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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710655234.3 (22)申请日 2017.08.03 (71)申请人 福建医科大学孟超肝胆医院 地址 350025 福建省福州市鼓楼区西洪路 312号 (72)发明人 刘景丰 刘小龙 林心怡 曾永毅 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限 公司 33246 代理人 冷红梅 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2006.01) A61K 47/04(2006.01) A61K 47/32(2006.01) A61K 45/06(2006.01) A6。
2、1P 35/00(2006.01) C07D 311/16(2006.01) C01B 33/18(2006.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种光响应性氧化硅纳米载体及其制备方 法 (57)摘要 本发明属于非病毒基因载体及药物/光敏剂 载体技术领域， 具体涉及以氧化硅纳米颗粒为基 质， 利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒， 引入 具有紫外/近红外光响应的光敏基团， 以原子转 移自由基聚合(ATRP)法构建的多功能纳米载体 及其制备方法。 该多功能纳米载体在HepG2、 COS7、 293、 C6、 Hela等细胞中具有高。
3、于国际 “金 标” PEI的转染效率， 并且具有光响应释放基因的 性能。 在光刺激下， 氧化硅纳米颗粒表面光敏基 团光解使阳离子脱落从而释放基因， 可大大提高 基因转染效率。 此外， 介孔氧化硅纳米颗粒的多 孔结构可以装载多种不同药物或光敏剂分子， 为 新型光响应性纳米载体的开发打下了良好的实 验基础。 本方法使用方法简单， 具有商业化潜力。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 107569682 A 2018.01.12 CN 107569682 A 1.一种光响应性氧化硅纳米载体， 由如下方法制备得到： (1)氧化硅纳米颗粒HNP先与3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES反应， 得到氨基。
4、功能化氧化 硅纳米颗粒HNP-NH2； (2)HNP-NH2与丁二酸酐SA反应， 得到羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH； (3)将HNP-COOH溶于氯化亚砜进行活化反应， 得到酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒HNP- COCl； (4)HNP-COCl与光敏基团4-溴甲基-7羟基-香豆素Cou反应， 得到光敏基团功能化的氧 化硅纳米颗粒HNP-Cou； (5)HNP-Cou与2-溴异丁酸反应， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发剂HNP- Cou-Br； (6)HNP-Cou-Br加入单体和配体， 以及溴化铜或溴化亚铜， 引发活化自由基聚合反应， 获得光响应性氧化硅纳米载体； 所述的。
5、单体为下列之一： 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 甲基丙 烯酸缩水甘油醚、 N-异丙基丙烯酰胺中的一种或几种； 所述的配体为下列之一： 2,2-联吡 啶、 1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、 五甲基二乙烯三胺、 4,4-联吡啶。 2.如权利要求1所述的光响应性氧化硅纳米载体， 其特征在于所述氧化硅纳米颗粒的 形貌为实心球、 空心球或纳米棒。 3.权利要求1所述的光响应性氧化硅纳米载体的制备方法， 所述方法包括： 1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒： 先将乙醇与水混合均匀， 然后加入 3-氨丙基三乙氧基硅烷充分混合， 再加入氧化硅纳米颗粒分散均匀后080反应110h， 最后加入三。
