《一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102727213 B (45)授权公告日 2014.06.04 CN 102727213 B (21)申请号 201210204855.7 (22)申请日 2012.06.20 A61B 5/117(2006.01) G01N 21/76(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 388 号 (72)发明人 许林茹 李妍 苏彬 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 周烽 US 20080031501 A1,2008.02.07, CN 101430285 A,2009.05.13,。
2、 CN 101750410 A,2010.06.23, CN 101539525 A,2009.09.23, US 20080054875 A1,2008.03.06, 黄 群 . 利用镧系发光显现纸张上的潜在指 纹 .信息记录材料 .2004, 第 5 卷 ( 第 2 期 ), 全文 . 李 柳， 等 . 潜在手印显现技术的研究及发 展 .大众科技 .2008,( 第 10 期 ), (54) 发明名称 一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基于电化学发光标记物显 现潜在指纹的方法， 该方法用活化的三联吡啶钌 复合物为电化学发光标记物， 它可以通过分子。
3、上 的 N- 羟基琥珀酰亚胺酯与指印氨基酸中的氨基 发生共价结合， 从而标记并固定在指纹上 ； 继而 在一定电位下与溶液中的共反应剂 （二正丁基乙 醇胺） 发生电化学发光反应， 从而显现出指纹的纹 路， 包括整体形貌 （一级结构） 和细节特征 （二级结 构） ； 本发明采用的电化学发光技术不需要外加激 发光源、 不存在背景光， 且大大降低了发光剂的自 猝灭现象， 明显优于传统荧光成像法 ； 该成像技 术能够迅速获取图像， 远远快于扫描电化学显微 镜 ； 使用的电化学发光共反应剂为二正丁基乙醇 胺， 它具有发光强度大、 环境友好的特点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张玲玲 。
4、权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102727213 B CN 102727213 B 1/1 页 2 1. 一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法， 该方法在电化学发光成像系统上 实现 ； 电化学发光成像系统包括电化学反应池、 恒电位控制仪和 CCD 照相机， 电化学反应池 包括底座和池体， 底座上具有凹槽， 池体中空， 通过 O 型密封圈和螺丝固定在凹槽上， 池体 一侧有一小孔 ； 恒电位控制仪包括工作电极、 对电极和参比电极， 参比电极安放在小孔内，。
5、 其中， 工作电极为 ITO， 对电极为铂环， 参比电极为 Ag/AgCl 电极或 Ag 电极 ； 其特征在于， 该 方法包括以下步骤 ： （1） 电极预处理 ： 将工作电极依次在丙酮、 乙醇和去离子水中各超声清洗 10-20min， 再 用去离子水彻底冲洗干净， 用氩气吹干 ； （2） 指印样本制备 ： 用胶带将不同客体上的指印提取下来， 然后转移到工作电极上， 形 成指印样本 ； （3）用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯 活 化 的 三 联 吡 啶 钌 复 合 物 标 记 指 印 ： 将 50 N- 羟基琥珀酰亚胺酯活化的三联吡啶钌复合物涂覆在指印样本上， 盖上表面皿防止溶 液挥发，。
6、 在室温下反应 30min 以上， 用去离子水冲洗样本以除去未反应的复合物， 用氩气吹 干 ； （4） 电化学发光成像 ： 将上述处理的工作电极、 对电极和参比电极置于电化学反应池 中， 然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池中， 恒电位控制仪通电， CCD 照相机 采集指纹图像 ； 所述反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入 50mmol 二正丁基乙醇胺和 0.15mol 氯化钠组成， 磷酸盐缓冲溶液的 pH 为 7.4， 恒电位控制仪的电位为 1.3V。 权 利 要 求 书 CN 102727213 B 2 1/4 页 3 一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法 技术领域 0001 。
