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1、10申请公布号CN104127860A43申请公布日20141105CN104127860A21申请号201410359606422申请日20140728A61K38/1720060171申请人山东中医药大学附属医院地址250011山东省济南市文化西路42号山东中医药大学附属医院72发明人李晓姜萍林海青74专利代理机构济南泉城专利商标事务所37218代理人李桂存54发明名称一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法57摘要本发明提供的一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，属于医疗模型技术领域，实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，。
2、对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。通过本发明方法建立的动物模型，特异性好，更好地拟合了临床发病实际，符合临床心理应激特点，操作简单、科学合理、建模时间短、创伤性小、动物死亡率低，能够实现在载体上评价冠脉微血管的功能，定性定量评价微血管痉挛的状态和程度，并且能够实时观测，为基础临床研究提供了新的研究手段，适合推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图2页10申请公布号CN104127860ACN104127860A1/1页21一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法。
3、，其特征在于，实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤包括猪双侧腹股沟部位，局部麻醉，钝性分离暴露双侧股动脉，穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔1H追加2000U；沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室；经右侧动脉鞘管将微导管定位在前降支中段，对冠状动脉造影显示前降支中段，3MIN内匀速注射含16NMOL神经肽Y的生理。
4、盐水神经肽Y注射剂10ML。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生理盐水神经肽Y注射剂，神经肽Y剂量优选6NMOL。4根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用1利多卡因局部麻醉。5根据权利要求2所述的方法，其特征在于，上述步骤中，分别在注射前、注射10分钟、注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定微血管容积、充填速率和微循环血流量，同时记录心电图变化及血流动力学指标。6根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生理盐水神经肽Y注射剂注射方法，采用MAVERICK整体交换球囊对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入PTCA导丝，再连接微量注射泵。7根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所。
5、述的血流动力学指标为左心室舒张末压、左室最大压力、左室最低压力和左室压力最大变化速率。8根据权利要求1所述的方法，其特征在于，模型评价方法为血流动力学监测和静脉心肌声学造影，数据分析采用SPSS统计软件包进行统计处理。权利要求书CN104127860A1/7页3一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法技术领域0001本发明属于医疗模型技术领域，涉及一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法。背景技术0002冠脉痉挛斑块破裂血栓形成急性冠脉事件，是目前冠心病发病的主要机理。冠状动脉痉挛（CAS）是指各种原因引起冠脉平滑肌节段或弥漫性痉挛性收缩,引起心肌缺血,甚至心肌坏死。在临床上，CAS不仅是变异性心。
