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1、(10)申请公布号 CN 103301456 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103301456 A *CN103301456A* (21)申请号 201310162941.0 (22)申请日 2013.05.06 A61K 39/39(2006.01) A61K 9/107(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 吴斌 吴成龙 汤细彪 肖志东 张倩 夏欣 张洁 樊杰 胡睿铭 何启盖 陈焕春 (74)专利代理机构 武。
2、汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 樊戎 徐绍新 (54) 发明名称 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂及其制 备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种水包油型酵母 葡聚糖 纳米乳佐剂， 它是由下述重量百分比的成分组成 的 ： 水溶性酵母 葡聚糖 0.23%、 白油 418%、 表 面活性剂 625%、 助表面活性剂 415%、 注射用蒸 馏水为余量， 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述助表面活性剂为聚乙二醇 400。 本发明还公开了它的制备方法和在制备疫苗中的 应用。本发明具有较高的稳定性， 流动性好， 黏度 低， 易于注射， 同时安全性好。
3、， 无毒副作用， 配苗简 单， 注射后疫苗吸收完全， 无残留。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103301456 A CN 103301456 A *CN103301456A* 1/2 页 2 1. 一种水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 其特征在于它是由下述重量百分比的成 分组成的 ： 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述 Tween80 和 Span 80 的重量比 为 24 1 ； 所述。
4、助表面活性剂为聚乙二醇 400。 2.根据权利要求1所述的水包油型酵母葡聚糖纳米乳佐剂， 其特征在于所述成分的 重量百分比为 ： 3. 根据权利要求 1 所述的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 其特征在于所述 Tween80 和 Span 80 的重量比为 3 1。 4.根据权利要求1所述的水包油型酵母葡聚糖纳米乳佐剂， 其特征在于所述表面活 性剂与助表面活性剂的重量比为 2 1。 5.一种制备权利要求14任何一项所述水包油型酵母葡聚糖纳米乳佐剂的方法， 其 特征在于包括以下步骤 ： 1） 按比例称取水溶性酵母 葡聚糖溶于预热的注射用蒸馏水， 搅拌使其充分溶解， 50008000r/min 离。
5、心 1030min， 除去不溶物， 所得水溶性酵母 葡聚糖水溶液即为水相， 灭菌后备用 ； 2） 按比例称取白油， 表面活性剂及助表面活性剂， 搅拌混合均匀， 所得即为油相， 灭菌 后备用 ； 3） 室温下， 无菌环境中将水相缓慢滴加到油相中， 滴加过程中不断搅拌， 搅拌速度为先 慢后快， 滴加完后， 以 5001000r/min 搅拌 1520min， 直至形成流动性较好的， 均一透明的 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。 6. 权利要求 14 任何一项所述的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂在制备疫苗中的 应用。 7. 权利要求 14 任何一项所述的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂在制备猪圆环病 。
6、权 利 要 求 书 CN 103301456 A 2 2/2 页 3 毒 2 型灭活疫苗中的应用。 8. 一种猪圆环病毒 2 型灭活疫苗， 由猪圆环病毒 2 型灭活抗原溶液和权利要求 14 任 何一项所述的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂组成。 9. 根据权利要求 8 所述的猪圆环病毒 2 型灭活疫苗， 其特征在于 ： 所述水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂与猪圆环病毒 2 型灭活抗原溶液的体积比为 12 1。 权 利 要 求 书 CN 103301456 A 3 1/10 页 4 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗佐剂， 具体涉及一种水包油型酵。
