本申请要求于2014年9月13日提交的GB1316347.2的优先权，其 全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及生物流体过滤组件以及使用这种组件的方法。
背景技术
膀胱癌是世界第六最常见的癌症。症状包括镜下或者肉眼可见的血 尿、尿痛以及多尿，然而，这些症状均不是这种疾病所特有的。诊断膀 胱癌的黄金标准是膀胱镜检查以及随后的经尿道膀胱肿瘤切除术 (TURBT)。针对非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC；阶段Ta、T1和Tis)， 膀胱镜检查的灵敏度在使用白光膀胱镜检查时约为80％，并且在使用荧光 (氨基己糖氨基铜戊酸盐)引导的膀胱镜检查时大于95％。
大多数膀胱肿瘤患者(70-80％)都诊断为NMIBC，其具有相对良好的 预后。然而，这种肿瘤的复发率非常高，大约70％的患者会遭受复发，并 且高达25％的复发会恶化为具有不良预后的肌肉浸润性膀胱癌(MIBC；阶 段T2-4)。高复发率以及恶化风险要求终生进行定期的膀胱镜检查，这 使得膀胱癌成为治疗最贵的癌症(Avritscher等人，2006)。由于存在 镜下或者可见血尿的所有病人中被诊断为膀胱癌的不到10％，所以为了排 除膀胱癌而进行的膀胱镜检查的数量很高，并且因此给医疗保障体系带 来很大的负担。此外，由于膀胱镜检查是一种侵害性(invasive)方法， 会使得患者十分不舒服，因此需要非侵害性技术来可靠地并且低成本地 诊断和监视膀胱癌，而这种需要还没有得到满足。
膀胱肿瘤患者的晨尿可能包含剥离肿瘤细胞，可以通过细胞学来识 别这些剥离肿瘤细胞。尿细胞学已经使用了数十年并且仍然是用于检测 膀胱肿瘤最常见的非侵害性技术。然而，其检测NMIBC的灵敏度较低 (10-20％)。已经研发了多种替代的非侵害性测试，包括一些已经由美 国食品药品监督管理局(FDA)批准的非侵害性测试：膀胱肿瘤抗原化验、 NMP22(核基质蛋白22)、ImmunoCyt(免疫细胞色素)和Urovysion。 迄今为止，由于其低特异性，这些测试均未在临床实践中实现广泛使用 (Liou,L.S.(2006)，用于检测和监测的尿路上皮癌生物标记，泌尿学 (Urology)67,25-33；Tetu,B.(2009)，从尿液诊断尿路上皮癌，模 型.病理学22(Mod.Pathol22)，增刊2，S53-S59；Wadhwa,N.、Jatawa, S.K.和Tiwari,A.(2012)，用于诊断膀胱癌的基于尿液的非侵害性测 试，临床病理学杂质(J.Clin.Pathol)，65,970-975)。
膀胱肿瘤细胞包含大量基因组改变，包括恶劣的染色体畸变、增殖、 缺失、单个核苷酸置换以及异常脱氧核糖核酸(DNA)甲基化。在单个肿 瘤中发现的改变中，只有少数改变可用于发起或者保持肿瘤性增长(“驾 驶员”)，其余改变则是对恶性表型没有影响或者具有轻微影响的“乘 客”事件。驾驶员事件和乘客事件均可以具有作为膀胱癌生物标记的潜 能，如果其是癌症特有的(即，在正常组织中未发现或者以不同的表现 水平呈现)和复发的(即，以可评估的频率出现在单独产生的肿瘤中)。 膀胱癌中最常见的突变基因包括：原癌基因FGFR3、RAS和PIK3CA以及 肿瘤抑制基因TP53。在NMIBC中，FGFR3中的突变很常见，已报道的频 率为大于60％，而TP53突变主要见于MIBC中。此外，数百基因已经在膀 胱肿瘤和正常膀胱上皮之间显示出有差别的甲基化。
