、外部、肌肉内、静脉内、鼻腔内或眼内剂型、直肠剂型。
当制备片剂形式的固体组合物时，将主要活性成分与药学载体混合，例如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯胶、二氧化硅或等价物。可以用蔗糖或其它合适的材料将片剂包衣，或可以处理片剂以使其具有持续的或延缓的活性并且不断地释放预定量的活性成分。
通过将活性成分与稀释剂混合并将获得的混合物倒入软或硬胶囊中获得胶囊制剂。
糖浆或酏剂形式的制剂可以含有活性成分连同甜味剂、防腐剂以及提供香味的试剂和合适的着色剂。
水可分散性粉末剂或颗粒剂可以含有与分散剂或湿润剂、或混悬剂、以及香味物质或甜味剂混合的活性成分。
对于直肠施用，使用栓剂，其用在直肠温度熔化的粘合剂，例如可可油或聚乙二醇制得。
对于肠道外(静脉内、肌肉内、皮内、皮下)、鼻腔内或眼内施用，使用含有药学上相容的分散剂和/或湿润剂的水性混悬液、等渗盐水溶液或无菌和可注射溶液。
还可以将活性成分任选与一种或多种添加载体一起制成微囊形式。
有利地，根据本发明的药物组合物旨在经口或局部施用。
将通过以下附图和实施例进一步阐明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式被理解为限制本发明的范围。
附图说明
图1是硫化砷的溶出过程的示意图。
图2显示β-As4S4的X衍射粉末衍射图谱。
图3显示天然雄黄与水的接触角。
图4显示β-As4S4与水的接触角。
图5显示天然雄黄在人工胃液、人工肠液、纯水中溶出的时间-浓度曲线。
图6显示β-As4S4在人工胃液、人工肠液、纯水中溶出的时间-浓度曲线。
具体实施方式
实施例中使用的天然雄黄的来源购自郑州瑞龙药业股份有限公司；β-As4S4按照E.J.Porter,and G.M.Sheldrick.J.Chem.Soc.,Dalton Trans.,1972,1347-1349公开的方法制备得到。
本发明使用的β-As4S4晶体结构为：单斜晶系；环状分子型结构；空间群C2/c(15)；a0＝9.95700nm，b0＝9.33500nm，c0＝8.88900nm，β＝102.380。
实施例1：β-As4S4晶体样品的鉴定
1、检测仪器：Bruker粉末X射线衍射仪，型号：D8Advance。
2、仪器主要工作参数：
Cu靶，K辐射，40kV,40mA,RS狭缝:3mm，扫描范围：5°-80°，扫描方式：连续扫描，数据间隔：0.02°，记数时间：0.1秒/步。
3、检测结果：见图2。
上面为样品的实测X射线衍射谱，下面为JCPDS谱图库(PDF2)中β-As4S4的标准图谱(卡片号：01-088-1657)，样品的实测X射线衍射谱图上的主要衍射峰与PDF2中β-As4S4的标准谱图(卡片号：01-088-1657)吻合得很好，证明样品中主要晶相成分为As4S4(硫化砷)(注：在17.002°、20.600°有杂质峰)。
实施例2：润湿性
润湿性是指某一固体易于与某一流体而非其他流体接触的倾向性。通常情况下可被界定为固体界面由固-气界面转变为固-液界面的现象。润湿性是由固体最外层的结构决定的，是其固有特性之一。
1、检测仪器：高速视频光学接触角测量仪：OCAH 200，德国Dataphysics公司。
2、测试方法：将雄黄细粉(200目)压制成表面光滑、直径1cm的圆片，置于载物台上，用针头缓慢挤出液体滴于圆片上，通过高速相机拍摄液滴与圆片接触的过程，记录并测量液体与圆片的接触角。拍摄速度200帧/min。
3、测试结果：天然雄黄粉与水的接触角为133°，属于不润湿的样品(接触角θ＞90°)，强疏水的雄黄微粒不易润湿，是硫化砷溶出的限速反应步骤。结果见图3。
β-As4S4与水的接触角为87°，为可润湿样品(接触角θ＜90°)，结果见图4。
由此可见，β-As4S4对水可润湿，润湿性优于天然雄黄。
实施例3：溶出性
1、ICP-AES：美国VARIN公司，型号：VISTA-MPX，
2、分析条件：RF，功率：1.15kw，冷却气流量：15L/min，雾化器气体流量：0.75L/min，观测高度：12mm，辅助气气体流量：1.5L/min。
3、结果：
天然雄黄：见表1和图5。
表1：天然雄黄在
人工胃液、人工肠液、纯水中溶出的时间-浓度数据
β-As4S4样品：见表2和图6。
表2：β-As4S4在
人工胃液、人工肠液、纯水中溶出的时间-浓度数据
由此可见，β-As4S4在纯水、人工胃肠液中的溶出速率高于天然雄黄，溶出量大于人工雄黄。以在人工胃液中的溶出为例，计算β-As4S4的在每升人工胃液中的总体溶出速率为0.014mg/min，天然雄黄在每升人工胃液中的总体溶出速率为0.0085mg/min。
