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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410150890.4 (22)申请日 2014.04.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103948935 A (43)申请公布日 2014.07.30 (73)专利权人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市黄埔大道西601 号 (72)发明人 刘杰 杨丽聪 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 陈燕娴 (51)Int.Cl. A61K 47/54(2017.01) A61K 33/04(2006.01。
2、) A61K 33/24(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (56)对比文件 CN 101040869 A,2007.09.26, CN 101040869 A,2007.09.26, Licong Yang et al Se/Ru nanoparticles as inhibitors of metal- induced A aggregation in Alzheimer“s disease . J. Mater. Chem. B .2014,摘要. 审查员 吴铁生 (54)发明名称 抑制A及金属离子诱导其聚集的纳米粒子 及制备和应用 (57)摘要 本发明属于纳米药。
3、物技术领域， 公开了一种 抑制A及金属离子诱导A聚集的纳米粒子及 其制备方法和应用。 该纳米粒子为Y修饰的纳米 钌和/或硒粒子， Y为精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗 糖、 维生素C和没食子酸中的至少一种。 本发明制 备的Y修饰纳米粒子包括了纳米钌、 纳米硒、 复合 纳米硒/钌， 该纳米粒子不仅能抑制A的自发聚 集， 而且具有抑制金属离子所诱导A多肽聚集 的作用， 可应用于制备抗阿尔兹海默综合症药物 中。 本发明制备的维生素C和没食子酸修饰的纳 米粒子是直接以维生素C和没食子酸为还原剂与 修饰剂， 制备过程无需添加其它辅助试剂、 产物 体系简单， 操作简单， 方法简易， 产品可直接保存 和使用。
4、。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 103948935 B 2017.08.11 CN 103948935 B 1.一种纳米粒子在制备抗阿尔兹海默综合症药物中的应用， 其特征在于， 该纳米粒子 为精氨酸修饰的纳米硒粒子， 或精氨酸修饰的纳米钌硒粒子。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述纳米粒子的制备方法包括以下步骤： 将精氨酸与Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液B， 滴加硼氢化钠， 冷却静置， 离心， 得到纳米粒 子。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述精氨酸溶液的浓度为0.0250.1mol/ L。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于：。
5、 所述溶液B配置时所用Na2SeO3的浓度为 0.1mol/L。 5.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述溶液B配置时所用RuCl3的浓度为0.025 0.1mol/L。 6.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述溶液B中， Na2SeO3和RuCl3的摩尔浓度 比为1.5:13:1。 7.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所用精氨酸的量与Na2SeO3和RuCl3总量的 摩尔比为1:16:1。 8.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述溶液B中， Na2SeO3和RuCl3的摩尔浓度 比为2:1； 所用精氨酸的量与Na2SeO3和RuCl3总量的摩尔比为4:。