6、乙胺， 080继续反应1248h， 将所得产物用甲醇、 乙醇、 或水离心洗涤， 真空 干燥， 100150高温固化16h， 得到氨基功能化氧化硅纳米颗粒HNP-NH2； 2)制备羧基功能化的氧化硅纳米颗粒： 将氨基功能化氧化硅纳米颗粒HNP-NH2溶于有机 溶剂， 逐滴加入丁二酸酐的有机溶剂， 再加入三乙胺， 050反应048h； 产物用甲醇离心 洗涤， 真空干燥， 得到羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH； 3)制备酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒： 将羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH溶于 氯化亚砜， 570搅拌0.55h， 真空干燥， 得到酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COC。
7、l； 4)制备光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒： 将酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COCl 和4-溴甲基-7羟基-香豆素Cou溶于有机溶剂， 再加入三乙胺， 050反应1072h； 产物分 别用乙醇和水离心洗涤， 真空干燥， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou； 5)制备氧化硅纳米颗粒引发剂： 先将光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou溶于 有机溶剂， 然后加入2-溴异丁酸、 碳酸钾， 050反应10-48h； 产物用体积比为0.12： 1的 甲醇与水混合溶剂离心洗涤， 真空干燥， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发剂 HNP-Cou-Br； 6)ATRP聚合反应： 。
8、在无氧环境下先将光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发剂HNP- Cou-Br溶于水， 然后加入有机溶剂、 单体， 再加入配体， 最后加入溴化铜或溴化亚铜引发活 性可控自由基聚合， 反应温度为060， 反应时间为l200min， 聚合反应完成后加入水或 者暴露在空气中， 使引发体系失活和终止聚合， 然后放入截留分子量为2500-4500MW的透析 袋中， 在去离子水中透析； 最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分， 即得所述光 响应性氧化硅纳米载体； 所述的单体为下列之一： 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 甲基丙烯酸缩 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 107569682 A 2 水甘油醚。
9、、 N-异丙基丙烯酰胺中的一种或几种； 所述的配体为下列之一： 2,2-联吡啶、 1,1, 4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、 五甲基二乙烯三胺、 4,4-联吡啶。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的氧化硅纳米颗粒的形貌为实心球、 空 心球、 纳米棒。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述的实心球形貌的氧化硅纳米颗粒按如下 方法制备得到： 将0.012g十六烷基三甲基溴化铵溶于50500mL水， 再加入0.25mL浓度 为0.55M的NaOH溶液， 搅拌均匀后加入0.55mL正硅酸乙酯， 27150下剧烈搅拌反应1 10h； 产物离心收集， 27100干燥， 4。