6、绞痛的主要发病原因，而且与急性心肌梗死，恶性心律失常和心源性猝死的发病密切相关。近期研究表明，CAS不仅可以发生在冠状动脉有损害者，也可发生在冠状动脉正常者。即使大血管无明显狭窄，反复发生的微血管、小血管痉挛也可使近期和远期的心血管事件发生率和死亡率增加。因此，对冠脉系统中小血管和微血管痉挛的研究是非常必要的。0003目前关于冠状动脉微血管的研究与外周微循环研究相比，冠脉微循环研究明显滞后，与基础研究比,临床研究存在着很大差距CIRCULATION,1997,95522。因人体实验有许多局限性和不安全性,所以建立合适的CAS动物模型进行实验研究更有实际意义。目前应用于CAS研究的动物模型建模方。
7、法,包括药物刺激法（麦角新碱、乙酰胆碱、五羟色胺等）、内皮损伤法和外膜缠绕法等。目前临床应用较多的一类痉挛模型是内皮损伤法，这些模型大多是在不同种类动物如猴、猪、大鼠的血管中用机械性（主要为球囊内皮剥脱法）、化学性方法来造成血管局部炎症和非增生性损伤,并通过高胆固醇饮食等辅助手段造成局部血管收缩反应增强,使得血管造影中呈现出对诱导刺激剂的反应性收缩增强。但是，上述的这些模型作用部位多位于心外膜大血管，并不能特异性造成小、微血管痉挛，与临床心理应激等特点有一定差距，而且操作复杂、创伤性大、建模周期长，因此这些模型很难广泛应用于实验研究中。发明内容0004本发明的目的是针对上述现有技术存在的不足，。
8、提供一种符合临床心理应激特点的，特异性好、操作简单、科学合理、建模时间短，能够定性定量观察的冠状动脉微血管痉挛的动物模型建立方法。0005神经肽Y（NPY）在人体许多系统和器官中起着调节作用，尤其是在心血管系统中的作用已经得到公认。临床上，神经肽Y的大量释放可以引起特定的冠脉痉挛，从而引发一系列的心血管疾病，且神经肽Y对微循环血流减少的影响具有时效关系和量效关系。0006本发明即是在此理论基础上，采用药物刺激法，提供一种通过在小型猪冠脉内注射神经肽Y药物，造成微血管收缩痉挛，来建立用于此类疾病的动物模型的方法。本建模方法形成的时间快，10MIN内即可出现病发症状，通过控制NPC注射量可改变发病。
9、时间及症状表现，符合血管痉挛患者临床发病特点。0007本发明一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，技术方案为说明书CN104127860A2/7页4实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。00081本发明模型建立方法，其步骤为1）建模前动物处理猪禁食8H,备皮，测体重，肌肉注射氯胺酮10MG/KG诱导麻醉，气管插管，呼吸机辅助呼吸，连接心电图，在猪耳后大静脉处建立静脉通路，缓慢静脉推注3戊巴比妥钠5ML，以3L/MIN流量给氧，术中可追加戊巴比妥钠保持。
10、麻醉状态。00092）冠脉内注射生理盐水神经肽Y注射剂建立模型猪双侧腹股沟部位，局部麻醉，钝性分离暴露双侧股动脉，穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔1H追加2000U；沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室；经右侧动脉鞘管将微导管定位在前降支中段，对冠状动脉造影显示前降支中段，3MIN内匀速注射含16NMOL神经肽Y的生理盐水神经肽Y注射剂10ML。0010所述的生理盐水神经肽Y注射剂，神经肽Y剂量优选6NMOL。0011上述步骤2）中，采用1利多卡因局部麻醉。0012上述步骤2）中，所述的血流动力学。