7、本发明属于潜在指纹显现技术领域， 特别涉及一种基于电化学发光标记物的潜在 指纹显现方法。 背景技术 0002 指纹由一种叫做摩擦嵴的脊状突起系列组成， 具有非常特殊的生理结构和特征体 系。指纹在法医鉴定及人身识别方面担任着重要作用， 同时广泛应用于日常生活中的安全 检验、 访问控制、 个人认证等领域。所谓潜在指纹， 是指人的手指、 手掌触摸物体时， 由于分 泌的汗垢和油脂与物面的相互作用， 在物面上留下反映指掌面皮肤乳突线花纹的印痕 （分 为汗垢和油脂组成的嵴线区域以及凹陷的峪线区域） 。这种印痕， 在多数情况下不能被目力 或仪器直接察见， 如同照相感光胶片经过曝光形成潜影一样， 需通过显影处。
8、理才能显示原 有的图像， 所以称为潜在指纹。根据显现原理的不同， 潜在指纹显现方法主要有三类 ： 光学 显现法、 化学显现法以及物理吸附法， 其基本原理就是使用一种光线或物质作用于指纹印 痕的汗液物质， 使不能看见的汗液指纹变为可见的。 0003 近年来不断有研究者利用各种新技术进行指纹显现及指纹成分的检测， 如质谱成 像、 红外 / 拉曼成像、 免疫标记成像、 扫描电化学显微成像及局部电流成像等。其中基于 电化学原理显现潜在指纹的技术受到人们越来越多的关注。Shan 等利用表面等离子共振 光信号引起的局部电流变化来对指纹进行显现， 并用于 TNT 检测， 成果发表在 Sicence 上 （S。
9、cience, 2010, 327） 。Qin 等将扫描电化学显微镜 （SECM） 技术用于多种客体上的指纹显 现， 根据法拉第电流的变化来反应指纹的拓扑结构 （Electroanalysis, 2012, 24, 1-6） 。 尽管指纹显现方法繁多， 但目前指纹显现技术中仍然存在诸多困难。 例如， 成功的潜在指纹 显现非常依赖于指纹残留物的化学组成， 实践中由于选用了不恰当的显现技术而破坏指纹 物证的现象时有发生。 再如， 尽管扫描电化学显微镜技术是一种非常灵敏的非创检测技术， 但是其检测过程费时， 若得到厘米级图像需要耗费十几到几十小时。因此目前仍然需要一 种技术简单、 快速、 适用范围广。
10、的方法对潜在指纹进行显现。 0004 电化学发光是电化学反应和化学发光相结合的产物， 是通过将电能转换成辐射能 实现的。 由于电化学发光是在电极表面产生的， 因此可以反应出电极反应活性， 并且具有背 景低、 时空可控等优点。因此， 电化学发光被广泛应用于成像研究， 例如观察电极的功能区 域、 检查电化学活性位点等。同时电化学发光成像也已成功用于制备各种微电化学和微流 体系统、 筛选代谢物毒性以及检测肿瘤标志物蛋白等。电化学发光检测中最广泛使用的发 光标记物为 N- 羟基琥珀酰亚胺酯活化的三联吡啶钌。当它标记蛋白、 抗体或核酸时， 酯链 断裂， 与生物分子上的氨基结合。 目前， 将活化的三联吡啶。
11、钌复合物用于指纹标记并进行电 化学发光成像未有报道。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种基于电化学发光标记物显现潜在 说 明 书 CN 102727213 B 3 2/4 页 4 指纹的方法 ； 该方法简单、 快速、 发光强度高。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 ： 一种基于电化学发光标记物显现潜 在指纹的方法， 该方法在电化学发光成像系统上实现 ； 电化学发光成像系统包括电化学反 应池、 恒电位控制仪和 CCD 照相机， 电化学反应池包括底座和池体， 底座上具有凹槽， 池体 中空， 通过 O 型密封圈和螺丝固定在凹槽上， 池体一侧有一小孔 ； 。
12、恒电位控制仪包括工作电 极、 对电极和参比电极， 参比电极安放在小孔内， 其中， 工作电极为 ITO（铟锡氧化物导电玻 璃） ， 对电极为铂环， 参比电极为 Ag/AgCl 电极或 Ag 电极 ； 该方法包括以下步骤 ： 0007 （1）电极预处理 ： 将工作电极依次在丙酮、 乙醇和去离子水中各超声清洗 10-20min， 再用去离子水彻底冲洗干净， 用氩气吹干。 0008 （2） 指印样本制备 ： 用胶带将不同客体上的指印提取下来， 然后转移到工作电极 上， 形成指印样本 ； 0009 （3） 用活化的三联吡啶钌复合物标记指印 ： 将 50活化的三联吡啶钌复合物涂 覆在指印样本上， 盖上表面。