10、00600煅烧324h以去除模板， 获得所述实心 球形貌的氧化硅纳米颗粒。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述的空心球形貌的氧化硅纳米颗粒按如下 方法制备得到： 将0.012g十六烷基三甲基溴化铵溶于50500mL水， 加入0.011g全氟辛 酸， 再加入0.25mL浓度为0.55M的NaOH溶液， 搅拌均匀后加入0.55mL正硅酸乙酯， 27 150下剧烈搅拌反应110h； 产物离心收集， 27100干燥， 400600煅烧324h以 去除模板， 获得所述空心球形貌的氧化硅纳米颗粒。 7.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述的纳米棒形貌的氧化硅纳米颗粒按如下 方法制备得。
11、到： 将0.012g十六烷基三甲基溴化铵溶于30300mL水， 加入0.520mL浓度 为2.525wt的氨水， 最后加入0.55mL正硅酸乙酯， 2540下搅拌反应112h； 产物 离心收集， 27100干燥， 400600煅烧324h以去除模板， 获得所述纳米棒形貌的氧 化硅纳米颗粒。 8.如权利要求37之一所述的方法， 其特征在于， 所述4-溴甲基-7羟基-香豆素制备方 法如下： 将1,3-苯二酚、 溴代乙酰乙酸乙酯加入50-80浓H2SO4中， 25-50反应5-24h； 反应 后加入蒸馏水， 过滤， 真空干燥， 得到所述4-溴甲基-7羟基-香豆素。 9.如权利要求37之一所述的方法，。
12、 其特征在于， 所述的有机溶剂选自砜类、 亚砜类、 酰胺类、 醇类中的一种或几种。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107569682 A 3 一种光响应性氧化硅纳米载体及其制备方法 (一)技术领域 0001 本发明属于非病毒基因载体及药物/光敏剂载体技术领域， 具体涉及以氧化硅纳 米颗粒为基质， 利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒， 引入具有紫外/近红外光响应的光敏 基团， 以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建的多功能纳米载体及其制备方法。 (二)背景技术 0002 近年来， 恶性肿瘤成为威胁人类生命健康的主要杀手， 恶性肿瘤的治疗已经成为 亟待解决的世界性难题， 具有极其重要的战。
13、略意义。 目前临床上常用的肿瘤治疗方法由于 受到多种不良因素的影响， 如手术治疗后再复发、 放疗和化疗的毒副作用强等， 肿瘤治疗效 果急需提高。 随着生物医学纳米技术的不断成熟， 高疗效、 少副作用的特异性癌症治疗新载 体成为一大研究热点， 其中， 化疗与基因治疗结合、 基因与光动力治疗结合的协同抗癌体 系， 有望在癌症治疗方面取得新的突破。 0003 传统化学疗法是将药物经血管带到全身， 所用的抗癌药物通常具有较大的毒性， 杀死癌细胞的同时对正常细胞也会造成损伤， 极大地影响了化疗的治疗效果。 提高化疗效 果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。 通过载体包裹抗肿瘤药物， 能 够。
14、减少体内酶对抗肿瘤药物的破坏与降解从而提高了药物在体内的稳定性。 同时包裹在载 体内的抗肿瘤药物通过缓释过程能够在较长时间内保持有效的血液浓度， 延长药物的作用 时间， 提高抗肿瘤药物的利用率， 降低药物使用的频率。 0004 光动力疗法(PDT)是近30年兴起并不断发展的肿瘤治疗技术， 其过程是光敏剂 (PS)经特定波长的光照激发， 释放自身能量传递给周边的氧， 从而获得具有毒性的单线态 氧等自由基(ROS)， 诱导细胞凋亡杀死肿瘤细胞， 以此达到治疗目的。 与传统的化学治疗及 放射治疗相比， PDT依赖光刺激和PS调控， ROS的产生是通过控制特定波长的光集中照射肿 瘤组织中富集的PS， 。
15、因此其具有选择性和特异性高、 对正常组织毒性低、 可重复治疗等优 点。 虽然， PDT治疗被认为是一种新型的癌症治疗手段， 但由于光敏剂分子亲水性差、 容易聚 集， 缺乏肿瘤靶向性， 以及治疗过程中肿瘤微环境的加剧缺氧和自适应免疫逃避机制等， 限 制了其在生物医学方面的应用。 随着纳米材料的发展， 为光敏分子提供功能性载体， 对光敏 剂进行水溶性和生物相容性改性， 同时联合手术、 化疗、 放疗、 基因治疗、 PTT甚至免疫治疗 等其他治疗手段， 有望攻克PDT治疗的缺陷。 0005 基因治疗作为一种新兴的革命性医疗技术， 有望成为未来肿瘤临床治疗的 “新 宠” 。 基因治疗是将目的基因导入患者。
