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1、(10)授权公告号 CN 103223058 B (45)授权公告日 2014.12.03 CN 103223058 B (21)申请号 201310169292.7 (22)申请日 2013.05.08 A61K 31/704(2006.01) A61K 36/85(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 11/06(2006.01) A61P 11/14(2006.01) A61K 131/00(2006.01) (73)专利权人 南通大学 地址 226019 江苏省南通市啬园路 9 号 (72)发明人 陈广通 宋妍 杨雪 葛红娟 汪冬庚 黄金华 (74)专利代。
2、理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 汪旭东 黄琼， 等 . 微波法提取牡荆总黄酮的研 究 . 安徽农业科学 .2011, 第 39 卷 ( 第 18 期 ), 第 10857、 10921. 刘树根， 等 . 牡荆属植物的化学成分及其药 理作用与临床应用. 江西医药 .1984,(第6期), 第 40-49 页 . 黄琼， 等 . 微波法提取牡荆总黄酮的研 究 . 安徽农业科学 .2011, 第 39 卷 ( 第 18 期 ), 第 10857、 10921 页 . (54) 发明名称 牡荆子总黄酮提取物及其制备方法和医药用 途 (57) 摘要 本发明提供了一种牡荆子总黄酮提取物及。
3、其 制备方法和医药用途， 通过步骤 ：（1） 取牡荆子， 用水或醇或者醇水溶液作为提取溶剂回流提取 2 次， 合并提取液， 真空浓缩 ；（2） 将步骤 （1） 的浓缩 液用聚酰胺树脂柱层析， 先用水洗去杂质再用醇 或者醇水溶液进行洗脱， 收集洗脱液， 得到牡荆子 总黄酮提取物。本发明还提供了上述牡荆子总黄 酮提取物在制备预防和治疗哮喘病、 慢性阻塞性 肺病、 慢性支气管炎或感冒咳嗽药物中的应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 卢建伟 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图1页。
4、 (10)授权公告号 CN 103223058 B CN 103223058 B 1/1 页 2 1. 一种总黄酮含量为 83.72% 的牡荆子总黄酮提取物在制备预防和治疗哮喘病、 慢性 阻塞性肺病、 慢性支气管炎或感冒咳嗽药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103223058 B 2 1/5 页 3 牡荆子总黄酮提取物及其制备方法和医药用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 具体涉及一种牡荆子总黄酮提取物及其制备方法和医药用 途， 更具体是牡荆子总黄酮提取物在制备预防和治疗哮喘病、 慢性阻塞性肺病、 慢性支气管 炎或感冒咳嗽药物中的应用。 背景技术 0002 支气管哮喘是世界范。
5、围内最为常见的慢性呼吸道疾病。目前， 全球哮喘患者约 3 亿人， 中国哮喘患者约 3000 万。近年来， 因其患病率和死亡率均呈上升趋势， 已成为严重的 公共卫生问题而受到世界各国的极大关注。因此需要提供有效地治疗哮喘病的药物和方 法。 0003 目前对哮喘病的治疗还没有特效药。临床的治疗主要以应用支气管扩张剂为主， 有 2- 肾上腺素能受体拮抗剂类、 - 肾上腺素能受体拮抗剂类、 氨茶碱类、 胆碱能受体拮 抗剂类、 钙离子拮抗剂类、 钾离子通道激动剂、 糖皮质激素 (ICS)、 细胞膜稳定剂、 抗组胺药 物、 白三烯受体拮抗剂、 血小板活化因子拮抗剂、 特异性免疫治疗剂、 非特异性免疫治疗剂。
6、 等。1995 年出台了 “全球哮喘防治创议” 进一步推动和普及了糖皮质激素的应用。这些治 疗方法对缓解哮喘症状， 改善哮喘病人的生活质量有一定的效果， 但没有使哮喘病的发病 率和死亡率有所降低， 反而呈逐年增加的趋势。 治疗哮喘病需要更有效的和更安全的药物。 0004 慢性阻塞性肺病的发病机制尚未完全明了， 目前普遍认为以气道、 肺实质和肺血 管的慢性炎症为特征。临床采用长期吸入糖皮质激素抗炎治疗和吸入 2- 肾上腺素能受 体激动剂、 胆碱能受体拮抗剂等支气管扩张剂进行治疗。但这些药物的治疗效果并不是十 分理想， 寻找更有效的治疗慢性阻塞性肺病的药物是非常必要的。 0005 牡荆子为马鞭草科。