7、母 葡聚糖纳米乳佐剂及 其制备方法和在制备疫苗中的应用。 技术背景 0002 疫苗佐剂是指与抗原物质结合后能非特异性增强机体对抗原的免疫应答或改变 其免疫反应类型， 而本身无免疫原性的一类物质。由于大多数疫苗单独使用时不能很好激 发免疫反应， 需要加入疫苗佐剂来增强其免疫效果， 因此疫苗佐剂在疫苗应用中具有重要 的作用。 油佐剂是当前动物疫苗中应用最广泛的佐剂之一。 油佐剂疫苗是以矿物油为油相， 抗原溶液为水相， 加入表面活性剂后乳化形成的油乳剂疫苗。油乳剂主要包括油包水 （W/ O） ， 水包油 （O/W） 两种剂型。而当前国内兽用油佐剂疫苗以油包水 （W/O） 型为主， 它虽能诱 导机体产。
8、生有效的免疫反应， 但表现粘稠， 注射困难， 常在局部引起炎症反应， 形成肉芽肿 等副作用。同时， 矿物油因难以降解而在体内残留， 影响了动物肉类的品质。水包油 （O/W） 型油乳佐剂能使机体快速产生免疫反应， 且副作用小， 安全性高， 但多表现不稳定。 因此， 克 服以上存在的不足， 研制出安全、 有效、 稳定的水包油 （O/W） 型油乳剂是油佐剂疫苗的主要 发展方向。国外已开始在动物疫苗中推广使用水包油 （O/W） 型油乳佐剂， 而国内很少见到 成熟的水包油 （O/W） 型油乳佐剂产品问世。 0003 纳米乳是一类乳滴直径非常小， 在纳米尺度范围 （20-500nm） 的乳液， 外观呈透明。
9、 或半透明。纳米乳是由油相、 水相、 表面活性剂和助表面活性剂按一定比例混合后自发形 成的热力学稳定、 各向同性、 外观透明或半透明的分散体系。纳米乳可作为一种新型药物 载体， 提高难溶性药物的溶解度， 促进大分子药物在体内的吸收， 从而提高药物的生物利用 度， 同时具有安全性高， 稳定性好等优点， 因此被广泛用于医药领域。将纳米乳作为佐剂应 用于动物疫苗不仅可改善常规油乳佐剂黏度大， 注射困难， 局部副作用大等缺点， 同时在提 高疫苗的稳定性， 增强疫苗的免疫效果方面将显示独特优势。 0004 酵母 葡聚糖是从酵母细胞壁中分离出来的一种免疫多糖， 其结构主要由 -1,3-D 葡聚糖及 -1,。
10、6 葡聚糖支链构成。研究证实， -1-3-D- 葡聚糖具有免疫刺激活 性， 能诱导机体产生促炎性细胞因子 （TNF-， IL-6， IL-10， IL-1 等） ， 可间接激活 T 细胞 和B细胞， 诱发机体产生细胞免疫和体液免疫， 可作为免疫佐剂增强机体的免疫力。 酵母 葡聚糖具有抗癌、 抗辐射、 抗菌、 抗病毒、 抗寄生虫等活性， 还可溶解胆固醇， 降血脂的功效， 因此被广泛应用于医药， 食品， 保健品， 饲料等行业。 2010年卫生部正式批准酵母葡聚糖 为新资源食品， 即可进入食品及相关行业。 0005 由于直接从酵母细胞壁中提取出的酵母 葡聚糖不能溶于水， 所以一直以来都 是将酵母 葡。
11、聚糖通过动物口服的方式来研究其对动物免疫功能的影响。研究证实， 酵母 葡聚糖添加在饲料中可调节动物的免疫功能， 促进淋巴细胞的增殖与分化， 诱导并增强 机体的细胞免疫和体液免疫。 Wang等研究报道了酵母-1,3/1,6-葡聚糖添加在日粮中可 显著提高断难仔猪外周血 T、 B 淋巴细胞转化率， 并可提高猪瘟抗体水平， 但其免疫调节作 说 明 书 CN 103301456 A 4 2/10 页 5 用受添加量和时间的影响 （Wang et al 2008） 。Le 等研究报道了家禽接种禽流感油乳剂灭 活苗后， 连续 2 周饲喂 Sophy 公司生产的酵母 葡聚糖 （SBG） ， 抗体检测结果表明。
12、 ： 添加酵 母 葡聚糖组的 HI 抗体和 ELISA 血清转化率相比于未添加组分别高出 1.0-1.5 log2 和 10-20% （Le et al 2011） 。近年来， 研究人员通过化学改造的方式 （羧甲基化， 硫酸化， 乙酰 化等） 将水不溶性酵母 葡聚糖转变为水溶性酵母 葡聚糖， 同时其免疫活性功能并未受 到影响， 这种有益改造将改变传统口服的应用方式， 扩大酵母 葡聚糖的应用范围， 提高 其生物利用率。 0006 目前， 国内外对于酵母 葡聚糖以注射方式研究其免疫刺激活性的报道较少， 国 内报道了在奶牛接种口蹄疫油乳剂灭活苗的基础上， 后海穴再补注酵母葡聚糖注射液可提 高奶牛口蹄。
13、疫疫苗的免疫效果 （专利号 ： 2010105813306） ， 但尚未见报道将水溶性酵母 葡聚糖与作为抗原输送载体的纳米乳佐剂结合， 以利用两者的协同加强效应， 通过水油亲 和平衡技术和纳米技术， 旨在将水溶性酵母 葡聚糖增溶于纳米乳载体中， 以研制出一种 安全、 有效、 稳定的水包油 （O/W） 型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂并可直接用于动物疫苗。 发明内容 0007 针对上述现有技术中存在的问题与缺陷， 本发明的目的在于将水溶性酵母 葡 聚糖和油乳佐剂两种不同作用机理的佐剂结合到一起， 以实现优势互补， 协同加强， 充分发 挥疫苗复合佐剂的功效， 从而提供一种稳定性好， 安全性高， 免疫效果好。