6、1。 9.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所用硼氢化钠的浓度为0.0250.8mol/L， 所用硼氢化钠与精氨酸的摩尔比为1:16:1； 所述冷却静置指冷却至室温放置1224h。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103948935 B 2 抑制A 及金属离子诱导其聚集的纳米粒子及制备和应用 技术领域 0001 本发明属于纳米药物技术领域， 特别涉及一种抑制A 及金属离子诱导A 聚集的纳 米粒子及其制备方法和应用。 背景技术 0002 阿尔茨海默病 （AD） 是一种以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性 疾病， 亦称老年痴呆症。 AD多发于老年群体， 60岁以上人群中。
7、AD的患病率约为510%， 而在 85岁以上人群中AD的患病率急剧增加， 高达4050%。 随着人口的老龄化的加剧及缺乏有效 的预测与治疗的手段， AD患者数量一直在增加， 预计到2050年全球AD患者数量将达到1.15 亿。 AD患者的平均生存期仅为5.5年， 该病已成为继心脏病、 癌症、 中风之后， 导致老年人死 亡的第四大病因。 临床上根据AD症状所研发的治疗AD的药物带来的效果总是喜忧参半， 例 如目前已进入临床应用乙酰胆碱酯酶抑制剂及N-甲基-D-天冬氨酸 （NMDA） ， 虽然这些药物 能适度减轻AD症状或减缓认知能力的下降， 但却不能终止AD的病理进程。 因此， 根据AD的发 病。
8、机理研制新型的抗AD药物具有重大意义。 0003 AD患者的大脑所表现出的特征如大脑体积的缩小、 海马和新皮质的神经元和突触 减少、 细胞外出现淀粉样蛋白 （A ） 聚集形成的老年斑及细胞内磷酸化Tau蛋白形成的神经 原纤维缠结。 其中， A 聚集形成的淀粉样斑块是一个行之有效的AD神经病理学标志。 目前的 淀粉样蛋白级联假说认为在正常人体体内， A 的产生和清除存在一个平衡， 而在AD患者体 内， 这一平衡被打破导致A 沉积的形成。 A 是由3643个氨基酸组成的多肽， 是APP经过水 解生成的天然代谢产物。 APP经过 和分泌酶降解所产生的A 是可溶的， 而经过 和分泌 酶降解所产生的A 。
9、1-40/42是AD患者脑部A 聚集形成的老年斑的主要成分。 A 1-40的含量 约占A 总量的90%， 但是A 1-42比A 1-40更容易聚集且对神经细胞的毒性较大。 A 聚集形成 的老年斑在AD发生和发展中起关键作用， 因此， 降低A 多肽在AD患者脑部的沉积对治疗AD 具有非常重要的意义。 0004 A 可自发聚集成多种形态的聚集体， 一种是由26多肽聚集形成的可溶性寡聚 体， 这也是形成纤维前的中间形态， 另一种便是形成 -折叠片层结构的不可溶纤维， 这是A 斑块的主要形态。 A 聚集形成纤维受多种因素影响， 如金属离子、 pH值、 A 多肽浓度及其他 蛋白质等。 其中金属离子是诱导。
10、A 聚集的重要因素之一。 在AD患者脑部A 斑块中部分金属 离子的浓度显著增加。 特别是， 过渡金属锌、 铜、 铁等不仅可诱导A 形成 折叠还同A 的神经 毒性相关。 研究发现铜离子可与A 上的His结合， 使其形成组氨酸桥， 这种铜-A 复合物具有 很强的神经毒性。 而另一方面， 具有氧化还原性的铜离子与A 结合后催化H2O2的形成。 过量 的H2O2渗透过细胞膜， 如果未催化分解将形成反应性高的羟基自由基， 导致DNA损伤、 脂质过 氧化等氧化损伤。 由于A 1-42对铜离子有更高的结合亲和力， 因而A 1-42比A 1-40更容易 聚集。 0005 根据以上研究， 减少A 斑块中金属离子。
11、的含量及金属离子同A 多肽结合是抑制金 属离子诱导的A 多肽聚集的2个主要方法。 通过金属螯合剂抑制金属离子诱导的A 多肽聚 说 明 书 1/6 页 3 CN 103948935 B 3 集的是治疗AD的有效方法。 特别是氯碘喹啉 （CQ） 及其衍生物PBT2不仅能抑制锌、 铜离子诱 导的A 多肽聚集、 减小A 斑块及ROS的产生， 而且能提高AD小鼠的认知能力。 然而， 大部分的 金属螯合剂无法透过血脑屏障， 另外， 金属螯合剂对金属离子的螯合不具有选择性， 这将螯 合身体内一些必须的金属离子从而产生毒副作用。 发明内容 0006 为了克服上述现有技术的缺点与不足， 本发明的首要目的在于提供。
12、一种抑制A 及 金属离子诱导A 聚集的纳米粒子。 0007 本发明另一目的在于提供一种上述抑制A 及金属离子诱导A 聚集的纳米粒子的 制备方法。 0008 本发明再一目的在于提供上述抑制A 及金属离子诱导A 聚集的纳米粒子在制备 抗阿尔兹海默综合症药物中的应用。 0009 本发明的目的通过下述方案实现： 0010 一种抑制A 及金属离子诱导A 聚集的纳米粒子， 该纳米粒子为Y修饰的纳米钌和/ 或硒粒子， Y为精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗糖、 维生素C和没食子酸中的至少一种。 0011 上述抑制A 及金属离子诱导A 聚集的纳米粒子的制备方法， 当Y为维生素C或没食 子酸时， 包括以下步骤： 。