实施例4：质量
测定β-As4S4三个样品的总砷及可溶性砷。
检测方法：
1、检测仪器：ICP-AES：美国VARIN公司，型号：VISTA-MPX，
2、检测条件：RF，功率：1.15kw，冷却气流量：15L/min，雾化器气体流量：0.75L/min，观测高度：12mm，辅助气气体流量：1.5L/min。
3、结果：实测数据：1号、2号、3号样品的总砷含量分别为69.36％，69.92％，69.12％，平均值为69.47％。
三个样品中可溶性砷含量分别为实测数据为：0.029％，0.036％，0.039％，平均值为0.035％，即0.35mg/g。
结论：砷的相对原子量74.92159，硫的相对原子量32.066，化合物As4S4中砷元素的理论值含量为70.028％。β-As4S4总砷的测定平均值与As4S4总砷理论值之比则可换算成纯度，即β-As4S4样品纯度按砷元素计为99.20％。
由此可见，β-As4S4质量稳定可控，硫化砷含量≥99％，可溶性砷含量≤2mg/g。
实施例5：抗肿瘤活性
分别采用NB4细胞株和HL-60细胞株，对天然雄黄和β-As4S4的1号样品进行流式细胞分析术活性验证实验，检测不同样品对肿瘤细胞诱导肿瘤细胞凋亡的情况，测定不同样品的量效曲线。
1、实验仪器
美国Becton Dickinson公司流式细胞分析仪，型号BD Calibur，PI单染，激发光波长488nm，发射光波长635nm，分析细胞20000个。
2、样品与实验方法
细胞培养：HL-60细胞(中国医学科学院基础研究所提供)，NB4细胞株(美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)提供)，1640培养基(含10％胎牛血清)36.5±0.5℃，5％CO2、饱和湿度培养箱内常规传代培养。
样品：天然雄黄细粉(200目)及β-As4S4的1号样品(200目)，凉暗处保存。
样品液配制：分别精密称取天然雄黄细粉及β-As4S4的1号样品，精密加入已灭菌的培养基，配制成浓度为10mM的储备液，将1mL储备液→10mL(1mM)，1mM的准备液分别取0、20μL、40μL、80μL、160μL加入培养孔，使培养体系终体积2mL，使两种样品的终浓度分别为0、10μM、20μM、40μM、80μM。
流式细胞术测定凋亡率：分别取对数生长期的HL-60细胞、NB4细胞500r/m离心5m，按2×105的细胞浓度铺板，分别加入样品液，每浓度5孔重复，培养48小时，样品800转离心5分钟，分离上清液与细胞，将细胞以冷乙醇固定，4℃过夜，PBS洗涤，RNA酶消化，PI染色，流式细胞术测细胞周期和细胞凋亡情况。
3、实验结果：见表3和表4。
表3天然雄黄与β-As4S4对HL-60细胞周期中M期的影响(n＝5，(％))
0μM 10μM 20μM 40μM 80μM 对照组 1.87±0.21 天然雄黄 11.72±1.38 18.52±0.82 35.83±2.53 53.61±3.60 β-As4S4 56.25±1.99 85.48±1.72 / /
三个实验组间P值均小于0.01
表4天然雄黄与β-As4S4诱导NB4凋亡的比较(n＝5，(％))
0μM 10μM 20μM 40μM 80μM 对照组 3.83±0.10 天然雄黄 13.32±3.21 19.36±2.17 33.32±3.85 56.68±5.10 β-As4S4 54.26±4.0 68.27±3.01 76.10±5.01 83.55±5.47
各组之间的P值均小于0.01。
雄黄通过阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的机制，抑制肿瘤生长。通过空白对照实验，检测天然雄黄样品不同浓度及β-As4S4不同浓度样品的M1期细胞数，可知天然雄黄与β-As4S4样品均可显著干扰HL-60细胞的有丝分裂，从而使HL-60细胞阻滞于有丝分裂期。β-As4S4样品的活性较天然雄黄更强，10μM的β-As4S4阻滞HL-60细胞周期的活性与80μM天然雄黄的活性相当；天然雄黄及β-As4S4样品均可诱导NB4细胞凋亡，β-As4S4样品的活性较天然雄黄更强，20μM的β-As4S4诱导NB4细胞凋亡的活性与80μM天然雄黄的活性相当。
总之，相比于天然雄黄，β-As4S4质量稳定可控，对水可润湿，在纯水、人工胃液、人工肠液中的溶出速率及溶解度都显著提高，并且，β-As4S4对血液系统恶性肿瘤细胞的诱导凋亡效果更好。因此，β-As4S4可以开发为新的治疗血液系统恶性肿瘤的药物。