13、皿防止溶液挥发， 在室温下反应 30min 以上， 用去离子水冲洗样 本以除去未反应的复合物， 用氩气吹干 ； 0010 （4） 电化学发光成像 ： 将上述处理的工作电极、 对电极和参比电极置于电化学反应 池中， 然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池中， 恒电位控制仪通电， CCD 照相机 采集指纹图像 ； 所述反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入 50mmol 二正丁基乙醇胺和 0.15mol 氯化钠组成， 磷酸盐缓冲溶液的 pH 为 7.4， 恒电位控制仪的电位为 1.3V。 0011 进一步地， 所述步骤 （2） 中， 所述客体包括但不限于电脑屏、 光盘、 硬币、 桌面和不 锈钢器。
14、具。 0012 进一步地， 所述步骤 （3） 中， 所述活化的三联吡啶钌复合物为 N- 羟基琥珀酰亚胺 活化的三联吡啶钌。 0013 本发明的有益效果是， 0014 1、 该方法检测迅速， 只需数秒钟即可得到厘米级图像， 远远快于扫描电化学显微 镜技术 （十几至几十小时） 。 0015 2、 不需要昂贵仪器 ； 不需要外加激发光源， 因此不存在背景光干扰， 优于荧光法。 0016 3、 由于电化学发光反应是由固定在指印上的发光体与溶解在反应溶液中的共反 应剂产生的， 因此发光体的自猝灭效应低， 显现效果明显优于荧光法。 0017 4、 该方法灵敏度高， 既可以用于显现油潜指印， 也可用于显现活。
15、性物质较少的汗 潜指印。 0018 5、 与传统共反应剂三正丙胺相比， 该方法使用的共反应剂二正丁基乙醇胺具有发 光强度高、 环境友好的优点。 附图说明 0019 图 1 是电化学发光成像系统示意图 ； 0020 图 2 是电化学反应池的结构示意图 ； 0021 图 3 是用活化的三联吡啶钌复合物处理 3.5h 的油潜指印的电化学发光图 ； 0022 图 4 是用活化的三联吡啶钌复合物处理 6 h 的油潜指印的电化学发光图 ； 0023 图 5 是用稀释两倍的活化的三联吡啶钌复合物处理 3.5h 的油潜指印的电化学发 说 明 书 CN 102727213 B 4 3/4 页 5 光图 ； 00。
16、24 图 6 是用活化的三联吡啶钌复合物处理 3.5h 的汗潜指印的电化学发光图 ； 0025 图中， 电化学反应池 1、 恒电位控制仪 2、 CCD 照相机 3、 底座 4、 池体 5、 凹槽 6、 O 型 密封圈 7、 螺丝 8、 小孔 9、 工作电极 10、 对电极 11、 参比电极 12。 具体实施方式 0026 本发明的原理是 ： 人类手指表面皮肤布满汗腺， 触物留痕。一般来说留在客体表 面的指纹物质较少， 一般为 0.11mg， 其中 99% 为水分， 会迅速蒸发掉 ； 固体物质只占 1%， 其 中2/3是有机物质， 如 ： 氨基酸、 蛋白质、 脂肪酸、 尿素等 ； 剩余1/3是无。
17、机物质。 本发明以指 印中的氨基酸为检测物， 制备了活化的三联吡啶钌复合物。它可以通过分子上的 N- 羟基琥 珀酰亚胺酯与指印氨基酸中的氨基发生共价结合， 从而标记并固定在指纹上。继而将标记 好的样本安装在电化学反应池中， 加入含共反应剂的反应溶液， 施加一定电位， 指纹上标记 的三联吡啶钌复合物即可与溶液中的共反应剂发生电化学发光反应， 从而显现出指纹的纹 路。 0027 本发明基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法在电化学发光成像系统上实 现。 0028 如图1和2所示， 电化学发光成像系统包括电化学反应池1、 恒电位控制仪2和CCD 照相机 3， 电化学反应池 1 包括底座 4 和池体 。
18、5， 底座 4 上具有凹槽 6， 池体 5 中空， 通过 O 型 密封圈 7 和螺丝 8 固定在凹槽 6 上， 池体 5 一侧有一小孔 9。恒电位控制仪 2 包括工作电极 10、 对电极 11 和参比电极 12， 参比电极 12 安放在小孔 9 内， 其中， 工作电极为 ITO（铟锡氧 化物导电玻璃） ， 对电极为铂环， 参比电极为 Ag/AgCl 电极或 Ag 电极。电化学反应池 1 的材 质可以为聚四氟乙烯 ； 但不限于此。 0029 本发明的方法包括以下步骤 ： 0030 1、 电极预处理 ： 将工作电极 10 依次在丙酮、 乙醇和去离子水中各超声清洗 10-20min， 再用去离子水彻。