13、0012 把Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液A， 滴加Y溶液， 冷却静置， 离心， 得到纳米粒子。 0013 当Y为精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖或蔗糖时， 包括以下步骤： 0014 将Y与Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液B， 滴加硼氢化钠， 冷却静置， 离心， 得到纳米粒 子。 0015 所述Y溶液的浓度为0.0250.1mol/L。 0016 所述溶液A或溶液B配置时所用Na2SeO3的浓度为0.1mol/L。 0017 所述溶液A或溶液B配置时所用RuCl3的浓度为0.0250.1mol/L。 0018 优选地， 所述溶液A或溶液B中， Na2SeO3和RuCl3的摩尔浓度比为1。
14、.5:13:1。 0019 优选地， 所述溶液A或溶液B中， Na2SeO3和RuCl3的摩尔浓度比为2:1。 0020 所用Y的量与Na2SeO3和RuCl3总量的摩尔比为1:16:1。 0021 优选地， 所用Y的量与Na2SeO3和RuCl3总量的摩尔比为4:1。 0022 所用硼氢化钠的浓度为0.0250.8mol/L， 所用硼氢化钠与Y的摩尔比为1:16: 1。 0023 所述冷却静置指冷却至室温放置1224h。 0024 优选地， 所述溶液A在滴加Y溶液前加热至3040。 0025 优选地， 离心后所得纳米粒子用纯水洗涤。 上述配置溶液均采用纯水配置即可。 0026 上述抑制A 及。
15、金属离子诱导A 聚集的纳米粒子在制备抗阿尔兹海默综合症药物 中的应用。 0027 本发明制备得到不同修饰剂的纳米钌和/或硒粒子， 利用其与A 多肽上的金属离 子结合位点， 从而干预金属离子同A 多肽的结合， 抑制金属离子诱导A 多肽的聚集。 研究发 现蛋白质结合到纳米表面后构象会发生变化这将影响了蛋白聚集过程。 现有研发所发现的 能同A 蛋白结合的纳米材料分为无机纳米粒子 （纳米金、 磁性纳米粒子及量子点等） 、 高分 说 明 书 2/6 页 4 CN 103948935 B 4 子纳米材料和碳为基础的纳米材料 （富勒烯、 碳纳米管、 石墨烯） 等。 这些纳米材料能有效地 抑制A 多肽的聚集，。
16、 其抑制作用主要是由于纳米有着较大比表面积及较强的吸附能力， 当 纳米与多肽结合后可能覆盖了位于蛋白质中央疏水性活性位点同时也减少了溶液中的淀 粉样蛋白的浓度， 从而抑制了A 多肽的纤维化聚集。 纳米的修饰剂、 纳米粒径及表面电荷均 会影响纳米同A 多肽的结合。 采用不同修饰剂可修饰出不同粒径及电荷的纳米， 并通过研 究不同修饰剂制备得到的纳米粒子的性能， 确定修饰剂、 纳米粒径及表面电荷对于纳米同A 多肽的结合能力的影响， 本发明利用精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗糖、 维生素C和没食子酸修 饰的纳米粒子， 具有明显优异的抑制金属离子所诱导A 多肽聚集的作用， 可应用于制备抗 阿尔兹海默综合。
17、症药物中。 0028 本发明相对于现有技术， 具有如下的优点及有益效果： 0029 （1） 本发明制备的Y修饰纳米粒子包括了纳米钌、 纳米硒、 复合纳米硒/钌， 该Y修饰 纳米粒子不仅能抑制A 的自发聚集， 而且具有抑制金属离子所诱导的A 多肽聚集的作用， 可应用于制备抗阿尔兹海默综合症药物。 0030 （2） 本发明制备的维生素C和没食子酸修饰的纳米粒子是直接以维生素C和没食子 酸为还原剂与修饰剂， 制备过程无需添加其它辅助试剂、 产物体系简单， 精氨酸、 组氨酸、 葡 萄糖、 蔗糖作为修饰剂， 可以提高纳米的生物相容性， 另外， 所修饰的纳米钌的稳定性高。 操 作简单， 方法简易， 产品可。
