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1、10申请公布号CN104140404A43申请公布日20141112CN104140404A21申请号201410340210522申请日20140716C07D307/77200601A61K31/343200601A61P7/0220060171申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市中央路童家巷24号72发明人李萍陈君宋慧鹏陆骏74专利代理机构南京苏科专利代理有限责任公司32102代理人孙立冰54发明名称具有直接抑制凝血酶作用的化合物及用途57摘要本发明涉及一种化合物及用途，尤其涉及具有直接抑制凝血酶作用的化合物及用途，属于天然药物化学技术领域。本发明提供了具有直接抑制凝血酶作用的。
2、化合物，所述化合物为15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A。本发明提供的三个化合物均由丹参药材中提取，具有较强的凝血酶抑制作用，具有避免现有抗凝血酶药物不良反应的潜力，为其应用提供了新的途径。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104140404ACN104140404A1/1页21具有直接抑制凝血酶作用的化合物，所述化合物为15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A。2根据权利要求1所述具有直接抑制凝血酶作用的化合物的用途，其特征在于用于制备具有直接抑制凝血酶的抗血栓药物，所述药物。
3、剂型包括上述三个化合物单体中至少一个与公知的药用或食用载体混合制成药剂学上所述的任何一种剂型。3根据权利要求2所述具有直接抑制凝血酶作用的化合物的用途，其特征在于所述抗血栓药物含有上述三个化合物单体，或者由其中两个或者三个化合物组成的混合物。4根据权利要求3所述具有直接抑制凝血酶作用的化合物的用途，其特征在于所述混合物的比例是任意比例。权利要求书CN104140404A1/4页3具有直接抑制凝血酶作用的化合物及用途技术领域0001本发明涉及一种化合物及用途，尤其涉及具有直接抑制凝血酶作用的化合物及用途，属于天然药物化学技术领域。背景技术0002流行病学调查显示，血栓性心脑血管疾病在全世界范围内。
4、都己成为人口死亡与致残的重要因素之一。根据世界卫生组织“多国心血管病发展趋势及其决定因素的监测”的统计，每年大约有1700万人死于心脑血管疾病。血栓性心脑血管疾病的治疗呈严峻态势。血栓形成是一系列血浆凝血因子相继酶解、激活的过程，最终生成凝血酶，进而生成纤维蛋白凝块。抗血栓药物则是以凝血过程中的某些凝血因子或凝血酶为靶标，抑制或破坏其活性，从而破坏凝血过程的某个环节，抑制血液凝固和血栓形成。在现有的各种抗血栓药物中，直接凝血酶抑制剂因为具有不依赖于体内的抗凝血酶、可以直接与凝血酶结合抑制其活性的优势，而引起药物研发人员的重视。目前小分子直接凝血酶抑制剂主要为合成的阿加曲班、美拉加群和达比加群等。
5、，该类小分子药物在防治血栓性心脑血管疾病中作用较强且效果明显，但同时也存在脑出血、休克、过敏性休克等严重的不良反应。近年来，传统中药因为具有几千年临床经验、确切的疗效和较小的毒副作用而被日益关注。从传统中药中发现和制备直接凝血酶抑制剂可能会为解决现行药物不良反应严重的问题提供新的出路。发明内容0003本发明的目的是提供具有直接抑制凝血酶作用的化合物及用途，获取方便，副作用小。0004丹参拉丁学名SALVIAMILTIORRHIZABUNGE又名赤参。为双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，根圆柱状，朱红色。茎四棱形，叶对生，常为奇数羽状复叶。轮伞花序顶生或腋生，组成假总状花序。花冠紫蓝色。
6、，上唇直立，下唇较短，花柱远外伸。小坚果椭圆形。花期48月，果期78月。0005发明人经过实验发现具有直接抑制凝血酶作用的化合物为15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A，化学结构式依次如下00060007本发明采用高效液相法对上述三个化合物进行同时制备，具体是用乙酸乙酯对丹参药材以加热回流提取、超声提取或者闪式提取等方法进行提取。将其脂溶性提取物进行高效液相色谱分离分析，以质谱定位15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A所在的色说明书CN104140404A2/4页4谱峰。通过改变流动相、加入缓冲盐或者选择合适的色谱柱等方式，使该三个色谱峰从其他杂峰中分离。分别对三个色谱峰收集，反复多次。
7、分离收集进行样品累积。以旋蒸、真空离心浓缩或者冻干的方式去除样品溶剂，即得纯度较高的样品。0008本发明进一步提供上述化合物在制备抗血栓药物中的用途，用于制备具有直接抑制凝血酶的抗血栓药物，所述药物剂型包括上述三个化合物单体中至少一个与公知的药用或食用载体混合制成药剂学上所述的任何一种剂型。0009所述抗血栓药物含有上述三个化合物单体，或者由其中两个或者三个化合物组成的混合物。所述混合物的比例是任意比例。0010药效学试验证明，本发明的化合物对凝血酶具有较强的抑制作用。其中，凝血酶可以是来源于人、兔、鼠、牛的凝血酶。0011本发明提供的三个化合物均由丹参药材中提取，具有较强的凝血酶抑制作用，具。
8、有避免现有抗凝血酶药物不良反应的潜力，为其应用提供了新的途径。附图说明0012图1为丹参脂溶性部位在254NM下的色谱全图。0013图2为15,16二氢丹参酮I的IC50曲线图。0014图3为隐丹参酮的IC50曲线图。0015图4为丹参酮A的IC50曲线图。具体实施方式0016实施例0017本实施例按以下方法提取具有直接抑制凝血酶作用的化合物0018115,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A的同时制备方法00191试剂与耗材乙腈、甲酸HPLC级，德国MERCK公司；AGLILENTZORBAXSBC18半制备柱，规格为25094MM，5M美国AGILENT公司；乙酸乙酯江苏强盛功能化学股份有。