14、的水包油 （O/W） 型 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。本发明还提供了它的制备方法和在制备疫苗中的应用以及一 种猪圆环病毒 2 型灭活疫苗。 0008 本发明通过以下技术方案实现 ： 0009 一种水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 它是由下述重量百分比的成分组成的 ： 0010 0011 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述 Tween80 和 Span 80 的重 量比为 24 1 ； 优选为 3 1。 0012 所述助表面活性剂为聚乙二醇 400 ； 0013 优选的， 所述成分的重量百分比为 ： 0014 说 明 书 CN 103301456 A 5 3/10。
15、 页 6 0015 0016 优选的， 所述表面活性剂与助表面活性剂的重量比为 2 1。 0017 所述水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的制备方法是 ： 0018 1） 按比例称取水溶性酵母 葡聚糖溶于预热的注射用蒸馏水， 搅拌使其充分溶 解， 50008000r/min 离心 1030min， 除去不溶物， 所得水溶性酵母 葡聚糖水溶液即为水 相， 灭菌后备用 ； 0019 2） 按比例称取白油， 表面活性剂及助表面活性剂， 搅拌混合均匀， 所得即为油相， 灭菌后备用 ； 0020 3） 室温下， 无菌环境中将水相缓慢滴加到油相中， 滴加过程中不断搅拌， 搅拌速度 为先慢后快， 滴加完后， 以。
16、 5001000r/min 搅拌 1520min， 直至形成流动性较好的， 均一透 明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。 0021 本发明将水溶性的酵母 葡聚糖增溶于油乳剂中， 通过水油亲和平衡技术及纳 米技术制备一种水包油 （O/W） 型的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 该纳米乳佐剂包括油相部分 和水相部分， 油相部分包括白油、 表面活性剂、 助表面活性剂 ； 水相部分包括水溶性酵母 葡聚糖和注射用蒸馏水。本发明所制备的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂可被无限稀释而仍保 持澄清透明状态， 即纳米乳性状不会发生改变， 这大大提高了与疫苗抗原的配比范围。 0022 本发明进一步提供了上述酵母 葡聚糖纳米乳佐剂在。
17、制备灭活疫苗中的应用， 特别是在制备猪圆环病毒 2 型灭活疫苗中的应用。 0023 本发明还提供了一种猪圆环病毒 2 型灭活疫苗， 由猪圆环病毒 2 型灭活抗原溶液 和所述的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂组成。 0024 其中， 所述水包油型酵母葡聚糖纳米乳佐剂与猪圆环病毒2型灭活抗原溶液的 体积比为 121。 0025 本发明的的有益效果是 ： 0026 1） 本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂具有较高的稳定性， 在 4、 室温 放置 1 年以上及 37放置 90 天均无分层或破乳 ； 0027 2） 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的流动性好， 黏度低， 易于注射， 能克服传 统矿物油佐。
18、剂疫苗的黏度大、 注射困难等缺点， 同时安全性好， 无毒副作用， 注射后疫苗吸 收完全， 无残留 ； 0028 3） 制备工艺简单， 无需特殊设备， 可实现规模化生产， 在配制疫苗时， 两者搅拌混 合均匀即可， 并可与抗原按任意比混合而不改变其性状。 附图说明 0029 图 1 是 Tween 80:Span 80=1:1 的表面活性剂对纳米乳形成的影响。 0030 图2是Tween 80:Span 80=2:1的表面活性剂对纳米乳形成的影响， 图中黑色阴影 部分为 O/W 型纳米乳区。 0031 图3是Tween 80:Span 80=3:1的表面活性剂对纳米乳形成的影响， 图中黑色阴影 说。
