MIR15B在制备糖尿病诊疗制剂中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103272248 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103272248 A *CN103272248A* (21)申请号 201310265245.2 (22)申请日 2013.06.28 A61K 48/00(2006.01) A61P 3/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 上海市内分泌代谢病研究所 地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路 197 号 (72)发明人 宁光 王卫庆 田景琰 赵红燕 洪洁 琚丽萍 (74)专利代理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 陈静 (54) 发明。

2、名称 miR-15b 在制备糖尿病诊疗制剂中的应用 (57) 摘要 本发明涉及 miR-15b 在制备糖尿病诊疗制剂 中的应用。首次揭示 miR-15b 或其上调剂能够促 进胰岛 细胞的胰岛素分泌， 进而防治 2 型糖尿 病 ； 并且， miR-15b还是2型糖尿病的预后标志物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103272248 A CN 103272248 A *CN103272248A* 1/1 。

3、页 2 1. 一种 miR-15b 或其上调剂在制备治疗 2 型糖尿病的药物中的用途。 2. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述的 miR-15b 的上调剂是 miR-15b 模拟 物。 3.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述的miR-15b模拟物的正义链核苷酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示， 反义链如 SEQ ID NO:5 所示。 4. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述的药物还用于 ： 下调 UCP2 表达 ； 上调 Foxo1 表达 ； 促进胰岛素分泌 ； 和 / 或 促进细胞内线粒体膜电位的回复。 5. 一种治疗 2 型糖尿病的药盒， 其。

4、中包括 ： miR-15b 或其上调剂。 6.miR-15b 的用途， 其特征在于， 用于作为 2 型糖尿病患者预后的标志物 ； 或用于制备 用于 2 型糖尿病患者预后的试剂。 7. 如权利要求 6 所述的用途， 其特征在于， 所述的 2 型糖尿病患者预后包括 ： 分析初诊 为 2 型糖尿病的患者在糖尿病治疗药物用药前后 miR-15b 的表达水平， 若 miR-15b 表达在 用药后显著高于用药前， 则其预后良好， 能长期停药 ； 反之， 若 miR-15b 表达在用药前后没 有显著性差异， 则其需长期服用糖尿病治疗药物。 8.如权利要求6所述的用途， 其特征在于， 所述的用于2型糖尿病患者。

5、预后的试剂是特 异性识别或扩增 miR-15b 的试剂。 9.一种特异性识别或扩增miR-15b的试剂在制备用于2型糖尿病患者预后的试剂盒中 的用途。 10. 如权利要求 9 所述的用途， 其特征在于， 所述的特异性扩增 miR-15b 的试剂是 SEQ ID NO:3 序列 ； 或 所述的特异性识别 miR-15b 的试剂是探针， 所述的探针特异性识别和结合 miR-15b。 权 利 要 求 书 CN 103272248 A 2 1/8 页 3 miR-15b 在制备糖尿病诊疗制剂中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域 ； 更具体地， 本发明涉及 miR-15b 在制备糖尿病诊。

6、疗制 剂中的应用。 背景技术 0002 糖尿病患病率在中国 20 岁以上人口为 9.7%， 中国目前患糖尿病的总人数已达到 9240 万， 其中新诊断的糖尿病患者占总数的 60%， 已成为严重的社会和公共健康问题。对新 诊断的 2 型糖尿病患者， 国内多家医疗机构多中心研究探索早期应用胰岛素泵强化治疗， 可以使部分患者停药后血糖长期保持在正常水平， 即达到常说的 “糖尿病的蜜月期” 。目前 认为口服药物和胰岛素治疗均可诱发部分 2 型糖尿病患者进入蜜月期， 胰岛素 1 相分泌的 恢复可能是其促发因素。 0003 采取饮食、 运动干预和相同的药物治疗方案， 有些患者能进入蜜月期， 达到临床缓 解。

7、， 停药后血糖长期保持正常 ； 有些患者则需要终身用药治疗， 其中的原因在哪里并不清 楚。目前尚未见到对新诊断 2 型糖尿病临床缓解的分子机制、 诊断和预后标志物的相关研 究和文献报道。 0004 Talchai等在2012年9月发表的Cell杂志上提出细胞在受到代谢应激后的主 要改变是去分化而非凋亡 Talchai C 等， Cell.2012 ； 150(6):1223-1234。在高血糖时体 内 FoxO1 活性丧失， 细胞发生去分化改变， 成为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞样细 胞， 表达内分泌祖细胞标志物 Neurogenin3、 Oct4、 L-Myc 等， 部分细胞甚至可以分泌胰。