16、的特定组织和细胞进行表达， 以纠正或补偿因基因缺 陷或异常而引起的疾病， 从而达到治疗疾病的目的。 非病毒性纳米载体作为新型基因载体， 在尺寸、 目的基因保护、 靶向性和刺激响应性修饰、 安全性、 生物相容性和生物可降解性等 方面具有明显优势， 为基因治疗带来了新的契机。 在诸多基因载体材料中， 阳离子高聚物不 仅具有低毒、 低免疫原性、 低致癌性， 易于制备和携带目的基因、 强静电作用、 有效络合DNA 等特点， 且其便于进行靶向性和生物适用性改性， 是近年来研究最广泛的基因载体材料。 此 外， 单一的基因治疗手段难以达到理想的癌症治疗效果， 联合多种癌症治疗手段， 发挥协同 说 明 书 1。
17、/6 页 4 CN 107569682 A 4 抗癌效应， 成为癌症治疗研究的主流趋势， 其中化疗/基因治疗以及基因/PDT协同治疗方 式， 在癌症治疗中有着极大的潜力。 现有的化疗/基因、 基因/PDT联合治疗体系中， 基因释放 主要依赖于肿瘤微环境与正常组织细胞的差异， 使其易受肿瘤异质性的影响， 而且缺乏精 准的控制性， 限制了化疗/基因、 基因/PDT治疗在各种各样不同癌症中的应用。 0006 纳米科技的发展及纳米药物、 光敏剂输送体系的建立使得医药领域很多传统难题 得以解决， 纳米诊疗体系相比于传统药物， 其靶向性、 生物利用度等都有很大提高， 同时此 类新型体系可以改善药物稳定性及。
18、药物释放动力学行为， 从而更大程度地提高治疗效果并 减小副作用。 目前， 纳米载体主要包括具有生物降解性的聚合物、 天然生物大分子(蛋白质、 糖等)等有机材料， 以及无机非金属类(氧化硅、 羟基磷灰石、 磷酸钙等)和金属类(金纳米颗 粒、 磁性氧化铁)的无机材料。 近年来， 无机纳米粒子因其具有光、 电、 磁等独特性质、 尺寸形 貌可控性好、 比表面积大等一系列优点， 引起了人们的广泛关注。 构建无机-有机纳米复合 载体， 同时运载多组分抗癌物质(如基因、 药物、 光敏剂等)， 可通过单一纳米诊疗体系实现 化疗/基因治疗和基因/PDT联合治疗， 大大提高癌症治疗效果。 0007 光响应性纳米载。
19、体近年来在基因/药物控释以及智能多功能纳米诊疗探针领域受 到研究者极大关注。 与pH、 氧化还原、 温度、 酶等内在刺激源相比， 光作为一种外源无侵袭性 刺激手段， 其参数如波长、 强度、 曝光时间等可精准调控。 因此将光响应性引入纳米诊疗体 系， 不仅可以控制光敏剂分子的激发， 而且可以实现基因/药物的 “定时、 定点、 定速” 释放。 此外， 光响应性还可以使纳米载体不依赖肿瘤微环境变化释放运载的诊疗物， 使诊疗过程 不受肿瘤异质性的影响， 进一步提高诊疗过程的时空可控性和精准性。 目前， 由于光活化手 段的简单操作性和高选择性， 其已被广泛应用于药物可控释放、 基因表达、 光热及光动力治。
20、 疗。 实现光响应控释功能主要依赖于纳米载体中的光敏基团在特定光刺激下发生结构变 化， 如： 构象、 亲疏水性、 化学键断裂等变化。 常用的光敏基团主要有偶氮苯、 邻叠氮萘醌、 螺 吡喃、 芘、 香豆素和硝基苄基等， 其中香豆素(COU)具有较高的双光子吸收效率和光解效率， 常作为近红外光敏基团， 是研究最为广泛的光敏基团之一。 欲将基因和药物/光敏剂同时且 高效输送到癌细胞内， 并且使基因释放过程具有更好的控制性、 选择性、 可操作性， 迫切需 要构建新型光响应性纳米多功能载体。 0008 介孔氧化硅作为无机非金属氧化物， 由于其良好的理化稳定性、 高比表面积、 形貌 可控、 孔径可调、 表。
21、面修饰方法简单条件温和以及良好的生物相容性和生物可降解性成为 理想的无机载体材料。 利用缩聚反应， 可将伯氨基、 仲氨基、 羧基、 羟基、 烷基卤、 叠氮或环氧 等活性官能团引入氧化硅纳米颗粒表面。 所得的功能化氧化硅纳米颗粒可以保持原来的尺 寸和形态， 且引入的官能团分布均匀。 不同官能团修饰的氧化硅纳米颗粒， 可利用官能团反 应进一步接入功能分子或有机高聚物， 得到诸多变化万千的功能化氧化硅纳米颗粒。 。 (三)发明内容 0009 本发明目的是提供一种以介孔氧化硅纳米颗粒为基质， 利用表面修饰功能化氧化 硅纳米颗粒， 引入光响应基团香豆素， 再以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建的多功能。