19、 明 书 CN 103301456 A 6 4/10 页 7 部分为 O/W 型纳米乳区。 0032 图4是Tween 80:Span 80=4:1的表面活性剂对纳米乳形成的影响， 图中黑色阴影 部分为 O/W 型纳米乳区。 0033 图5是表面活性剂与助表面活性剂的质量比为Km=1:2对纳米乳形成的影响， 图中 黑色阴影部分为 O/W 型纳米乳区。 0034 图6是表面活性剂与助表面活性剂的质量比为Km=1:1对纳米乳形成的影响， 图中 黑色阴影部分为 O/W 型纳米乳区。 0035 图7是表面活性剂与助表面活性剂的质量比为Km=2:1对纳米乳形成的影响， 图中 黑色阴影部分为 O/W 型纳。
20、米乳区。 0036 图8是表面活性剂与助表面活性剂的质量比为Km=3:1对纳米乳形成的影响， 图中 黑色阴影部分为 O/W 型纳米乳区。 0037 图 9 是水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的粒径分布图。 0038 图 10 是水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的透射电镜图。 0039 图 11 是水包油型酵母 葡聚糖纳米乳为佐剂的猪圆环病毒 2 型 （PCV-2） 灭活苗 抗体水平的变化情况。 具体实施方式 0040 以下结合实施例对本发明进一步说明。 0041 实施例 1 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂处方的筛选 0042 纳米乳形成的关键是选择合适的油相， 表面活性剂， 助表面活性剂等成分及其。
21、比 例的确定。同时， 对于药用的纳米乳， 在选择组成组分时还应重点考虑其安全性、 生物相容 性等。基于以上筛选原则， 本发明通过查阅有关资料， 根据纳米乳配方设计原则， 初步预选 矿物油 （即医用白油， 商品名为 Marcol 52） 为制备纳米乳佐剂的油相， 非离子表面活性剂 Span 80， Tween 80 为制备纳米乳佐剂的表面活性剂， 乙醇、 1,2 丙二醇、 正丁醇、 聚乙二醇 400 为制备纳米乳佐剂的助表面活性剂。然后， 根据初步筛选的纳米乳佐剂组分， 设计不同 的纳米乳佐剂制备处方， 通过采用水滴定法(Shafiq-un-Nabi S, Shakeel F, Talegaon。
22、kar S, Ali J, Baboota S, Ahuja A, Khar RK, Ali M. Formulation development and optimization using nanoemulsion technique: a technical note. AAPS Pharm Sci Tech, 2007, 8(2): E12E17) 绘制伪三元相图来判断能否形成纳米乳或形成纳米乳的难 易程度， 不同温度 （4， 25， 37） 放置 1 周观察纳米乳能否稳定存在， 将纳米乳接种小鼠 观察有无临床不良反应等 3 种方式对处方进行筛选， 确定出本发明的油相为矿物油 （即医 。
23、用白油， 商品名为 Marcol 52） ， 表面活性剂为非离子表面活性剂 Span 80， Tween 80 的混合 物， 助表面活性剂为聚乙二醇 400（见表 1） 。 0043 在选定合适的油相、 表面活性剂、 助表面活性剂后， 通过水滴定法绘制伪三元相 图， 以油相 （O） ， 表面活性剂 / 助表面活性剂的混合物 （Smix） ， 水相 （W） 作为相图的顶点， 利 用 Origin Pro 7.5 软件绘制出纳米乳佐剂的伪三元相图水包油 （O/W） 型纳米乳区， 以纳米 乳区的大小为评价指标， 借助伪三元相图来考察影响纳米乳形成的主要因素 （表面活性剂 的混合质量比 （Tween 。
24、80/Span 80） ， 表面活性剂与助表面活性剂的质量比 （Km 值） ， 优化并 确定纳米乳佐剂的最佳处方。结果显示 ： 由图 14 可知， 在 Tween 80/Span 80=1:1 时， 该体 说 明 书 CN 103301456 A 7 5/10 页 8 系不能形成纳米乳， 未能在伪三元相图中绘制出 O/W 型纳米乳区。而在其他 3 种混合比下 都可形成 O/W 型纳米乳， O/W 型纳米乳区大小顺序为 ： Tween 80/Span 80=3:1 Tween 80/ Span 80=2:1Tween 80/Span 80=4:1。因此， 确定本发明的表面活性剂 Tween 80。
25、 与 Span 80 的最佳混合质量比为 3 1（Tween 80/Span 80） ； 由图 58 可知， 4 种 Km 值下都可形成 O/W型纳米乳， 其中以Km=2:1所形成O/W型纳米乳区最大。 因此， 本发明的表面活性剂与助 表面活性剂的最佳质量比为 2 1（Span 80+Tween 80)/ 聚乙二醇 400） 。 0044 表 1 助表面活性剂的筛选结果 0045 0046 实施例 2 0047 一种水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 由下述重量百分比的成分组成 ： 0048 0049 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述 Tween80 和 S。