8、高血 糖素。 0005 microRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA， 长约 20-25个核苷酸。 通过5 端的种子序列(seed sequence)与位于靶基因mRNA3端非翻译区 (UTR) 的互补靶点的不完全结合而发挥生物效应。microRNA 在物种进化中相当保守， 只在 特定的组织和发育阶段表达， 在细胞生长和发育过程中起多种调节作用。自 2008 年首次在 血清中发现microRNA以后， 大量研究证明microRNA可以广泛而稳定地存在于细胞外液， 包 括血清、 血浆和组织间液之中。 正常人血液循环中， 约有数百种microRNA称为Circul。

9、ating MicroRNA。它们不仅是细胞内基因转录和表达的调节分子， 还是细胞之间信息传递的信号 分子。 0006 因此， 本领域有必要研究人 microRNA 分子在体内发挥的作用， 寻找对于疾病具有 治疗作用的分子。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供 miR-15b 在制备糖尿病诊疗制剂中的应用。 0008 在本发明的第一方面， 提供一种 miR-15b 或其上调剂在制备治疗 2 型糖尿病的药 物中的用途。 0009 在一个优选例中， 所述的 miR-15b 的上调剂是 miR-15b 模拟物 (mimics)。 说 明 书 CN 103272248 A 3 2/8 页 4 0。

10、010 在另一优选例中， 所述的 miR-15b 模拟物的正义链核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所 示， 反义链如 SEQ ID NO:5 所示。 0011 在另一优选例中， 所述的药物还用于 ： 0012 下调 UCP2 表达 ； 0013 上调 Foxo1 表达 ； 0014 促进胰岛素分泌 ； 和 / 或 0015 促进细胞内线粒体膜电位的回复。 0016 在本发明的另一方面， 提供一种治疗 2 型糖尿病的药盒， 其中包括 ： miR-15b 或其 上调剂。 0017 在本发明的另一方面， 提供miR-15b的用途， 用于作为2型糖尿病患者预后的标志 物 ； 或用于制备用于 2 型。

11、糖尿病患者预后的试剂。 0018 在一个优选例中， 所述的 2 型糖尿病患者预后包括 ： 分析初诊为 2 型糖尿病的患 者在糖尿病治疗药物用药前后 ( 所述的用药后是指以糖尿病治疗药物治疗后达到相对稳 定的时间 ( 空腹血糖小于 7 且停药后与治疗前 “2h 胰岛素与 2h 血糖比率” 的比率大于 2) miR-15b的表达水平， 若miR-15b表达在用药后显著高于(较佳地高1.5倍 ； 更佳地高2倍 ； 更佳地高2.5倍)用药前， 则其预后良好， 能长期停药 ； 反之， 若miR-15b表达在用药前后没 有显著性差异， 则其需长期服用糖尿病治疗药物。 0019 在另一优选例中， 所述的用于。

12、 2 型糖尿病患者预后的试剂是特异性识别或扩增 miR-15b 的试剂。 0020 在本发明的另一方面， 提供一种特异性识别或扩增 miR-15b 的试剂在制备用于 2 型糖尿病患者预后的试剂盒中的用途。 0021 在 一 个 优 选 例 中，所 述 的 特 异 性 扩 增 miR-15b 的 试 剂 是 SEQ ID NO:3(tagcagcacatcatggtttaca) 序列 ； 或所述的特异性识别 miR-15b 的试剂是探针， 所述 的探针特异性识别和结合 miR-15b。 0022 本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明 0023 图。

13、 1、 3 例新诊断 2 型糖尿病临床缓解患者治疗前、 停药后发生改变的 microRNA 原 始信号值分析。 0024 图 2、 miR-15 的 qRT-PCR 分析， 6 例临床缓解患者停药后 miR-15 表达较治疗前增 加 (P- 值 0.01)。治疗后不能停药患者 miR-15 表达在治疗前后没有变化。 0025 图 3、 qRT-PCR 分析， 培液中加入胰岛素组的胰岛细胞和上清液中 miR-15b 的表达 分别是未加胰岛素组的 2.3 和 2 倍 (*P- 值 0.05)。 0026 图 4、 各组低糖和高糖时胰岛素的分泌。 0027 图 5A-D、 各组 JC-1 线粒体膜电。