18、直接保存和使用。 附图说明 0031 图1是精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌形貌图。 0032 图2是精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌与A 40多肽结合的透射电镜 图。 0033 图3是精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌对锌离子诱导的A 40多肽聚 集体神经毒性的抑制作用。 0034 图4是精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌抑制锌离子诱导A 40多肽聚 集的原子力图。 0035 图5是精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌减少聚集A 40多肽所引起的 神经细胞凋亡的结果图。 具体实施方式 0036 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。
19、， 但本发明的实施方式不限 于此。 0037 下列实施例中所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可， 来源均可从市场购得。 0038 实施例1： 精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的制备 0039 （1） 称取0.1729g亚硒酸钠， 用蒸馏水定容至10mL配制成0.1mol/L储存液； 同时称 取0.0435g精氨酸， 用蒸馏水定容至10mL配制成0.025mol/L储存液； 称取0.0259g三氯化钌， 用蒸馏水定容至5mL配制成0.025mol/L储存液。 0040 （2） 取0.2mL亚硒酸钠储备液与不同比例精氨酸混合， 在400rpm/min的条件下逐渐 滴加不同比例的硼氢化钠。
20、， 颜色转变为砖红色后停止搅拌， 说明已还原出纳米硒， 亚硒酸钠 说 明 书 3/6 页 5 CN 103948935 B 5 与精氨酸或硼氢化钠的摩尔比分别为1:1、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6。 其中， 精氨酸修饰的纳米 硒中亚硒酸钠与精氨酸的摩尔比为1:4的样品最稳定， 而亚硒酸钠与硼氢化钠的摩尔比为 1:4。 将上述溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上清液， 洗涤， 定容至10mL， 得到2mM精氨酸 修饰的纳米硒。 通过TEANAI-10型透射电子显微镜 （TEM） 观察， 如图1A所示。 得到纳米粒子的 分散体系， 其粒径在110nm左右。 该纳米粒子能在室。
21、温下稳定存在， 容易保存。 0041 （3） 精氨酸修饰的纳米钌的步骤与 （2） 相似， 即取0.4mL三氯化钌储备液与不同比 例精氨酸混合， 在400rpm/min的条件下逐渐滴加不同比例的硼氢化钠， 颜色转变为青灰色 后停止搅拌， 最终三氯化钌与精氨酸的摩尔比分别为1:1、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6。 精氨酸修 饰的纳米钌中三氯化钌与精氨酸的摩尔比为1:4时最稳定， 亚硒酸钠与硼氢化钠的摩尔比 同样为1:4。 该溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上清液， 洗涤， 定容至10mL， 得到2mM精氨 酸修饰的纳米钌。 通过TEANAI-10型透射电子显微镜 （TEM）。
22、 观察， 如图1B所示。 得到纳米粒子 的分散体系， 其粒径在30nm左右。 该纳米粒子在室温下稳定存在。 0042 （4） 取0.2mL亚硒酸钠与0.4mL三氯化钌储备液及精氨酸 （精氨酸与亚硒酸钠和三 氯化钌两者总量和摩尔比为4:1） 混合加热到40， 随后在400rpm/min的条件下按步骤 （2） 与 （3） 优选出的还原剂最佳比例 （硼氢化钠与亚硒酸钠和三氯化钌两者总量和摩尔比为4: 1） 滴加进入硼氢化钠储备液。 优选出精氨酸修饰的复合纳米硒/钌中硒与钌的摩尔比为2: 1。 该溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上清液， 洗涤， 定容至10mL， 得到2mM精氨酸修饰的 复合纳米。
23、硒/钌。 通过TEANAI-10型透射电子显微镜 （TEM） 观察， 如图1C所示。 得到纳米粒子 的分散体系， 其粒径在90nm左右。 该纳米粒子能在室温下稳定存在， 容易保存。 0043 组氨酸、 葡萄糖或蔗糖修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的制备步骤同上， 除试剂由精氨酸换为上述试剂。 0044 实施例2： 没食子酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的制备 0045 （1） 称取0.1729g亚硒酸钠， 用蒸馏水定容至10mL配制成0.1mol/L储存液； 同时称 取0.0425g没食子酸， 用蒸馏水定容至10mL配制成0.025mol/L储存液； 称取0.0259g三氯化 钌。