26、pan 80 的重 量比为 2 1 ； 0050 所述助表面活性剂为聚乙二醇 400 ； 0051 所用水溶性酵母 葡聚糖为 葡聚糖含量 90% 的羧甲基化酵母 葡聚糖。 0052 制备方法是 ： 0053 1） 按比例称取水溶性酵母 葡聚糖溶于预热 （70水浴） 的注射用蒸馏水， 搅拌 使其充分溶解， 5000r/min 离心 30min， 除去不溶物， 所得水溶性酵母 葡聚糖溶液即为水 相， 灭菌后备用 ； 0054 2） 按比例称取白油， 表面活性剂及助表面活性剂， 搅拌混合均匀， 所得即为油相， 灭菌后备用 ； 说 明 书 CN 103301456 A 8 6/10 页 9 0055 。
27、3） 室温下， 无菌环境中将水相缓慢滴加到油相中， 滴加过程中不断搅拌， 搅拌速度 为先慢后快， 滴加完后， 以 500r/min 搅拌 20min， 直至形成流动性较好的， 均一透明的水包 油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。 0056 实施例 3 0057 一种水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 由下述重量百分比的成分组成 ： 0058 0059 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述 Tween80 和 Span 80 的重 量比为 4 1 ； 0060 所述助表面活性剂为聚乙二醇 400 ； 0061 所用水溶性酵母 葡聚糖为 葡聚糖含量 90% 的水溶性羧甲基酵。
28、母 葡聚 糖。 0062 制备方法是 ： 0063 1） 按比例称取水溶性酵母 葡聚糖溶于预热的注射用蒸馏水， 搅拌使其充分溶 解， 8000r/min离心10min， 除去不溶物， 所得水溶性酵母葡聚糖水溶液即为水相， 灭菌后 备用 ； 0064 2） 按比例称取白油， 表面活性剂及助表面活性剂， 搅拌混合均匀， 所得即为油相， 灭菌后备用 ； 0065 3） 室温下， 无菌环境中将水相缓慢滴加到油相中， 滴加过程中不断搅拌， 搅拌速度 为先慢后快， 滴加完后， 以 1000r/min 搅拌 15min， 直至形成流动性较好的， 均一透明的水包 油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。 0066 实施例。
29、 4 0067 一种水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 由下述重量百分比的原料组成 ： 0068 0069 所述表面活性剂为 Tween80 和 Span 80 的混合物， 所述 Tween80 和 Span 80 的重 量比为 3 1 ； 说 明 书 CN 103301456 A 9 7/10 页 10 0070 所述助表面活性剂为聚乙二醇 400。 0071 制备方法是 ： 0072 1） 按比例称取水溶性酵母 葡聚糖溶于预热的注射用蒸馏水， 搅拌使其充分溶 解， 6000r/min离心20min， 除去不溶物， 所得水溶性酵母葡聚糖水溶液即为水相， 灭菌后 备用 ； 0073 2） 按比例。
30、称取白油， 表面活性剂及助表面活性剂， 搅拌混合均匀， 所得即为油相， 灭菌后备用 ； 0074 3） 室温下， 无菌环境中将水相缓慢滴加到油相中， 滴加过程中不断搅拌， 搅拌速度 为先慢后快， 滴加完后， 以 800r/min 搅拌 20min， 直至形成流动性较好的， 均一透明的水包 油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂。 0075 实施例 5 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的理化特性分析 0076 1） 外观的观察 0077 本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂为浅棕黄色、 均一透明液体。 0078 2） 剂型的鉴定 0079 取相同体积的本发明酵母 葡聚糖纳米乳佐剂两份， 分别加入油溶性染料 。
31、（苏丹 红） 和水溶性染料 （亚甲基蓝） 各 2 滴， 静置观察， 结果发现， 亚甲基蓝在纳米乳中扩散， 而苏 丹红在纳米乳中未扩散， 表明本发明的纳米乳佐剂为水包油 （O/W） 型。 0080 3） 粒径分布及平均粒径的测定 0081 激光光散射粒度仪测定本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的平均粒径 及粒度分布情况。粒度分析结果表明， 本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的平均 粒度在 74.31nm， 粒度主要分布在 60120nm（见图 3） 。 0082 4） 微观形态的观察 0083 透射电镜观察本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的形态及其粒度大 小。电镜结果显示， 本发明。