14、位检测。 0028 图 6、 上调或下调 miR-15b 对 Min6 细胞 UCP-2 和 FoxO1 蛋白表达的影响。 0029 图7A-C、 构建UCP2psicheck-2双荧光素酶报告基因载体示意图(野生型和突变型 质粒结构图 )。 说 明 书 CN 103272248 A 4 3/8 页 5 0030 图 8、 Promega 双荧光素酶报告基因检测结果。 具体实施方式 0031 本发明人经过长期的研究， 发现 miR-15b 能够促进胰岛 细胞的胰岛素分泌， 进而可治疗糖尿病， 特别是 2 型糖尿病， 并且所述的 miR-15b 的上调剂也可用于防治糖尿 病。本发明人还发现， 在。

15、预后较好、 无需长期用药的患者中， miR-15b 发生显著上升， 因此， miR-15b 还是 2 型糖尿病的预后标志物。在此基础上完成了本发明。 0032 miR-15b 及其治疗用途 0033 本发明中， 所述的 miR-15b 是具有 SEQ ID NO:1 所示核酸序列的小核糖核酸 ： 0034 5 -UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA-3 (SEQ ID NO:1)。 0035 miR-15b 属于 miR-15/107 超家族成员， 在人类中该家族包括 miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-103 和 miR-107， 都具有相同的 AGCAGCA。

16、 序列。miR-15a/16-1 和 miR-15b/16-2 在大鼠、 小鼠、 恒河猴、 人类等哺乳动物中序列完全一致， 即存在高度保守性。 miR-15能通过 直接作用于靶蛋白 Bcl-2 对细胞凋亡产生影响。UCP2 与 FoxO1 一样， 都是多个与胰岛素分 泌相关的信号通路上的重要调节蛋白。 miR-15b与miR-15a和miR-107属于同一家族， 种子 序列相同。经 TargetScan、 miRanda 和 picTar 等多个数据库的靶基因预测分析发现 UCP2 和 neurogenin3 都是 miR-15b 的靶向基因。所以本发明人首先选取 miR-15b 进行后续功能。

17、 研究。 0036 miR-15b 可以被分离自细胞， 或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 miR-15b 或其前体的序列后， 本领域人员可以方便地制备获得 miR-15b 或其前体。 0037 基于本发明的阐述， miR-15b 是一个新的、 与胰岛素分泌密切相关的药物靶点， 其 藉由抑制 UCP2 蛋白表达， 上调 Foxo1 表达， 促进胰岛素分泌。针对 miR-15 的各种治疗手段 可以作为防治动物 ( 特别是人 ) 的 2 型糖尿病的新颖且有效的手段。 0038 并且， miR-15b 也可以用于作为药物筛选的靶点， 筛选通过提高 miR-15b 的表达或 活性而促进胰岛素分泌的。

18、药物。 0039 miR-15b 上调剂的治疗用途 0040 基于本发明人的新发现， 所述的 miR-15b 的上调剂可用于制备促进胰岛素分泌的 组合物。 0041 所述的miR-15b的上调剂是指任何可提高miR-15b或其前体的活性、 提高miR-15b 或其前体的稳定性、 上调miR-15b或其前体的表达、 增加miR-15b或其前体有效作用时间的 物质， 这些物质均可用于本发明， 作为对于上调 miR-15b 有用的物质， 从而可用于提高胰岛 素的分泌。 0042 作为本发明的优选方式， 所述的miR-15b上调剂是miR-15b的模拟物(mimics)， 其 具有与所述 miR-15。

19、b 相同的效果， 或者能够提高 miR-15b 的表达或活性。 0043 药物组合物 0044 本发明还提供了一种组合物， 它含有有效量 ( 如 0.000001-50wt% ； 较佳的 0.00001-20wt% ； 更佳的， 0.0001-10wt%) 的所述的 miR-15b 或其上调剂， 以及药学上可接受 的载体。所述的组合物可用于促进胰岛素分泌。 0045 如本文所用， 所述 “有效量” 是指可对人和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 说 明 书 CN 103272248 A 5 4/8 页 6 / 或动物所接受的量。所述 “药学上可接受的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各。

20、种赋 形剂和稀释剂。 该术语指这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没 有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的 载体可含有液体， 如水、 盐水、 缓冲液。另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质， 如填充 剂、 润滑剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染 试剂。 0046 在得知了所述 miR-15b 或其上调剂的用途后， 可以采用本领域熟知的多种方法来 将所述的 miR-15b 或其上调剂或它们的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于 ： 皮下 注射、 肌肉注射、 经皮给予、 局部给予。