22、纳 米载体及其制备方法。 0010 本发明采用的技术方案是： 0011 一种光响应性氧化硅纳米载体， 由如下方法制备得到： 说 明 书 2/6 页 5 CN 107569682 A 5 0012 (1)氧化硅纳米颗粒HNP先与3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES反应， 得到氨基功能化 氧化硅纳米颗粒HNP-NH2； 0013 (2)HNP-NH2与丁二酸酐SA反应， 得到羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH； 0014 (3)将HNP-COOH溶于氯化亚砜进行活化反应， 得到酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒 HNP-COCl； 0015 (4)HNP-COCl与光敏基团4-溴甲基-7羟基-香豆素C。
23、ou反应， 得到光敏基团功能化 的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou； 0016 (5)HNP-Cou与2-溴异丁酸反应， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发剂 HNP-Cou-Br； 0017 (6)HNP-Cou-Br加入单体和配体， 以及溴化铜或溴化亚铜， 引发活化自由基聚合反 应， 获得光响应性氧化硅纳米载体； 所述的单体为下列之一： 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 甲 基丙烯酸缩水甘油醚、 N-异丙基丙烯酰胺中的一种或几种； 所述的配体为下列之一： 2,2-联 吡啶、 1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、 五甲基二乙烯三胺、 4,4-联吡啶。 0018 所述氧化硅纳米颗粒的形貌可为。
24、实心球、 空心球或纳米棒。 0019 本发明多功能纳米载体可利用无机氧化硅纳米颗粒的空腔或孔道结构装载药物 或光敏剂分子， 通过表面聚合物阳离子络合基因， 可同时运载基因、 药物或光敏剂分子。 特 别地， 该纳米载体具有光响应性， 在特定波长的光激发下， 光敏基团光解使聚合物从氧化硅 纳米颗粒表面脱落， 释放运载的基因或药物。 该多功能纳米载体具有低毒性， 光刺激下高转 染效率的优点， 并且形貌、 尺寸可控， 可根据不同细胞系应用要求设计材料。 该方法原料价 格相对低廉， 制备过程温和， 简单易行， 制备得到产物具有良好的稳定性， 水溶液分散性和 生物相容性， 形貌尺寸可调控， 可根据不同的应。
25、用环境设计材料， 具有潜在的基因载体、 药 物载体、 光敏剂载体的应用前景。 0020 本发明光响应性氧化硅纳米载体构建方法如图1所示。 0021 本发明还涉及所述的光响应性氧化硅纳米载体的制备方法， 所述方法包括： 0022 1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒： 先将乙醇与水混合均匀， 然后 加入3-氨丙基三乙氧基硅烷充分混合， 再加入氧化硅纳米颗粒分散均匀后080反应1 10h， 最后加入三乙胺， 080继续反应1248h， 将所得产物用甲醇、 乙醇、 或水离心洗涤， 真空干燥， 100150高温固化16h， 得到氨基功能化氧化硅纳米颗粒HNP-NH2； 其中氧化 硅纳米颗粒与乙。
26、醇的质量比为0.01-50， 优选0.01-4.5； 氧化硅纳米颗粒与水的质量比为 0.01-50， 优选0.05-2.5； 氧化硅纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为0.1-50， 优 选0.25-10； 氧化硅纳米颗粒与三乙胺的质量比为0.01-20， 优选0.1-4.5。 0023 2)制备羧基功能化的氧化硅纳米颗粒： 将氨基功能化氧化硅纳米颗粒HNP-NH2溶 于有机溶剂， 逐滴加入丁二酸酐的有机溶剂， 再加入三乙胺， 050反应048h； 产物用甲 醇离心洗涤， 真空干燥， 得到羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH； 其中氨基功能化氧化 硅纳米颗粒与丁二酸酐质量比为0.0。