9、限公司00202丹参脂溶性提取物的制备称取丹参药材粉末25G，加100ML乙酸乙酯，用100W功率超声提取60MIN。过滤，滤液在50旋蒸浓缩至干。分别刮下旋干粉末，用水混悬，冻干，即得丹参脂溶性提取物232G。00213取丹参脂溶性提取物冻干粉用甲醇配制成200MG/ML的溶液，进样20L进行高效液相色谱分析。高效液相色谱分析在AGILENT1260液相系统偶联6530四极杆飞行时间串联质谱系统美国AGILENT公司中进行，分离色谱柱为AGLILENTZORBAXSBC18半制备柱25094MM,5M，洗脱梯度为0MIN,10；10MIN,21；15MIN,23；39MIN,43；65MIN。
10、,46；79MIN,54；88MIN,63；100MIN,64；108MIN,65；115MIN,68；123MIN,70；129MIN,80；138MIN,90；143MIN,100；155MIN,100。流速2ML/MIN，柱温25，进样量20L。紫外检测波长为254NM。质谱检测条件如下电喷雾正离子模式下采集数据，质量扫描范围为M/Z1001000，毛细管电压35KV，雾化气压力35PSIG，干燥气体积流量10L/MIN，干燥气温度350，SKIMMER65V，测定样品前采用混标调谐液校准质量轴。15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A的色谱峰的确定是与购自中国药品生物制说明书CN10。
11、4140404A3/4页5品检定所的标准品进行质谱数据比对见表1，色谱峰所在的位置请见图1。对15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A的色谱峰进行收集。为了保证每个化合物的纯度，与目标色谱峰有交叉的部分不收集。在累积50次样品累积之后，即可得到纯度在95以上的15,16二氢丹参酮I210MG、隐丹参酮768MG、丹参酮A538MG。结果证明该方法可以同时制备三个化合物，缩短了样品制备时间，成本较低且纯度较高。0022表115,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A的质谱鉴定002300240025活性实验002615,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A的凝血酶活性测试说明书CN1041404。
12、04A4/4页600271试剂与耗材乙酸乙酯江苏强盛功能化学股份有限公司、水、凝血酶美国SIGMA公司、凝血酶底物S2238北京艾德豪克仪器技术有限公司、DMSO美国SIGMA公司、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸江苏南京化学试剂有限公司0028缓冲液配制精密称取KH2PO404780G、K2HPO43H2O34730G及乙二胺四乙酸EDTA931MG，加入超纯水约240ML超声促溶，取出，定容至250ML即得含75MMOL/L磷酸根离子、200MOL/LEDTA、PH74的磷酸盐缓冲液PB。00292用酶标仪进行凝血酶抑制活性测试的一般步骤如下A将待测样品与凝血酶孵育。B向A步骤的孵育液。
13、中加入底物启动反应，用酶标仪测试其在405NM下吸光度随时间变化曲线。空白组将待测样品换成缓冲液。C按如下公式计算抑制率DA/DT空白DA/DT样品/DA/DT空白100。其中DA/DT空白为空白组的反应速率，DA/DT样品为待测样品组反应速率。D绘制待测混合物梯度浓度与活性的关系图。0030在本实验中，分别准确称取15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A，用含05DMSO的PB溶液配成初浓度为2000M的母液，分别稀释成9个浓度，按照如下步骤进行凝血酶抑制活性测试将样品及空白溶液空白为PB100L、酶液75L终浓度175U/ML，依次加入96孔板，在酶标仪上37孵育10MIN，加入底物25。
14、L终浓度150MOL/L启动反应，在405NM处每隔15S读数一次，记录吸收度A，共计15MIN。每组平行设置4个复孔。抑制率可通过样品组及空白组A值的变化，用下列公式计算抑制率DA/DT空白DA/DT样品/DA/DT空白100。其中DA/DT空白为空白组的反应速率，DA/DT样品为样品组反应速率。DA/DT的时间段选择在090S。取4个复孔测定的平均值，即得样品的抑制率。数据处理使用GRAPHPADPRISM602软件。15,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A对凝血酶的抑制曲线分别见图2、3、4，其对应的IC50值请见表2。阿加曲班做为阳性对照，IC50值为188514NM,与文献报道相近。
15、，证明测试体系可靠。0031215,16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮A对凝血酶的半数抑制浓度IC500032化合物名称凝血酶抑制活性IC50M15,16二氢丹参酮I29391992隐丹参酮81111258丹参酮A66602260033凝血酶可以是来源于人、兔、鼠、牛的凝血酶。底物可以是TOSYLGLYPROARGPNITROANILIDEACETATE或S2238HDPHEPIPARGPNITROANILINE。缓冲液可以是PH6080的磷酸缓冲液、PH6080的乙酸铵缓冲液、PH6080的碳酸氢铵缓冲液或PH6080的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。因为有些化合物小分子在缓冲液体系中不溶解，需要加入低浓度的增溶剂。增溶剂选自二甲基亚砜、吐温、聚乙二醇、曲拉通中的一种或几种。0034除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。说明书CN104140404A1/2页7图1图2图3说明书附图CN104140404A2/2页8图4说明书附图CN104140404A。