21、、 植入、 缓释给予等。 0047 本发明所述的 miR-15b 或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的 严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确 定 ( 例如通过临床试验 )。所述的因素包括但不限于 ： 所述的 miR-15b 或其上调剂的药 代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰期等 ； 患者所要治疗的疾病的严重程度、 患者的 体重、 患者的免疫状况、 给药的途径等。通常， 当本发明的 miR-15b 或其上调剂每天以约 0.00001mg-50mg/kg 动物体重 ( 较佳的 0.0001mg-10mg/kg 动物体重 ) 的剂量给予， 。

22、能得到 令人满意的效果。例如， 由治疗状况的迫切要求， 可每天给予若干次分开的剂量， 或将剂量 按比例地减少。 0048 miR-15b 作为 2 型糖尿病预后的标志物 0049 miR-15b是一个新的、 与2型糖尿病的预后密切相关的靶点。 针对miR-15b的各种 检测试剂可以用于 2 型糖尿病的预后， 早期评估糖尿病治疗药物的疗效， 优化治疗方案。可 藉由 miR-15b 表达水平在用药前后的高低， 评判患者在治疗后是否需要长期用药。 0050 可采用各种本领域已知的技术来检测细胞内 miR-15b 的存在与否以及表达情况， 这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如原位杂交发， 聚。

23、合酶链式反应技术 (PCR)， Southern 印迹法、 DNA 序列分析等， 这些方法可结合使用。 0051 本发明还提供了用于在分析物中检测 miR-15b 的存在与否以及表达情况的试剂。 作为一种优选方式， 可以采用特异性扩增miR-15b的引物 ； 或特异性识别miR-15b的探针来 确定 miR-15b 的存在与否。 0052 作为本发明的优选方式， 检测血浆或血清中的 miR-15b。 0053 作为本发明的优选方式， 所述的试剂是引物， 其可特异性扩增出 miR-15b。更优选 的， 所述的引物所述的引物包括 ： SEQ ID NO:3 所示的反转录引物。 0054 针对 mi。

24、R-15b 的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术， 例如， 制备一种探 针， 其可与miR-15b上特定位点发生特异性结合， 而不与miR-15b以外的其它基因特异性结 合， 且所述探针带有可检测信号。 0055 检测 miR-15b 的试剂盒 0056 本发明还提供了用于在分析物中检测 miR-15b 的存在与否以及表达情况的试剂 盒， 该试剂盒包括 ： 特异性识别或扩增 miR-15b 的试剂。该试剂盒可用于进行糖尿病的预 后。 0057 作为一种优选方式， 所述的试剂盒是 PCR 检测试剂盒， 其中包括特异性扩增 miR-15b 的引物。更佳地， 所述的引物具有 5 tagcagca。

25、catcatggtttaca3 所示的核苷酸序 说 明 书 CN 103272248 A 6 5/8 页 7 列。 0058 作为一种优选方式， 所述的试剂盒是 ： PCR 检测试剂盒或原位杂交试剂盒。其中包 括特异性识别 miR-15b 的探针， 且还具有可检测信号。 0059 此外， 所述的试剂盒中还可包括用于提取 DNA、 PCR、 杂交、 显色等所需的各种试剂， 包括但不限于 ： 抽提液、 扩增液、 杂交液、 酶、 对照液、 显色液、 洗液等。 0060 此外， 所述的试剂盒中还可包括使用说明书和 / 或核酸序列分析软件等。 0061 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解，。

26、 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 J. 萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 第三版， 科学出版社， 2002 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 0062 实施例 1、 临床资料和芯片分析、 qRT-PCR 结果 0063 1、 临床资料 0064 选取 3 例新诊断 2 型糖尿病临床缓解的中年男性患者， 初诊时糖化血红蛋白均大 于 10%， 谷氨酸脱羧酶抗体、 胰岛素自身抗体和胰岛细胞抗体均阴性， 既往无糖尿病家族史。 诊断后分别应用胰岛素、 瑞格列奈。

27、、 格列吡嗪治疗， 2 型糖尿病临床症状缓解， 空腹血糖小于 7mmol/L 时停药， 糖化血红蛋白小于 6.5% 且停药后与治疗前 “2h 胰岛素与 2h 血糖比率” 的 比率大于 2， 停药后一年血糖长期保持正常水平 ( 后续称为 “临床缓解者” )。3 例新诊断 2 型糖尿病临床缓解患者治疗前和停药 1 个月后临床资料如表 1。 0065 表 1 0066 说 明 书 CN 103272248 A 7 6/8 页 8 0067 0068 * 停药 3 个月后复查糖化血红蛋白 6.3%。 0069 2、 microRNA 表达谱芯片结果分析 0070 对 3 例新诊断 2 型糖尿病临床缓解。