27、1-10， 优选0.1-2； 氨基功能化氧化硅纳米颗粒与有机 溶剂的质量比为0.001-10， 优选0.01-2； 丁二酸酐与有机溶剂的质量比为0.005-20， 优选 0.01-5。 0024 3)制备酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒： 将羧基功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-COOH 溶于氯化亚砜， 570搅拌0.55h， 真空干燥， 得到酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒HNP- 说 明 书 3/6 页 6 CN 107569682 A 6 COCl； 0025 4)制备光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒： 将酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒HNP- COCl和4-溴甲基-7羟基-香豆素Cou溶于有机溶剂， 再加入。
28、三乙胺， 050反应1072h； 产 物分别用乙醇和水离心洗涤， 真空干燥， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou； 其中酰氯功能化的氧化硅纳米颗粒与光敏基团香豆素的质量比为0.01-10， 优选0.5-2； 酰 氯功能化的氧化硅纳米颗粒与有机溶剂的质量比为0.001-20， 优选0.005-1； 酰氯功能化的 氧化硅纳米颗粒与三乙胺的质量比为0.01-100， 优选0.1-20。 0026 5)制备氧化硅纳米颗粒引发剂： 先将光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou 溶于有机溶剂， 然后加入2-溴异丁酸、 碳酸钾， 050反应10-48h； 产物用体积比为0.1 2： 1的甲。
29、醇与水混合溶剂离心洗涤， 真空干燥， 得到光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发 剂HNP-Cou-Br； 其中光敏基团功能化氧化硅纳米颗粒与2-溴异丁酸的质量比为0.01-10， 优 选0.5-5； 光敏基团功能化氧化硅纳米颗粒与碳酸钾质量比0.01-20， 优选0.5-10； 光敏基团 功能化氧化硅纳米颗粒与有机溶剂质量比0.001-100， 优选0.005-10。 0027 6)ATRP聚合反应： 在无氧环境下先将光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒引发剂 HNP-Cou-Br溶于水， 然后加入有机溶剂、 单体， 再加入配体， 最后加入溴化铜或溴化亚铜引 发活性可控自由基聚合， 反应温度为060(。
30、优选555， 更优选1050)， 反应时间为 l200min(优选l150min)， 聚合反应完成后加入水或者暴露在空气中， 使引发体系失活 和终止聚合， 然后放入截留分子量为2500-4500MW的透析袋中， 在去离子水中透析； 最后将 透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分， 即得所述光响应性氧化硅纳米载体； 所述的 单体为下列之一： 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 甲基丙烯酸缩水甘油醚、 N-异丙基丙烯酰胺中 的一种或几种； 所述的配体为下列之一： 2,2-联吡啶、 1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、 五甲基二乙烯三胺、 4,4-联吡啶。 其中氧化硅纳米颗粒引发剂与水的质量比为0.。
31、001-0.1， 优选0.003-0.05； 氧化硅纳米颗粒引发剂与有机溶剂的质量比为0.001-0.1， 优选0.002- 0.05； 氧化硅纳米颗粒引发剂与单体的质量比为0.001-0.1， 优选0.005-0.05； 氧化硅纳米 颗粒引发剂与配体的质量比为0.01-5， 优选0.1-1； 氧化硅纳米颗粒引发剂与溴化亚铜的质 量比为0.1-10， 优选0.5-5； 氧化硅纳米颗粒引发剂与溴化铜的质量比为0-10， 优选0.5- 9.5。 0028 所述的氧化硅纳米颗粒的形貌为实心球、 空心球、 纳米棒。 0029 所述的实心球形貌的氧化硅纳米颗粒可按如下方法制备得到： 将0.012g十六烷。
32、 基三甲基溴化铵溶于50500mL水， 再加入0.25mL浓度为0.55M的NaOH溶液， 搅拌均匀 后加入0.55mL正硅酸乙酯， 27150下剧烈搅拌反应110h； 产物离心收集， 27100 干燥， 400600煅烧324h以去除模板， 获得所述实心球形貌的氧化硅纳米颗粒。 0030 所述的空心球形貌的氧化硅纳米颗粒按可如下方法制备得到： 将0.012g十六烷 基三甲基溴化铵溶于50500mL水， 加入0.011g全氟辛酸， 再加入0.25mL浓度为0.5 5M的NaOH溶液， 搅拌均匀后加入0.55mL正硅酸乙酯， 27150下剧烈搅拌反应110h； 产物离心收集， 27100干燥， 。