11、指标为左心室舒张末压（LVEDP）、左室最大压力（LVPMAX）、左室最低压力（LVPMIN），左室压力最大变化速率（DP/DTMAX）等血流动力学指标。0013上述步骤2）中，分别在注射前、注射10分钟，注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定微血管容积、充填速率和MBF微循环血流量，同时记录心电图变化及血流动力学指标。0014所述的生理盐水神经肽Y注射剂注射方法，采用MAVERICK整体交换球囊（OVERTHEWIRE）对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入微导管，再连接微量注射泵。00152模型评价方法1）血流动力学监测左侧微导管连接压力换能器，记录血压、心率。连续测定左心室舒张末压（LVEDP。
12、）、左室最大压力（LVPMAX）、左室压力最大变化速率（DP/DTMAX）等血流动力学指标，分别在注射前、注射10分钟、30分钟时记录血压、心率、LVEDP、LVPMAX、DP/DTMAX。00162）静脉心肌声学造影（MCE）在猪的上肢静脉内注射声学造影剂，选取神经肽Y作用的冠脉相对应的供血的室壁为ROI（感兴趣区）。整个过程中，仪器操作和神经肽Y注射保持一致，分别在注射前、注射10分钟、30分钟，采用MCE测定、和MBF，观察相应节段感兴趣区室壁的血流量变化。0017手术完成后，对实验图像脱机分析，计算出ROI（感兴趣区）心肌造影剂的再灌注曲线Y1ET，其中为平台期强度，表示局部所有毛细血。
13、管横截面积之和，反映的是心肌局部微血管容积；为曲线上升斜率，反映心肌局部血流速度，两者乘积即代表心肌微循环血流量（MBF）。00183）统计学处理对所有数据由SPSS统计软件包进行统计处理。各组样本含量50，采用SHAPIROWILK法进行正态性检验，数据符合正态性，各组参数以XS表示。组内的比较采用单因素方差分析（ONEWAYANOVA）分析不同剂量和时间下各观察值的变化，如果组说明书CN104127860A3/7页5内方差分析有意义，则进一步采用LSD法进行组间比较，采用10MIN、30MIN与注射前指标的差值对各组间同一观察值进行比较，检验方法采用单因素方差分析。0019本发明提供的一种。
14、冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，其有益效果是1）本发明的模型建立方法，符合临床心理应激特点，操作简单、科学合理、建模时间短、创伤性小、动物死亡率低。00202）冠脉注射神经肽Y，可明显降低微血管容积和微循环血流量，冠状动脉微血管痉挛发生率高，神经肽Y对微循环血流减少的影响具有时效关系和量效关系，形成的时间快，10MIN内即可出现病发症状，30MIN后症状减弱，符合血管痉挛患者临床发病特点。00213）通过本发明方法建立的动物模型，特异性好，更好地拟合了临床发病实际，能够实现在载体上评价冠脉微血管的功能，定性定量评价微血管痉挛的状态和程度，并且能够实时观测，为基础临床研究提供了新的研究手段，。
15、适合推广应用。附图说明0022图1冠状动脉造影显示前降支。0023图2微导管定位在前降支中段图3神经肽注射前基础心肌声学造影图4神经肽注射后10分钟心肌声学造影图中图1猪尾导管在左心室，图2微导管尖端MARK在前降支中段。具体实施方式0024下面结合附图和实施例对本发明方法进行具体说明。0025材料与方法1、动物小型猪16头，月龄6月，体重2837KG，由中国农业科学院畜牧兽医研究所提供，动物合格证中国医学科学院阜外心血管病医院SYXK（京）20080016。00262、药品试剂与器材声诺维声学造影剂（六氟化硫微泡，SULPHURHEXAFLUORIDEMICROBUBBLESFORINJEC。
16、TION，BRACCOIMAGINGBV公司生产，上海博莱科信谊药业有限责任公司分包装），用自带溶剂，稀释5ML。0027神经肽Y（SIGMA公司，美国，PRODUCTNUMBERN3266，LOT037K4788）。0028心脏超声诊断仪，PHILIPS7500，S3探头（美国，菲利普公司）；声学造影分析软件（QLAB60分析软件，菲利普公司）；美国BIOPICMP150生理信号记录系统，血流动力学分析软件（CQKNOWLEDGE381版本）；血管数字减影仪（DSA，OEC9800，美国GE公司）；。00293、实施方式每组选取4头进行实验，为了消除手术操作熟练程度导致的误差，三个模型组同步。