28、患者进行自身对照 ( 治疗前、 停药后 ) 血清的 microRNA 表达谱芯片分析， 发现停药后血清 microRNA 表达谱较治疗前发生了改变。其中 P- 值 =2 的 microRNA 共有 20 个， 如图 1 所示。 0071 大部分 microRNA 信号值低于 100。信号值高的 1 个 microRNA 是 miR-15b， 停药后 升高。 0072 3、 qRT-PCR 分析 0073 针对在表达谱芯片中发生改变的 microRNA(miR-15b)， 扩大样本 ( 另 30 例患者 ) 进行 qRT-PCR 分析， qRT-PCR 的引物序列信息如表 2。荧光定量 PCR 。

29、检测内参采用 U6， 使用 Ct 法进行数据分析。 0074 结果发现， 30例患者中， 6例患者停药后miR-15表达较治疗前增加2倍以上(P-值 0.01)， 如图 2 所示。初步判断该 6 人是预后较好的患者， 可长期停药 ； 而在其他 20 多例患 者 miR-15 表达在治疗前后没有变化， 判断为治疗后不能停药的患者。根据后续长期回访发 现， 该 6 例患者停药后， 2 型糖尿病临床症状缓解， 停药后血糖长期保持正常水平。而其它 20 多例患者则确实需要长期用药。 0075 表 2 0076 0077 实施例 2、 原代培养的胰岛及其培养上清液中检测 miR-15b 的表达、 调控 。

30、miR-15b 对 Min6 细胞的影响 0078 1、 在原代培养的胰岛及其培养上清液中检测 miR-15b 的表达 0079 本发明人首先在原代培养的胰岛及其培养上清液中检测了 miR-15b 的表达。分离 说 明 书 CN 103272248 A 8 7/8 页 9 大鼠胰岛， 先在含 33.3mmol/L 葡萄糖的 DMEM 中培养 24 小时， 之后在培养液中加入短效胰 岛素 ( 按每 3 克葡萄糖加 1U 胰岛素的比例， Bid)， 24 小时后 qRT-PCR 分析发现， 加入胰岛 素组的胰岛细胞和上清液中 miR-15b 的表达分别是未加胰岛素组的 2.3 和 2 倍， 如图 。

31、3。 0080 2、 调控 miR-15b 对 Min6 细胞的影响 0081 制备 miR-15b 的 mimics， 将表 3 中 mmu-miR-15b Mimics Sense 和 mmu-miR-15bMimics Anti-sense 混合、 退火形成双链， 转染小鼠 Min6 细胞。 0082 制 备 无 关 序 列 (NC) 的 mimics， 将 表 3 中 mmu-miR-15b Mimics NC Sense 和 mmu-miR-15b Mimics NC Anti-sense 混合、 退火形成双链， 转染 Min6 细胞。 0083 制备 miR-15b 的 inhib。

32、itors， 将表 3 中 mmu-miR-15b inhibitors 序列转染 Min6 细胞 0084 制备无关序列(NC)的inhibitors， 将表3中mmu-miR-15b inhibitors NC序列转 染 Min6 细胞。 0085 应用于合成 miR-15b 的 mimics 和 inhibitors 的序列信息如表 3。 0086 各组转染细胞经游离脂肪酸 FFA(palmitate0.45mM) 作用 30 小时。 0087 表 3 0088 0089 0090 注 ： inhibitor 序列每个碱基都进行 2 ome( 甲氧基 ) 修饰。 0091 结果， 与 F。

33、FA 组 (B) 相比较， mimics 组 (C) 胰岛素分泌增多， Ca 流峰值恢复 ； JC-1 检测 ( 红 / 绿 ) 定性和定量分析均增加 ； UCP2 表达降低， FoxO1 表达增加。而 Inhibitors 组 (D) 则出现相反的改变。提示 miR-15b 会通过降低 UCP2 表达来改善 FFA 作用后的胰岛 素分泌。 0092 3、 各处理组低糖和高糖时胰岛素的分泌 0093 检测各组低糖和高糖时胰岛素的分泌。 结果如图4， 正常对照组(A组)在25mmol/ L 葡萄糖刺激下胰岛素分泌增加到 3.3mmol/L 葡萄糖时的 3.5 倍。FFA 作用后 (B 组 ) 葡。