24、， 用蒸馏水定容至5mL配制成0.025mol/L储存液。 0046 （2） 取0.2mL亚硒酸钠储备液， 在400rpm/min的条件下逐渐滴加不同比例的没食子 酸， 颜色转变为砖红色后停止搅拌， 说明已还原出纳米硒， 最终亚硒酸钠与没食子酸的摩尔 比分别为1:1、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6。 其中， 没食子酸修饰的纳米硒中亚硒酸钠与没食子酸 的摩尔比为1:4的样品最稳定。 将上述溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上清液， 洗涤， 定 容至10mL， 得到2mM没食子酸修饰的纳米硒。 该纳米粒子能在室温下稳定存在， 容易保存。 0047 （3） 没食子酸修饰的纳米钌。
25、的步骤与 （2） 相似， 即取0.4mL三氯化钌储备液， 在 400rpm/min的条件下逐渐滴加不同比例的没食子酸， 颜色转变为青灰色后停止搅拌， 最终 三氯化钌与没食子酸的摩尔比分别为1:1、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6。 没食子酸修饰的纳米钌 中三氯化钌与没食子酸的摩尔比为1:4时最稳定。 该溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上 清液， 洗涤， 定容至10mL， 得到2mM没食子酸修饰的纳米钌。 该纳米粒子在室温下稳定存在。 0048 （4） 取0.2mL亚硒酸钠与0.4mL三氯化钌储备液混合加热到40， 随后在400rpm/ min的条件下按步骤 （2） 与 （。
26、3） 优选出的还原剂最佳比例 （没食子酸与两者总量和摩尔比为 4:1） 滴加进入没食子酸储备液。 优选出没食子酸修饰的复合纳米硒/钌中硒与钌的摩尔比 为2:1。 该溶液在4下放置12h， 离心分离， 弃上清液， 洗涤， 定容至10mL， 得到2mM没食子酸 说 明 书 4/6 页 6 CN 103948935 B 6 修饰的复合纳米硒/钌。 该纳米粒子能在室温下稳定存在， 容易保存。 0049 维生素C修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的制备方法同上。 0050 实施例3： Y修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌与A 1-40多肽结合 0051 先取30 M A 40（购自上海GL Bi。
27、ochem Ltd.公司） 在37下孵育3天形成纤维状聚 集， 随后往该样品中分别加入60 g/mL实施例1和实施例2制备得到的修饰并用罗丹明B标记 的纳米粒子再孵育6h。 取10 L的上述溶液滴在表面经过正电荷处理的玻片， 待样品干燥后， 通过激光共聚焦显微镜下观察。 结果表明， 本发明制备得到的精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗 糖、 维生素C和没食子酸分别修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌均可与A 40多肽结合， 其中纳米钌及复合纳米硒/钌与多肽结合的量比纳米硒多， 说明纳米钌及复合纳米硒/钌与 多肽的结合能力大于纳米硒。 0052 其中， 精氨酸修饰的纳米硒 （SeNPs） 、 纳米。
28、钌 （RuNPs） 及复合纳米硒/钌 （Se/RuNPs） 与A 1-40多肽结合的TEM扫描结果如图2所示。 0053 实施例4： Y修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌对锌离子诱导的A 40多肽聚集 体神经毒性的抑制作用 0054 本实验中PC12细胞购自ATCC公司， 培养条件为添加了5%马血清、 10%牛血清的DMEM 培养基， 5%CO2， 37条件下。 0055 MTT测试方法 0056 30 M A 40多肽分别与60 M实施例1和实施例2制备得到的修饰纳米硒、 纳米钌及复 合纳米硒/钌在PBS， 37条件下孵育3天； 取处于对数生长期的肿瘤细胞， 调整活细胞浓度 为2104/。
