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1、(10)申请公布号 CN 103301141 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103301141 A *CN103301141A* (21)申请号 201310217360.2 (22)申请日 2013.06.03 A61K 31/7048(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 南京正亮医药科技有限公司 地址 211300 江苏省南京市高淳区经济开发 区古檀大道 3 号科创大楼 607 室 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 Polyflavanostilbene A 在制备治疗白血病 药物中的应用 (57) 摘要 本 发 。
2、明 涉 及 Polyflavanostilbene A 在 制备治疗白血病药物中的应用， 属于医药领 域。Polyflavanostilbene A 在 制 备 治 疗 白 血 病 药 物 中 的 应 用 ； Polyflavanostilbene A 在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用， Polyflavanostilbene A 在制备诱导白血病细 胞凋亡药物中的应用。Polyflavanostilbene A 通过抑制白血病细胞增殖和诱导白血病细胞凋 亡， 来对白血病进行治疗。对于本发明涉及的 Polyflavanostilbene A 在制备治疗白血病药物 中的用途属于首次公开， 由。
3、于骨架类型属于全新 的骨架类型， 而且其对于白血病细胞的抑制活性 强得意想不到。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103301141 A CN 103301141 A *CN103301141A* 1/1 页 2 1.Polyflavanostilbene A 在 制 备 治 疗 白 血 病 药 物 中 的 应 用， 所 述 化 合 物 Polyflavanostilbene A 结构如式 （） 所示 ： 权 利 要 求 书 CN 103301141 A。
4、 2 1/4 页 3 Polyflavanostilbene A 在制备治疗白血病药物中的应用 技术领域 0001 本 发 明 涉 及 化 合 物 Polyflavanostilbene A 的 新 用 途，尤 其 涉 及 Polyflavanostilbene A 在制备治疗白血病药物中的应用。 背景技术 0002 急性白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。 其克隆中的白血病细胞失 去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血 病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织， 同时使正常造血受抑制， 临床表现为贫血、 出 血、 感染及各器官浸润症状。根据统计， 。
5、白血病约占肿瘤总发病率的 3% 左右， 是儿童和青年 中最常见的一种恶性肿瘤。 白血病的发病率在世界各国中， 欧洲和北美发病率最高， 其死亡 率为 3.2-7.4/10 万人口。寻找能够防治急性白血病的药物显得非常迫切。 0003 本发明涉及的化合物 Polyflavanostilbene A 是一个 2013 年发表 （Fushuang Li,et al.,2013.Polyflavanostilbene A,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycoside from Polygonum cuspidatum.Organic Letters3(15),67467。
6、7.） 的 新化合物， 该化合物拥有全新的骨架类型， 还没发现其药理活性 （Fushuang Li,et al.,2013.Polyflavanostilbene A,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycoside from Polygonum cuspidatum.Organic Letters3(15),674677.） ， 对于本发明涉及的 Polyflavanostilbene A 在制备治疗白血病药物中的用途属于首次公开， 由于属于全新的 结构类型， 而且其对于治疗白血病活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示 的可能， 具备突出的实质性特点。
7、， 同时用于白血病的防治显然具有显著的进步。 发明内容 0004 本发明的目的在于根据现有Polyflavanostilbene A研究中未发现其具有治疗白 血病活性的报道的现状， 提供了Polyflavanostilbene A在制备治疗白血病药物中的应用。 0005 Polyflavanostilbene A 通过抑制白血病细胞 （HL-60 细胞） 增殖和诱导白血病细 胞 （HL-60 细胞） 凋亡， 来对白血病进行治疗。 0006 所述化合物 Polyflavanostilbene A, 结构如式 （） 所示 ： 0007 说 明 书 CN 103301141 A 3 2/4 页 4 。
8、0008 本发明涉及的Polyflavanostilbene A在制备治疗白血病药物中的用途属于首次 公开， 而且由于骨架类型属于全新的骨架类型 , 而且其对于白血病细胞的细胞毒性和凋亡 诱导的生物活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实 质性特点， 同时用于白血病的防治显然具有显著的进步。 具体实施方式 0009 本发明所涉及化合物 Polyflavanostilbene A 的制备方法参见文献 （Fushuang Li,et al.,2013.Polyflavanostilbene A,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycos。