17、进行。0030实施例11NMOL组选取上述小型猪4头，月龄6月，体重2837KG，含1NMOL神经肽Y的生理盐水神经肽Y注射剂10ML，具体步骤如下1）动物处理猪禁食8H，试验前前胸部及两侧股动脉处脱毛备皮，测量体重，肌肉注射氯胺酮10MG/说明书CN104127860A4/7页6KG诱导麻醉，气管插管，呼吸机辅助呼吸，连接心电图；在猪耳后大静脉处建立静脉通路，缓慢静脉推注3戊巴比妥钠5ML，以3L/MIN流量给氧。术中保持麻醉状态，每隔1H追加戊巴比妥钠2ML或视肢体运动情况给药。00312）冠脉内注射生理盐水与神经肽Y常规消毒铺巾，猪双侧腹股沟部位，用1利多卡因局部麻醉，钝性分离暴露双侧股。
18、动脉。穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔1H追加2000U；沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室，测定左心室舒张末压（LVEDP）、左室最大压力（LVPMAX）、左室最低压力（LVPMIN），左室压力最大变化速率（DP/DTMAX）等血流动力学指标；经右侧股动脉鞘管，对冠状动脉造影显示前降支中段，采用MAVERICK整体交换球囊（OVERTHEWIRE）对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入微导管，再连接微量注射泵，3MIN内匀速注射含1NMOL神经肽Y的生理盐水神经肽Y注射剂10ML，分别在注射前、注。
19、射10分钟，注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定微血管容积、充填速率和MBF微循环血流量，同时记录心电图变化及血流动力学指标。0032实施例23NMOL组选取上述小型猪4头，月龄6月，体重2837KG，含3NMOL神经肽Y的生理盐水神经肽Y注射剂10ML，步骤同实施例1。0033实施例36NMOL组选取上述小型猪4头，月龄6月，体重2837KG，含6NMOL神经肽Y的生理盐水神经肽Y注射剂10ML，步骤同实施例1。0034对比例生理盐水组选取上述小型猪4头，月龄6月，体重2837KG，生理盐水注射剂10ML，步骤同实施例1。00352本发明模型评价方法及结果分析评价方法1）血流动力学监测左侧猪。
20、尾导管连接压力换能器，记录血压、心率。采用美国BIOPICMP150生理信号记录系统，CQKNOWLEDGE381版本分析软件，连续测定左心室舒张末压（LVEDP）、左室最大压力（LVPMAX）、左室压力最大变化速率（DP/DTMAX）等血流动力学指标，分别在注射前、注射10分钟、30分钟时记录血压、心率、LVEDP、LVPMAX、DP/DTMAX。00362）静脉心肌声学造影（MCE）采用PHILIPS7500心脏超声诊断仪，探头频率为S3，采用实时灌注成像软件进行实时心肌声学造影MCE。在猪的上肢静脉内注射声诺维声学造影剂，每次注射2ML，先以弹丸式（BOLUS）快速推注1ML，再慢速推注。
21、1ML/MIN。选取神经肽Y作用的冠脉相对应的供血的室壁为ROI（感兴趣区）。整个过程中，仪器操作和神经肽Y注射保持一致，仪器设置保持不变，分别在注射前、注射10分钟、30分钟，采用MCE测定、和MBF,观察相应节段感兴趣区室壁的血流量变化。所有实验图像存储在MO磁光盘与SVHS高清晰度录像带中，采用菲利普公司的QLAB60分析软件以供脱机分析，该软件可计算出ROI（感兴趣区）心肌造影剂的再灌注曲线Y1ET,其中表示平台期强度，表示局部所有毛细血管横截面积之和，反映的是心肌局部微血管容积，为曲线上升斜率，反映心肌局部血流速度，两者乘说明书CN104127860A5/7页7积即代表心肌微循环血流。
22、量（MBF）。00373）统计学处理由SPSS统计软件包对所有数据进行统计处理。各组样本含量50，采用SHAPIROWILK法进行正态性检验，数据符合正态性，各组参数以XS表示。组内比较采用单因素方差分析（ONEWAYANOVA），分析不同剂量和时间下各观察值的变化，方差分析有意义进一步采用LSD法进行组间比较。采用10MIN、30MIN与注射前指标的差值对各组间同一观察值进行比较，检验方法采用单因素方差分析。0038结果分析1）心电图完成实验的动物心电图无明显变化。00392）血流动力学指标图1显示微导管定位于左心室，冠脉造影显示前降支的情况。图2中将微导管定位于前降支中段，在前降支注入生理。