34、萄 糖刺激的胰岛素分泌较 A 组降低 (*P- 值 0.01)。mimics 组 (C 组 ) 胰岛素分泌较 FFA 组 说 明 书 CN 103272248 A 9 8/8 页 10 有恢复 (#P- 值 0.05)， 而 inhibitors 组 (D 组 ) 胰岛素分泌下降则更明显。可见 miR-15b 促进胰岛素分泌。 0094 4、 各处理组 JC-1 线粒体膜电位的检测 0095 JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。常用红 / 绿荧光的相 对比例来衡量线粒体去极化的比例。 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事 件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的。

35、转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降， 同时 也可以用 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。 0096 用荧光共聚焦显微镜观察检测各处理组 JC-1 线粒体膜电位， 结果如图 5。与正常 对照组 (A 组 ) 相比， FFA 组 (B 组 ) 线粒体膜电位 ( 红 / 绿定性和定量分析 ) 降低。mimics 组 (C 组 ) 较 FFA 组有恢复， 而 inhibitors 组 (D 组 ) 下降则更明显。可见 miR-15b 对于线 粒体膜电位的回复具有作用。 0097 5、 上调或下调 miR-15b 对 Min6 细胞 UCP-2 和 FoxO1 蛋白。

36、表达的影响 0098 通过常规的 Western 印迹分析方法， 检测上调或下调 miR-15b 对 Min6 细胞 UCP-2 和 FoxO1 蛋白表达的影响。结果如图 6， 与 FFA 组 (B 组 ) 相比， mimics 组 (C 组 )UCP2 表达 降低， Foxo1 表达增加。而 inhibitors 组 (D 组 ) 则出现相反的改变。可见 miR-15b 下调 UCP2 表达， 上调 Foxo1 表达。 0099 实施例 3、 构建 UCP2psicheck-2 双荧光素酶报告基因载体及分析 0100 为了进一步了解 miR-15b 是否直接与 UCP2 作用， 构建用于 L。

37、uciferase 报告基因 检测的 UCP2 的 3 UTR 序列的野生型和突变型质粒。转染 293 细胞， 使用 Promega 双荧光素 酶报告基因检测发现 miR-15b 对 UCP2 有直接的抑制作用。 0101 1、 全基因合成的 UCP2 基因 3 UTR 片段 (SEQ ID NO:2) ： 0102 1CTCGAGGTTC GTCACCTATG AGCAGCTGAA ACGAGCCCTC ATGGCTGCCT GCACTTCCCG 0103 61AGAGGCTCCC TTCTGAGCCT CTCCTGCTGC TGACCTGATC ACCTCTGGCT TTGTCTCTAG 。

38、0104 121CCGGGCCATG CTTTCCTTTT CTTCCTTCTT TCTCTTGCGG CCGC 0105 序列中， 下划线指示 Xho I 酶切位点 (CTCGAG) 和 NotI 酶切位点 (GCGG CCGC)。 0106 2、 载体克隆 0107 分析 UCP2 基因序列， 确定与 miR-15b 的可能结合位点， 如图 7C。 0108 以 293T 细胞的基因组 DNA 为模板、 以正向引物 ： CTCGAGGTTCGTCACCTATGAGC， 反向 引物 ： GCGGCCGCAAGAGAAAGAAGGAAG 为引物， PCR 扩增 UCP2 基因序列中包含预测的 。

39、miR-15b 结合位点的片段， 将片段克隆进 psiCHECK-2 双荧光素酶报告基因载体 ( 购自 Promega 公 司 ) 的 XhoI/NotI 酶切位点。同时， 使用 Quick Change XL Site-directed Mutagenesis Kit( 购自 Stratagene 公司 ) 在预计结合区域突变 3 个碱基位点， 如图 7C。UCP2 野生型 (UCP2w) 和 UCP2 突变型 (UCP2m) 载体结构详见图 7A-B。 0109 3、 Promega 双荧光素酶报告基因检测结果 0110 将上述制备的质粒转染 293 细胞。Promega 双荧光素酶报告基。

40、因检测结果如图 8， 发现 miR-15b 对 UCP2 有直接的抑制作用。 0111 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以 对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 103272248 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103272248 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 103272248 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 103272248 A 13 1/4 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103272248 A 14 2/4 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103272248 A 15 3/4 页 16 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103272248 A 16 4/4 页 17 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103272248 A 17 。