33、400600煅烧324h以去除模板， 获得所述空心球形貌 的氧化硅纳米颗粒。 0031 所述的纳米棒形貌的氧化硅纳米颗粒按可如下方法制备得到： 将0.012g十六烷 基三甲基溴化铵溶于30300mL水， 加入0.520mL浓度为2.525wt的氨水， 最后加入 说 明 书 4/6 页 7 CN 107569682 A 7 0.55mL正硅酸乙酯， 2540下搅拌反应112h； 产物离心收集， 27100干燥， 400 600煅烧324h以去除模板， 获得所述纳米棒形貌的氧化硅纳米颗粒。 0032 所述的有机溶剂选自砜类、 亚砜类、 酰胺类、 醇类中的一种或几种。 0033 光敏基团4-溴甲基-。
34、7羟基-香豆素的制备可按如下方法进行： 0034 将1,3-苯二酚、 溴代乙酰乙酸乙酯加入50-80浓H2SO4中， 25-50反应5-24h； 反 应后加入蒸馏水， 过滤， 真空干燥， 得到所述4-溴甲基-7羟基-香豆素； 其中1,3-苯二酚与溴 代乙酰乙酸乙酯的质量比为0.01-10， 优选0.5-2； 1,3-苯二酚与水的质量比为0.001-20， 优 选0.05-5。 0035 本发明的有益效果主要体现在： 本发明所采用表面修饰手段、 聚合反应温和， 易于 调控， 可根据需要制备出多种不同聚合度的光响应性多功能纳米载体， 并且其储存稳定性 好， 放置几天或几个月后仍可保持原有性能。 该。
35、多功能纳米载体在HepG2、 COS7、 293、 C6、 Hela等细胞中具有高于国际上 “金标” PEI的转染效率， 并且具有光响应释放基因的性能。 在 光刺激下， 氧化硅纳米颗粒表面光敏基团光解使阳离子脱落从而释放基因， 可大大提高基 因转染效率。 该纳米载体的细胞毒性远低于高分子线性PDMAEMA和PEI。 本方法使用方法简 单， 具有商业化潜力。 此外， 氧化硅纳米颗粒形貌易于调控， 可根据不同细胞系设计特殊形 貌及尺寸， 并且介孔氧化硅纳米颗粒的多孔结构可以装载多种不同药物或光敏剂分子， 为 新型光响应性纳米载体的开发打下了良好的实验基础。 (四)附图说明 0036 图1为本发明光。
36、响应性氧化硅纳米载体构建方法示意图。 0037 图2为本发明方法制得的氧化硅纳米颗粒透射电子显微镜图。 0038 图3为本发明方法制得的光响应性氧化硅纳米载体的红外光谱图。 0039 图4为本发明方法制得的光响应性氧化硅纳米载体的细胞毒性； PEI作为参照。 0040 图5为本发明方法制得的光响应性氧化硅纳米载体的基因转染效率； 探究了光刺 激对载体基因转染效率的影响； PEI为参照。 (五)具体实施方式 0041 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 0042 实施例1： 空心氧化硅纳米颗粒HNP的制备 0043 0.2g十六烷基三甲基溴化铵(CTA。
37、B)溶于96mL H2O， 加入0.055g全氟辛酸(PFOA)， 再加入0.7mL NaOH(2M)， 最后加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)， 80下剧烈搅拌反应2h。 所得到 的反应产物通过离心收集， 60干燥， 550煅烧6h以去除模板。 0044 实施例2： 光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou的制备 0045 将1.12g 1,3-苯二酚(10.18mmol)和1.11g溴代乙酰乙酸乙酯(8.52mmol)溶于 70H2SO4， 室温反应8h， 加入72mL水， 过滤， 真空干燥， 得到光敏基团4-溴甲基-7羟基-香豆 素(Cou)。 0046 取实施例1中得到的氧化硅纳米颗。
38、粒200mg溶于18mL无水乙醇， 加入2mL水与300 L 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)， 室温反应6h后加入160 L三乙胺， 继续反应12h。 将所得产 说 明 书 5/6 页 8 CN 107569682 A 8 物离心乙醇洗三次， 真空干燥， 130高温固化3h， 得到HNP-NH2。 0047 将1g丁二酸酐(SA)溶于10mL无水DMF。 将上述所得HNP-NH2190mg溶于10mL无水 DMF， 加入丁二酸酐无水DMF溶液中， 再加入1mL三乙胺， 室温反应24h， 甲醇离心洗三次， 真空 干燥， 得到HNP-COOH。 0048 将上述所得HNP-COOH 180m。