7、多年生植物牡荆 Vitex negundo L.var.cannabifolia(sieb. Et Zucc)Hand.Mazz 的带宿萼的果实， 亦叫小荆实，中药大辞典 、本草纲目 均记载 “牡荆 子味苦、 温， 无毒， 主除骨间寒热、 通利胃气、 止咳逆、 下气。 ” 具有祛痰止咳、 平喘理气和止痛 之功效。 文献记载， 牡荆属植物主要含有黄酮类、 二萜类、 环烯醚萜类、 三萜类等多种化学成 分。 0006 目前对牡荆子总黄酮提取物对研究较少， 文献 牡荆子乙醇提取物抗氧化活性的 研究（肖国珍等， 广东工业大学学报， 2006 年 9 月， 第 23 卷第 3 期， 31-35） 公开了一。
8、种牡荆 子乙醇提取物的制备方法， 牡荆子经 75烘干 3h， 粉碎过 40 目筛， 秤取 100g 置锥形瓶中， 加入 250ml 乙醇， 在恒温水浴锅中 60 65提取 60h， 并随时搅拌， 滤出浸取液减压蒸馏 浓缩， 真空干燥， 得膏状提取物， 浸膏中总黄酮含量为 11.52%。 0007 该提取物中黄酮含量较低， 成分复杂， 且对其活性研究仅停留在抗氧化活性层面， 临床药理意义不大， 尚无明确的药理活性报道。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种牡荆子总黄酮提取物及其制备方法和在制备预防和治 说 明 书 CN 103223058 B 3 2/5 页 4 疗哮喘病、 慢性阻塞性肺病。
9、、 慢性支气管炎或感冒咳嗽药物中的应用。 0009 本发明所提供的牡荆子总黄酮提取物是从中药牡荆子中提取的， 所述牡荆子是马 鞭草科植物牡荆的果实。 0010 本发明具体技术方案如下 ： 0011 一种牡荆子总黄酮提取物的制备方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 0012 （1） 取牡荆子， 用水或醇或者醇水溶液作为提取溶剂回流提取 2 次， 合并提取液， 真空浓缩 ； 0013 （2） 将步骤 （1） 的浓缩液用聚酰胺树脂柱层析， 先用水洗去杂质再用醇或者醇水溶 液进行洗脱， 收集洗脱液， 得到牡荆子总黄酮提取物。 0014 上述制备方法， 步骤 （1） 所述醇优选甲醇、 乙醇或者异丙醇， 所。
10、述醇水溶液优选甲 醇、 乙醇或者异丙醇的水溶液， 进一步优选醇水溶液中醇的体积百分比为 70%。 0015 上述制备方法， 步骤 （1） 中也可用其它溶剂如丙酮等进行提取制备。 0016 上述制备方法， 步骤 （1） 中优选将牡荆子粉碎后过 10 目筛再进行提取。 0017 上述制备方法， 步骤 （1） 中优选使用 70% 乙醇回流提取 2 小时， 共提取两次， 优选 将提取液真空浓缩至无醇味。 0018 上述制备方法， 步骤 （2） 中所述聚酰胺树脂选优选 60-100 目。 0019 上述制备方法， 步骤 （2） 所述醇优选甲醇、 乙醇或者异丙醇， 所述醇水溶液优选甲 醇、 乙醇或者异丙醇。
11、的水溶液， 进一步优选醇水溶液中醇的体积百分比为 70%。 0020 上述制备方法， 步骤 （2） 的优选方法 ： 以 2 倍柱体积每小时的上样流速加样品液进 行动态吸附。先用 4 倍柱体积的蒸馏水洗脱除去杂质， 弃去水洗脱液。再以 5 倍柱体积的 70% 乙醇溶液进行洗脱， 收集乙醇洗脱液， 真空浓缩至干， 得到牡荆子总黄酮提取物中总黄 酮含量为 83.72%。 0021 本发明还提供了一种牡荆子总黄酮提取物， 采用上述制备方法制备得到， 其中总 黄酮含量为 83.72%。 0022 本发明还提供了上述牡荆子总黄酮提取物在制备预防和治疗哮喘病、 慢性阻塞性 肺病、 慢性支气管炎或感冒咳嗽药物。