9、ide from Polygonum cuspidatum.Organic Letters3(15),674677.） 0010 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权利要求加以限定。 0011 实施例 1 ： 本发明所涉及化合物 Polyflavanostilbene A 片剂的制备 ： 0012 取 20 克化合物 Polyflavanostilbene A, 加入制备片剂的常规辅料 180 克， 混匀， 常规压片机制成 1000 片。 0013 实施例 2 ： 本发明所涉及化合物 Polyflavanostilbene A 胶。
10、囊剂的制备 ： 0014 取 20 克化合物 Polyflavanostilbene A， 加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉 180 克， 混匀， 装胶囊制成 1000 粒。 0015 下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。 0016 试验例 ： Polyflavanostilbene A 抑制 HL-60 细胞增殖和诱导 HL-60 细胞凋亡 0017 1 材料和方法 0018 1.1 材料 RPMI1640 培养基购于 Gibco 公司 ； 四甲基偶氮唑盐 （MTT） 、 罗丹明 123 为 Sigma 公司产品 ； Caspase-3,9 分光光度法检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司 。
11、； 其他化 学试剂均为国产分析纯。 0019 1.2 细胞培养人早幼粒细胞性白血病细胞株 HL-60 购于中科院上海细胞生物研究 所， 培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液中， 青霉素 100kU/L， 链霉素 100mg/L， 37， 5%CO2， 饱和湿度培养箱内培养， 取对数生长期细胞进行实验。 0020 1.3 人外周血单个核细胞 （PBMC） 的分离 0021 无菌采集健康供者静脉血， 肝素抗凝 （每毫升全血加 0.1ml 的 200U/ml 肝素钠溶 液） ， PBS 等倍稀释血液， 1:4 加入人淋巴细胞分离液， 2000rpm 离心 20min， 收集乳白层后。
12、用 无血清 RPMI-1640 培养基 1500rpm10min 离心洗涤 2 次， 获得单个核细胞， 台盼蓝拒染率大 说 明 书 CN 103301141 A 4 3/4 页 5 于 95%， 重悬于 10%FCS 的 RPMI-1640 培养基中备用。 0022 1.4Polyflavanostilbene A 对 HL-60 细胞和人 PBMC 生长的影响 0023 接种HL-60细胞和人PBMC与96孔板， 每孔2104个细胞 （100ul） 。 37、 5%CO2条 件下培养 24h 后， 实验组一次加 0.625、 1.25、 2.5、 5.0、 10.0ug/mL 的 Polyf。
13、lavanostilbene A， 继续分别培养24、 48、 72h后， 终止培养， 设只加培养液的对照组， 每个剂量组设4个复孔。 实验结束前 4h， 每孔加入 20ul MTT 溶液 （5g/L） ， 继续孵育 4h， 终止培养， 小心吸弃上清液， 每孔加入 150uL DMSO， 震荡 10min， 选择 570nm 波长， 在自动酶联检测仪上测定各孔吸光度 （A） 值， 重复实验 3 次， 并计算其生长抑制率 （CI） 。CI=（阴性对照组 A 值 - 实验组 A 值） / 阴性对照组 A 值 100%。 0024 1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 0025 收集0、 2.5、 5.。
14、0、 10.0ug/mL Polyflavanostilbene A处理48h的各组细胞， PBS洗 涤 2 次， 加入预冷的 70% 乙醇于 -20固定 24h， 离心洗涤后加入 200uL PI 染液， 50ul RNA 酶， 4避光放置 20min， 1500rpm 离心 5min。调整细胞浓度为 1105 个 /ml 1106 个 / ml， 上流式细胞仪分析， 激发光源为氩离子激光， 激发波长为 488nm。 0026 1.6 统计学分析本实验结果应用统计分析 0027 软件 SPSS13.0 处理， 所有实验结果采用 xs 表示， 组间比较采用单因素方差分 析。 0028 2 结果。
15、 0029 2.1Polyflavanostilbene A 对 HL-60 细胞及 PBMC 生长的影响对照组 HL-60 细 胞 生 长 活 跃， 经 0.625、 1.25、 2.5、 5.0、 10.0ug/mL 的 HouttuynoidB 处 理 24、 48、 72h 后， HL-60 细胞生长均不同程度的减慢， 并呈时间、 浓度依赖性。在相同浓度下， 培养 72h Polyflavanostilbene A 对人 PBMC 几乎无抑制作用， 与 HL-60 细胞比较有显著性差异 （P0.05） （见表 1） 。 0030 表 1Polyflavanostilbene A 对 H。
16、L-60 细胞增殖的影响 （xs， n=4） 0031 0032 与 24h 比 较 *p0.05*p0.01 ； 与 48h 比 较 p0.05 p0.01 ； 与 72h 比 较 p0.05p0.01 0033 2.2 流式细胞术检测 HL-60 细胞凋亡 0034 HL-60 细胞与不同浓度的 Polyflavanostilbene A 作用 48h 后， 经流式细胞 说 明 书 CN 103301141 A 5 4/4 页 6 仪分析， 结果显示 G1 期峰前均出现了代表细胞凋亡的亚二倍体峰， 在一定浓度范围内 随 着 Polyflavanostilbene A 浓 度 增 升 高， 。
17、HL-60 细 胞 凋 亡 率 升 高， 其 中 10.0ug/mL Polyflavanostilbene A 作用 48h 凋亡率达到 （22.164.87） %（表 2） 。 0035 表 2Polyflavanostilbene A 作用 48h 后对 HL-60 细胞凋亡率的影响 （xs， n=3） 0036 0037 与阴性对照组比较 *p0.05,*p0.01 0038 结论 ： Polyflavanostilbene A 能够抑制白血病细胞 （HL-60 细胞） 增殖和诱导白 血病细胞 （HL-60 细胞） 凋亡， 因此， 可以用来对白血病进行治疗。 说 明 书 CN 103301141 A 6 。