39、g溶于1mL氯化亚砜(SOCl2)， 60搅拌2h， 真空干燥得 到活化的酸性HNP-COCl(棕色固体)。 0049 将上述所得HNP-COCl 150mg和150mg Cou(0.44mmol)溶于10mL无水DMF， 再加入 0.35mL三乙胺， 室温反应24h。 产物用甲醇和水分别离心洗三次， 真空干燥， 得到HNP-Cou。 0050 实施例3： 氧化硅纳米颗粒引发剂HNP-Cou-Br的制备 0051 取实施例2中得到的光敏基团功能化的氧化硅纳米颗粒HNP-Cou100mg和105mg 2- 溴异丁酸(0.63mmol)溶于10mL无水DMF， 再加入105mg碳酸钾(K2CO3)。
40、(0.63mmol)， 37反应 24h。 产物用甲醇和水分别离心洗三次， 真空干燥， 得到HNP-Cou-Br。 0052 实施例4： ATRP聚合反应 0053 取实施例3中得到的氧化硅纳米颗粒引发剂HNP-Cou-Br 20mg加入2mL甲醇， 3mL 水， 1mL甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)， 通N2排气， 然后加入28 L五甲基二亚乙基三胺 (PMDTETA)和10mg溴化亚铜(CuBr)， 30反应30min， 透析冻干， 得到光响应性氧化硅纳米基 因载体HNP-Cou-PDMAEMA。 0054 通过透射电镜(TEM)来观察所合成氧化硅纳米颗粒的形态， 结果见图2， 由。
41、图可见， 所制备的空心氧化硅纳米颗粒形貌、 尺寸均一， 且具有良好的分散性。 0055 通过红外光谱(FT-IR)、 X射线光电子能谱(XPS)对氧化硅纳米颗粒表面修饰后产 物进行了分析。 FT-IR结果见图3， 由图可见， 氧化硅纳米颗粒表面成功引入了光敏基团Cou 及聚阳离子PDMAEMA。 0056 用热重分析(TGA)对聚合反应后载体中光敏基团及聚阳离子的含量进行了研究， 结果表明HNP-Cou-PD中光敏基团的质量比约为2， 聚阳离子PDMAEMA的质量比约为65。 使用激光粒度及电位分析仪表征所得产物的粒径、 zeta电位， 通过粒径和zeta电位变化表 明HNP-Cou-PD的成。
42、功制备， 且络合基因后(N.P20)纳米复合物的尺寸约为250nm， 表面电 势约为30mV， 利于细胞内吞。 通过凝胶电泳实验测试所得基因载体络合DNA的能力， 细胞毒 性、 基因转染实验测试了产物载体的生物相容性和转染效率。 CCK-8检测法检测细胞毒性结 果见图4， 由图可见， HNP-Cou-PD具有较好的生物相容性， 细胞毒性明显低于国际金标PEI。 流式细胞术检测基因转染效率结果见图5， 由图可见， HNP-Cou-PD的基因转染效率明显高于 金标PEI。 通过比较有无光刺激的载体基因转染效率验证光响应性， 由图5可见， HNP-Cou-PD 在光刺激下， 基因转染效率明显提高。 。
43、验证氧化硅纳米载体空腔/孔道装载药物或光敏剂的 能力， 结果表明其空腔能够装载大量药物及光敏剂分子， 可达其质量的20。 0057 通过细胞毒性、 活死染色、 流式细胞术等验证光响应性纳米载体装载药物/基因或 基因/光敏剂后的化疗/基因治疗或基因/光动力治疗的协同抗癌效应， 并验证光刺激对协 同抗癌效应的影响。 结果表明， HNP-Cou-PD氧化硅空腔装载药物/光敏剂分子， 表面阳离子 络合治疗基因后， 可使化疗/光动力治疗与基因治疗发挥联合抗癌效应， 并且由于光刺激可 提高基因转染效率， 因此在光刺激作用下， 纳米复合物可发挥更好的协同抗癌效应， 为精准 癌症治疗提供了新的策略。 说 明 书 6/6 页 9 CN 107569682 A 9 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 10 CN 107569682 A 10 图2 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 11 CN 107569682 A 11 图4 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 12 CN 107569682 A 12 。