12、中的应用。 0023 本发明通过实验证实， 本发明的牡荆子总黄酮提取物具有治疗哮喘、 治疗慢性阻 塞性肺病 （COPD） 、 治疗慢性支气管炎、 抗过敏药理活性， 具有毒性小， 长期使用疗效较佳等 特点。 0024 本发明提供的牡荆子总黄酮， 可以与一种或多种药学上可接受的载体成分混合， 含牡荆子总黄酮的药物组合物中进一步含有 2- 肾上腺素能受体激动剂。 0025 本发明所述的应用， 牡荆子总黄酮提取物可以以单一药物的形式被给药或可以与 其它药物联合给药。 0026 本发明的牡荆子总黄酮提取物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。 药物组 合物包括作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐及可。
13、药用载体。较佳的， 本发明的 药物组合物有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的牡荆子总黄酮提取物。“可 药用载体” 不会破坏本发明的化合物或其可药用盐的药学活性， 同时其有效用量， 即能够起 药物载体作用时的用量对人体无毒。 0027 “可药用载体” 包括但不限于 ： 离子交换材料、 氧化铝、 硬脂酸铝、 卵磷脂、 自乳化药 说 明 书 CN 103223058 B 4 3/5 页 5 物传递系统 （SEDDS） 如d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、 吐温或其他类似聚合介质等药 物制剂用的表面活性剂、 血清蛋白如人血清白蛋白、 缓冲物质如磷酸盐、 氨基乙酸、 山梨酸、 山梨。
14、酸钾、 饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、 水、 盐、 电解质如硫酸盐精蛋白、 磷酸氢二钠、 磷酸氢钾、 氯化钠、 锌盐、 硅胶、 硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、 纤维素物质、 聚乙烯醇、 羧甲基纤 维素钠、 聚丙烯酸酯、 乙烯 - 聚氧乙烯 - 嵌段聚合物和羊毛脂、 环糊精如 -、 -、 - 环糊 精或其经化学修饰的衍生物如 2- 和 3- 羟丙基 - 环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性 衍生物等均可用于促进本发明的化合物、 其药用盐或前药的药物传递。 0028 其他可药用辅料如填充剂 （如无水乳糖、 淀粉、 乳糖珠粒和葡萄糖） 、 粘合剂 （如微 晶纤维素） 、 崩解剂 （如交联羧甲基淀粉钠、 交联羧。
15、甲基纤维素钠、 低取代羟丙基纤维素和交 联 PVP） 、 润滑剂 （如硬脂酸镁） 、 吸收促进剂、 香味剂、 甜味剂、 稀释剂、 赋形剂、 润湿剂、 溶剂、 增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。 0029 上述本发明的牡荆子总黄酮提取物以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径 给药。非肠道给药制剂包括注射剂、 霜剂、 软膏剂、 贴剂、 喷雾剂等。给药途径包括皮下、 皮 内、 动脉内、 静脉内、 肌内、 关节内、 滑液内、 胸骨内、 鞘内、 病灶内、 颅内注射或输注， 或者， 口 服、 局部、 直肠、 经鼻、 经颊、 阴道、 舌下、 皮内、 粘膜、 气管、 尿道给药， 或者通过吸入气雾或。
16、植 入蓄积或者针刺方式给药。 0030 上述本发明的牡荆子总黄酮提取物以及药物组合物的治疗有效量为 0.5mg/kg 100mg/kg 之间， 可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗， 为本领域技术人员能够理解 的范围。 附图说明 0031 图 1 为本发明所述牡荆子总黄酮提取物对离体豚鼠回肠试验的结果图 具体实施方式 0032 以下通过实施例说明本发明的具体步骤， 但不受实施例限制。 0033 在本发明中所使用的术语， 除非另有说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。 0034 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解， 这些实施例只 是为了举例说明本发明， 而非。