19、底冲洗干净， 用氩气吹干。 0031 2、 指印样本制备 ： 用胶带将不同客体上的指印提取下来， 然后用适中力度转移到 工作电极 10 上， 形成指印样本 ； 客体包括但不限于电脑屏、 光盘、 硬币、 桌面和不锈钢器具。 0032 3、 用活化的三联吡啶钌复合物标记指印 ： 将 50活化的三联吡啶钌复合物涂覆 在指印样本上， 盖上表面皿防止溶液挥发， 在室温下反应 30min 以上， 用去离子水冲洗样本 以除去未反应的复合物， 用氩气吹干。 0033 活化的三联吡啶钌复合物为 N- 羟基琥珀酰亚胺活化的三联吡啶钌， 可依据文献 （Biophysical Journal, 1995, 68, 3。
20、42-350） 合成， 得到的终产物为该复合物的二甲基甲 酰胺溶液， 本步骤中， 将其涂覆在指印样本上。 0034 4、 电化学发光成像 ： 将上述处理的工作电极 10、 对电极 11 和参比电极 12 置于电 化学反应池 1 中， 然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池 1 中， 恒电位控制仪 2 通 电， CCD 照相机 3 采集指纹图像。 0035 反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入 50mmol 二正丁基乙醇胺和 0.15mol 氯 化钠组成， 磷酸盐缓冲溶液的 pH 为 7.4。恒电位控制仪 2 的电位为 1.3V。 0036 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。 说 。
21、明 书 CN 102727213 B 5 4/4 页 6 0037 本发明是基于电化学发光标记物显现潜在指纹， 将一枚指印用活化的三联吡啶钌 复合物标记后， 安装在如图 2 所示的电化学反应池中， 按照图 1 所示组装成三电极体系， 通 过施加一定的电位， 电极表面产生的电化学发光会被上方的高灵敏 CCD 照相机捕获， 由此 得到指印图像。 0038 实施例 1 0039 （1） 在 ITO 上按一枚油潜指印 ； 0040 （2） 用活化的三联吡啶钌复合物孵育 4h， 用去离子水冲洗以除去未反应的复合 物 ； 0041 （3） 将样本安装在电化学反应池中， 加入 50mM 二正丁基乙醇胺的磷酸。
22、盐缓冲溶 液， 通过三电极体系施加 1.3V 电位， 用高灵敏 CCD 照相机对图像进行捕获， 得到图 3 所示的 电化学发光图像。 0042 实施例 2 0043 （1） 在 ITO 上按一枚油潜指印 ； 0044 （2） 用活化的三联吡啶钌复合物孵育 6h， 用去离子水冲洗以除去未反应的复合 物 ； 0045 （3） 将样本安装在电化学反应池中， 加入 50mM 二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶 液， 通过三电极体系施加 1.3V 电位， 用高灵敏 CCD 照相机对图像进行捕获， 得到图 4 所示的 电化学发光图像。 0046 实施例 3 0047 （1） 在 ITO 上按一枚油潜指印 ; 0。
23、048 （2） 然后用稀释两倍的活化的三联吡啶钌复合物孵育 3.5h， 用去离子水冲洗以除 去未反应的复合物 ； 0049 （3） 将样本安装在电化学反应池中， 加入 50mM 二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶 液， 通过三电极体系施加 1.3V 电位， 用高灵敏 CCD 照相机对图像进行捕获， 得到图 5 所示的 电化学发光图像。 0050 实施例 4 0051 （1） 在 ITO 上按一枚汗潜指印 ； 0052 （2） 用活化的三联吡啶钌复合物孵育 3.5h， 用去离子水冲洗以除去未反应的复合 物 ； 0053 （3） 将样本安装在电化学反应池中， 加入 50mM 二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶 液， 通过三电极体系施加 1.3V 电位， 用高灵敏 CCD 照相机对图像进行捕获， 得到图 6 所示的 电化学发光图像。 0054 上述实施例用来解释说明本发明， 而不是对本发明进行限制， 在本发明的精神和 权利要求的保护范围内， 对本发明作出的任何修改和改变， 都落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102727213 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102727213 B 7 2/2 页 8 图 3 图 4 图 5图 6 说 明 书 附 图 CN 102727213 B 8 。