23、盐水神经肽Y注射剂后，分别于注射前、注射10分钟，注射30分钟即刻计算血流动力学指标，如表1所示。0040表1冠脉注射神经肽Y前后血流动力学变化S与注射前比较P005由表1可见，实施例和对比例在注射10分钟，收缩压、舒张压、心率均有升高，30分钟后有所恢复。实施例3NMOL、6NMOL组的收缩压与对比例比较在10MIN有显著性差异（P005），6NMOL组在注射30MIN后仍有差异。LVEDP、LVPMAX没有明显变化（P005），3NMOL、6NMOL组10分钟左室压力最大变化速率（DP/DTMAX）下降（P005），30分钟后恢复正常，说明神经肽对心室收缩压力有轻度短暂影响。神经肽Y对猪的。
24、收缩压、舒张压和心率的影响较明显，而对LVEDP和LVPMAX几乎没有影响，可使DP/DTMAX有轻度短暂的下降，以上分析表明，通过本发明方法建立的模型，可有效模拟发病时的血流动力学指标，符合血管痉挛患者临床发病特点。其中，以实施例3神经肽Y注射量6NMOL组效果最佳。00413）声学造影图3和图4分别显示了注射前的基础心肌声学造影和注射后10MIN的心肌声学造影。说明书CN104127860A6/7页8在注射前、注射10分钟，注射30分钟，MCE方法测定代表微血管容积、代表充填速率和MBF反映微循环血流量，如表2所示。0042表2冠脉注射神经肽Y前后声学造影S组内与注射前比较在3MOL组注射。
25、10MIN和30MIN时，与注射前比较均有差异；MBF在6MOL组注射10MIN和30MIN，与注射前比较均有差异P005组内注射30MIN与10MIN比较在3MOL组，注射30MIN后与10MIN有差异P00510MIN、30MIN差值两组间比较6NMOL中微循环血流量较生理盐水组和1NMOL组有显著性差异P001由表2可见，实施例和对比例，注射前各组之间各指标比较均没有差异。1NMOL组注射前后，MCE各参数的变化没有显著性差异（P005）。3NMOL组10分钟、MBF均不同程度降低（P005），30分钟后、MBF均不同程度升高，、MBF没有恢复到基线值水平，其中仍有显著性差异（P005）。
26、。6NMOL模型组10分钟后、MBF均不同程度降低，其中、MBF有显著性差异（P005），30分钟后各参数值有所回升，其中MBF较注射前仍有差异（P005）。对实施例和对比例，10、30分钟时降低差值进行比较，实施例随着神经肽Y注射剂量增大、MBF差值增大，其中6NMOL组30分钟MBF差值较大，与对比例进行比较有显著性差异（P001）。可见神经肽Y可以引起MBF减少，并且具有量效和时效的关系，本发明中表现为各实施例在生理盐水神经肽Y注射剂注射后10分钟时MBF较注射前明显下降，注射30分钟后MBF有所回升。其中1NMOL组注射前后，各指标有升高和降低，但前后比较没有差异。3NMOL组微循环血。
27、流量前后比较，在10分钟有显著性差异，30分钟无显著性差异，6NMOL组模型组在10分钟和30分钟均有显著性差异。说明在大剂量时候，MBF恢复较慢。显示了神经肽Y导致微循环血流减少的时效关系和量效关系，通过控制NPC注射量可改变发病时间及症状，符合血管痉挛患者临床发病特点，以实施例3神经肽Y注射量6NMOL组效果最佳。说明书CN104127860A7/7页90043微血管容积和血流量的大小以及前后改变的差值，可以代表冠脉血管收缩痉挛的程度，血流恢复的时间和程度可以反映冠脉血管收缩痉挛的时间。本发明方法采用小剂量注射，在没有引起心电图变化的情况下，声学造影即显示血流量降低程度的差别，说明了本发明方法的敏感性，符合在临床上心电图难以捕捉和反映血管痉挛和心肌缺血的临床特点。本发明的冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，形成的时间快，10MIN内即可出现病发症状，符合血管痉挛患者临床发病特点，特异性好，更好地拟合了临床发病实际，能够从载体上评价冠脉微血管的功能，定性定量评价微血管痉挛的状态和程度，并且能够实时观测，为基础临床研究提供了新的研究手段，适合推广应用。说明书CN104127860A1/2页10图1图2图3说明书附图CN104127860A102/2页11图4说明书附图CN104127860A11。