17、以任何方式限制本发明的范围。 0035 在以下实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 0036 实施例 1 牡荆子总黄酮提取物的制备 0037 取牡荆子 10kg， 粉碎后过 10 目筛， 用 70% 乙醇 60L 回流提取 2 小时， 滤取提取液， 药渣再加 70% 乙醇 45L 回流提取 2 小时， 滤取提取液， 合并提取液， 真空浓缩至无醇味， 加水 2L 搅拌溶解制得样品溶液。 0038 采用常规方法处理聚酰胺树脂60-100目 （购于台州路桥四甲生化塑料厂） ， 取处理 好的聚酰胺树脂 2.5Kg 装柱 (200mm1000mm)， 以 2 倍柱体积每小时的。
18、上样流速加样品液 进行动态吸附， 共加样品溶液 1L。先用 4 倍柱体积的蒸馏水洗脱除去杂质， 弃去水洗脱液。 再以 5 倍柱体积的 70% 乙醇进行洗脱， 收集乙醇洗脱液， 真空浓缩至干， 得到牡荆子总黄酮 提取物 0.24kg。经分光光度法测定总黄酮含量为 83.72%。 说 明 书 CN 103223058 B 5 4/5 页 6 0039 实施例 2 氨水引咳试验 0040 小鼠 40 只， 随机分为对照组、 牡荆子总黄酮提取物高剂量组 （400mg/kg） 、 牡荆子 总黄酮提取物中剂量组 （200mg/kg） 、 牡荆子总黄酮提取物低剂量组 （100mg/kg） ， 每组 10 只。
19、。灌胃给药后 1h 开始实验。每次取 1 只小鼠， 放入容积为 1L 的玻璃罩内， 内放一滤纸片 （22cm2） ， 将 0.3ml 的氨水滴到滤纸片上， 使小鼠在玻璃罩内刺激 30s， 取出后立即观察并 记录小鼠 2min 内咳嗽次数和咳嗽的潜伏期， 小鼠咳嗽的表现为腹肌收缩张口。灌胃 3h 后， 重复实验 1 次， 观察并记录。 0041 表 1 牡荆子总黄酮提取物对氨水引起的小鼠咳嗽抑制作用 0042 0043 注 ： *P 0.001 即有显著或非常显著差异。 0044 实验结果如表 1 所示， 牡荆子总黄酮提取物三个剂量组均能显著抑制氨水引起的 小鼠咳嗽次数和延长咳嗽的潜伏期， 作用。
20、强度与剂量效应呈正相关。 与对照组相比， 有显著 或非常显著差异。 0045 实施例 3 氯化乙酰胆碱加磷酸组胺盐吸入引喘试验 0046 取 200-250g 豚鼠 40 只， 雌雄各半， 置于 5000mL 容积的密闭玻璃烧杯内， 以超声雾 化器喷雾1%氯化乙酰胆碱和0.2%磷酸组胺盐等容积混合液10s。 立即取出豚鼠， 观察豚鼠 的引喘潜伏期 ( 从喷雾开始到哮喘发作、 呼吸极度困难， 直至抽搐跌倒的时间 )。然后将豚 鼠随机分为对照组、 牡荆子总黄酮提取物高剂量组 （400mg/kg） 、 牡荆子总黄酮提取物中剂 量组 （200mg/kg） 、 牡荆子总黄酮提取物低剂量组 （100mg/。
21、kg） ， 每组 10 只。分别在给药后 1h 及 3h 进行引喘， 观察引喘潜伏期。两分钟以上不喘者引喘潜伏期以 120s 计。 0047 表 2 牡荆子总黄酮提取物对药物引豚鼠喘的影响 0048 0049 注 ： *P0.001 即有显著性差异。 0050 试验结果如表 2 所示， 牡荆子总黄酮提取物三个剂量组均能显著延长豚鼠的抽搐 潜伏期， 与空白对照组相比差异有显著性意义， 表明牡荆子总黄酮提取物具有显著的平喘 说 明 书 CN 103223058 B 6 5/5 页 7 作用， 且其作用随剂量的增加而增强。 0051 实施例 4 离体豚鼠回肠试验 0052 取 300g 左右豚鼠， 。
22、将它头部敲昏， 动脉放血处死。取大约 6ml 左右的回肠一段， 悬 挂于盛有台氏液的麦氏浴槽中， 恒温 370.5， 一端系在 L 型通气管上， 加以固定， 从浴槽 底部通人氧气， 每分钟 15-20 个气泡， 另一端固定在压力换能器上预置负荷 2g， 平衡 30min 后， 描记正常肠肌收缩曲线。用乙酰胆碱 (110-3g/L) 的收缩曲线作为对照， 冲洗 3 次， 加 入本发明所述牡荆子总黄酮提取物(1010-3g/L)作用5分钟后加等量的乙酰胆碱， 描记收 缩曲线并与对照曲线比较， 结果如图 1 所示 （A乙酰胆碱对回肠的影响， B. 牡荆子总黄酮 作用 5 分钟后乙酰胆碱对回肠的影响） 。结果表明本发明所述牡荆子总黄酮提取物可显著 缓解乙酰胆碱引起的离体回肠收缩反应。 说 明 书 CN 103223058 B 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103223058 B 8 。