32、的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的乳滴呈球形， 大小均匀， 分散性较好 （见图 4） 。 0084 5） 稳定性的评价 0085 （1） 离心稳定试验 ： 10000 r/min 的转速离心 20min， 本发明的水包油型酵母 葡 聚糖纳米乳佐剂未出现浑浊、 破乳、 分层等现象。 0086 （2） 留样观察试验 ： 取三批制备的本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂密 封于 20mL 青霉素瓶中， 4， 25条件下放置 1 年、 37条件下放置 3 个月均未出现分层， 破 乳， 沉淀等现象。 0087 实施例 6 水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的安全性评价 0088 1、 热原质试验 0089。
33、 按照 生物制品热原质试验规程 的标准， 选符合规定的 3 只健康家兔， 称取重量 后， 在测家兔正常体温后 15 分钟内， 按规定剂量自耳边静脉缓缓注入预热至 38的本发明 的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂， 每隔 30 分钟测量体温 1 次， 连测 6 次。每只兔的 6 次体温中最高升温与注射前的正常体温之差为该兔的升高度数。 根据肌内注射制品判断标 准 ： 如果 3 兔升温均低于 0.80， 并且 3 兔升温总和不超过 1.80 ； 或 3 兔中 1 只升温达 0.80， 其他升温均低于 0.80， 并且 3 兔升温总和不超过 1.80； 符合上述情况判定供试 说 明 书 CN 1033。
34、01456 A 10 8/10 页 11 品为合格。 0090 表 2 热原实验结果 0091 0092 按规定注射酵母 葡聚糖纳米乳佐剂后， 3 只家兔体温升高度数均 0.8， 并且 3 只家兔的体温升高总数不超过 1.8（见表 2） 。根据 生物制品热原质试验规程 判定标 准， 本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的热原质检测符合规定， 安全合格。 0093 2、 肌肉刺激试验 0094 取健康家兔2只， 一侧后肢股四头肌内注射酵母葡聚糖纳米乳佐剂1mL， 另一侧 后肢对应部位注射生理盐水 1mL 作为对照， 分别在注射后 2 天， 14 天处死家兔， 解剖观察注 射部位及肌肉组织的变化。
35、。 0095 结果显示， 本发明的水包油型酵母葡聚糖纳米乳佐剂注射后2天， 14天， 注射部 位未出现肿胀、 鼓包等炎症反应。局部解剖股四头肌注射部位， 沿肌肉纵向切开， 酵母 葡 聚糖纳米乳佐剂注射部位与生理盐水注射部位无明显区别， 肌肉颜色正常， 无充血、 水肿、 变性坏死等现象。本发明的水包油型酵母 葡聚糖纳米乳佐剂在肌肉中吸收完全， 未发现 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂残留。 0096 实施例 7 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂制备猪圆环病毒 2 型灭活苗 0097 无菌环境下， 在室温下 （302） 将制备的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂与猪圆环病 毒 2 型 （PCV-2） 灭活苗按体积比 12:1 混。
36、合， 在酵母 葡聚糖纳米乳佐剂中缓慢加入猪圆 环病毒 2 型 (PCV-2) 灭活抗原溶液， 边加边搅拌， 500800r/min 搅拌 1015min， 即可得澄清 透明、 流动性好、 稳定性高的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂制备的猪圆环病毒 2 型灭活苗。 0098 实施例 8 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂制备的猪圆环病毒 2 型灭活苗的成品检验 0099 参照现行 中华人民共和国兽医生物制品规程 和 中华人民共和国兽药典 对酵 母葡聚糖纳米乳佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活苗进行物理性状检验及无菌检验， 结果 表明， 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂制备的猪圆环病毒 2 型灭活苗的剂型为水包油 （O/W） 型， 黏。