29、mL加于96孔培养板， 每孔100 L， 在培养箱中培养24h待贴壁后， 分别加入不同孵 育样品， 加样组和对照组均设6个复孔， 置37， 5%CO2培养72h， 然后加入MTT （5mg/mL） 20 L/ 孔， 5h后离心弃上清液， 加入二甲基亚砜 （DMSO） 100 L/孔， 振荡10min左右， 用酶标仪在 570nm波长下测定OD值， 计算细胞存活率。 0057 细胞存活率 （%） =加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值； 0058 结果表明， 本发明制备得到的精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗糖、 维生素C和没食子酸 分别修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的细胞毒性都很低， 。
30、细胞存活率达91%。 0059 其中， 精氨酸修饰的纳米硒 （SeNPs） 、 纳米钌 （RuNPs） 及复合纳米硒/钌 （Se/RuNPs） 的结果见图3， 本发明中精氨酸修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌的细胞毒性都很低， 而复合纳米硒/钌能有效地抑制锌离子诱导的A 40多肽聚集体神经毒性， 相比于对照组， 细 胞存活率达91%。 0060 实施例5： 透射电镜观察Y修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌抑制锌离子诱导 A 40多肽聚集形态的变化 0061 在50mM PBS， pH7.4溶液中， 30 M A 40多肽分别与60 M Zn(Ac)2或/与60 g/mL实施 例1和实施。
31、例2制备得到的修饰纳米粒子在37条件下孵育3天。 取10 L上述孵育溶液滴在 新劈开的云母片上， 等样品半干的时候， 用蒸馏水轻轻冲洗云母片， 在室温中过夜干燥。 样 品通过Hitachi-7650透射电子显微镜观察。 孵育3天后， 单独的A 40多肽形成明显可辨的纤 维状聚集， 而锌离子能显著增加A 40多肽聚集的量， 而本发明的精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗 糖、 维生素C和没食子酸分别修饰的纳米硒、 纳米钌及复合纳米硒/钌均明显表现为抑制锌 离子诱导的A 40多肽聚集， 其中， 修饰的复合纳米硒/钌效果最显著， 在该组中， A 40多肽仅 说 明 书 5/6 页 7 CN 103948。
32、935 B 7 形成短的纤维。 说明本发明制备得到的复合纳米硒/钌能结合于A 40多肽并有效地减少锌离 子与多肽的结合从而抑制锌离子诱导的A 40多肽聚集。 0062 其中， 精氨酸修饰的纳米硒 （SeNPs） 、 纳米钌 （RuNPs） 及复合纳米硒/钌 （Se/RuNPs） 的结果见图4。 0063 实施例6： Y修饰的纳米硒减少聚集A 40多肽所引起的神经细胞凋亡 0064 在12孔培养板中各孔放置一片高温灭菌过的玻片， 取对数生长期的PC12细胞用 0.1%胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬浮液， 调整细胞浓度为1105个/mL， 接种于玻片上， 在 超净工作台上放置40min， 添加1mL培。
33、养基， 置培养箱中培养。 待细胞贴壁后加入事先孵育好 的A 40多肽及锌离子或本发明的修饰纳米粒子的样品 （孵育步骤同例4） 。 48h后， 将玻片取 出， 用多聚甲醛固定， 按TUNEL试剂盒说明书上的要求进行染色， 最后用DAPI染色15min便可 Nikon Eclipse TE2000-E荧光显微镜下观察凋亡的细胞量。 凋亡的细胞核被染成绿色， 正 常的细胞核被染成蓝色。 结果显示， 锌离子与A 40多肽共同孵育样品组凋亡细胞的数量显著 高于单独A 40多肽组， 而本发明的精氨酸、 组氨酸、 葡萄糖、 蔗糖、 维生素C和没食子酸分别修 饰的纳米硒、 纳米钌及纳米硒/钌能显著减少锌离子所。
34、诱导的A 40多肽的神经毒性， 其中， 复 合纳米硒/钌的凋亡细胞数量最少。 0065 精氨酸修饰的纳米硒 （SeNPs） 、 纳米钌 （RuNPs） 及复合纳米硒/钌 （Se/RuNPs） 的观 察图如图5所示， 纳米硒部分减少凋亡细胞的数量， 说明复合纳米硒/钌抑制锌离子诱导的A 40多肽聚集的能力优于纳米硒。 0066 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 103948935 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 103948935 B 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 103948935 B 10 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 103948935 B 11 。