37、度、 稳定性及无菌检验均符合疫苗成品规定。 0100 实施例 9 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂制备的猪圆环病毒 2 型灭活苗的安全性及动 物免疫试验 0101 以猪圆环病毒 2 型 （PCV-2） 灭活苗为抗原， 将佐剂和抗原按体积比为 1.5:1 混合， 各试验组抗原及抗原含量保持一致。 0102 1. 安全性试验 说 明 书 CN 103301456 A 11 9/10 页 12 0103 选取 14 日龄健康哺乳仔猪 10 头， 分 2 组， 每组 5 头。一组颈部肌肉注射 2 倍免疫 剂量 （4ml） 的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂的 PCV-2 灭活苗， 另一组注射相同剂量的无佐剂的 PCV-2。
38、 灭活苗作为对照。在免疫前及免疫后 7d 每天测定体温， 观察有无发热反应。免疫后 连续 14d 观察猪群的采食情况， 精神状况。观察注射部位有无红肿， 炎症， 结节。 0104 表 3 注射疫苗后哺乳仔猪体温变化情况 0105 0106 注射 2 倍免疫剂量的酵母 葡聚糖纳米乳佐剂 PCV-2 灭活苗后， 仔猪精神状况良 好， 饮食正常， 注射部位未出现炎症， 红肿等局部反应。体温正常， 无明显发热反应， 结果见 表 3。 0107 2. 免疫试验 0108 选取 14 日龄健康哺乳仔猪 81 头， 分为 5 组。1-4 组为试验组， 每组 18 头， 第 5 组 为空白对照组， 共 9 头。
39、。第一组颈部肌肉注射 2ml 1% 酵母 葡聚糖的纳米乳 （1% CMG-NE） 佐剂 PCV-2 灭活苗， 第二组颈部肌肉注射 2ml 2% 酵母 葡聚糖的纳米乳 （2% CMG-NE） 佐 剂 PCV-2 灭活苗， 第三组颈部肌肉注射 2ml 3% 酵母 葡聚糖的纳米乳 （3% CMG-NE） 佐剂 PCV-2 灭活苗， 第四组颈部肌肉注射 2ml 白油佐剂 （油包水型） PCV-2 灭活苗， 第五组为空白 对照。首免后 2 周加强免疫一次， 分别在免前， 免疫后间隔 2 周 （0d， 14d， 28d， 42d） 采血， 分 离血清检测 PCV-2 ELISA 抗体。 0109 PCV-。
40、2 ELISA 抗体检测结果显示 （见图 5） ， 相比于空白对照组的 PCV-2 抗体水平 随时间一直下降， 且下降速度较快， 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂 PCV-2 灭活苗在免疫后可提 高免疫猪群的 PCV-2 抗体水平。总的来说， 在免疫后的不同时间点上， 其中 1%CMG-NE 佐剂 PCV-2 灭活苗和白油佐剂 （油包水型） PCV-2 灭活苗均能诱导产生高整齐度、 高水平的 PCV-2 抗体， 两者无显著差异， 都表现较好的佐剂效果。 0110 3. 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂对免疫猪的平均日增重的影响 0111 统计试验阶段试验猪的初始平均体重及试验结束时试验猪的终末平均体重， 计算 各。
41、试验组的平均日增重情况， 结果见表 4。 0112 表 4 不同试验组的仔猪平均日增重情况 说 明 书 CN 103301456 A 12 10/10 页 13 0113 0114 相比于空白对照组， 各试验组在试验阶段的平均日增重提高明显， 其中， 1%CMG-NE 试验组的平均日增重为 0.487kg， 相比于空白对照组提高了 6.1% ； 2%CMG-NE 试验组的平 均日增重为 0.533kg， 相比于空白对照组提高了 16.1% ； 3%CMG-NE 试验组的平均日增重为 0.459kg， 与空白对照组一样 ； 白油佐剂组的平均日增重为 0.517kg， 相比于空白对照组提 高了 1。
42、2.6%。综上， 2%CMG-NE 试验组对试验猪的平均日增重效果明显， 相比于空白对照组提 高幅度最大， 并高于白油佐剂组。由此表明， 酵母 葡聚糖纳米乳佐剂对免疫猪的平均日 增重有积极提升作用。 说 明 书 CN 103301456 A 13 1/4 页 14 图 1 图 2 图 3图 4 说 明 书 附 图 CN 103301456 A 14 2/4 页 15 图 5图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103301456 A 15 3/4 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103301456 A 16 4/4 页 17 图 11 说 明 书 附 图 CN 103301456 A 17 。