过去十年的研究已经显示，可于尿沉淀分离出的DNA中检测膀胱肿 瘤特有基因组改变。根据患者群体、DNA生物标记的选择以及用于检测这 些生物标记的方法，这些研究在基于DNA的膀胱肿瘤检测上的灵敏度和 特异性上有很大差别。某些研究已经报告出的诊断灵敏度接近或者超过 90％，并且特异性接近100％(Dulaimi等人(2004)，肿瘤抑制基因甲基 化专家组的在尿液中的膀胱癌检测，Clin.CancerRes.10,1887-1893； Costa等人(2010)，三个表观遗传生物标记：GDF15、TMEFF2和VIM， 通过基于DNA的尿液样品分析来精确地预测膀胱癌，Clin.Cancer Res.16,5842-5851；Hoque等人(2006)，尿液DNA中多个基因的启动子 甲基化的定量以及膀胱癌检测，J.Natl.CancerInst.98,996-1004； Reinert等人(2011)，膀胱癌中的综合基因组甲基化分析：新的甲基化 基因的识别和确认以及将这些基因作为泌尿肿瘤标记的应用， Clin.CancerRes.27,5584-5592)。最近一项研究认为，对尿液中的 DNA生物标记进行的分析还可以用于监控没有伴随肿瘤的低风险患者的 复发性并且减少膀胱镜检查的数量(Reinert等人(2012)，基于EOMES、 HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM和ZNF154甲基化的泌尿水平的膀胱癌复发 性诊断，PLoS.One.7,e46297)。随着包括第三代聚合酶链反应(PCR) (数字PCR)和新一代测序方法的用于检测低丰度、肿瘤特有DNA的改进 方法的出现，基于尿液来检测膀胱癌的潜能极大地增加。
当使用泌尿DNA标记来检测和监视膀胱癌时，其中一个主要的挑战 在于：获取足够数量的细胞来进行下游分析。在某些研究中，由于DNA 数量的不足而导致高达35％的样品被排出分析之外(Reinert等人，2012)。 剥离到尿液中的肿瘤细胞的数量显示了很高的个体间和个体内变异性。 通常，释放的细胞数量与肿瘤大小和阶段相关联，从而较小的早期的肿 瘤释放的细胞比MIBC少。这限制了泌尿DNA标记在非侵害性检测和疾病 以及疾病恶化的监控中的有用性。
发明内容
本发明是基于发明者的如下洞察：用于捕获和储存从生物流体获取 的生物材料的便捷且有效的组件可以为患者和执业医师在病情和失调的 诊断和长期监控中提供极大优势。
本发明大体上涉及用于容易且低成本地从生物流体收集生物材料的 过滤组件以及使用这些过滤组件的方法。本发明进一步涉及用于储存从 这些流体收集的生物材料的组件以及使用这些组件的方法。
上述用于容易且低成本地从生物流体收集生物材料的组件例如可以 提供给患者在家里使用，这种组件的提供为患者带来了极大好处。所捕 获的材料可以立即储存起来，或者用于随后提供给分析师或执业医师， 或者通过邮递员邮寄至合适的医疗中心或测试机构用于分析。
本发明的组件还提供如下优势：通过访问执业医师和护理者，在患 者的家里提供医疗护理服务。所捕获的材料可以立即储存起来，或者用 于邮寄至合适的医疗中心或测试机构，或者由执业医师或护理者带到这 些医疗中心或测试机构。本发明的组件还提供如下优势：在诊所或医院 就诊和/或住院期间提供医疗护理服务。
例如，本文描述的组件和方法可以涉及尿液的收集和过滤，以便捕 获和检测与泌尿生殖器失调相关的细胞。这些失调可以包括泌尿生殖器 癌症，例如，但不限于，膀胱癌、前列腺癌和肾癌。这些失调还可以包 括：诸如子宫内膜癌的妇科癌症或者已经从其它地方转移至泌尿生殖器 的癌症。本文描述的用于尿液过滤的组件由发明者的如下洞察提出：当 前的膀胱肿瘤诊断过程具有局限性，并且通常用于患者的诊断和长期监 控的膀胱镜检查具有劣势，两者都使得患者不舒服并且给医疗保障体系 带来负担。
然而，使用本发明的组件，还可以捕获和储存与癌症之外的其它泌 尿失调相关的细胞和生物材料。
应理解，本发明的组件还可以用于从其它生物样品(例如，但不限 于，唾液、血清、血液、以及例如膀胱冲洗液的冲洗液)收集细胞(例 如，但不限于，正常上皮细胞、癌症细胞、细菌细胞或者酵母细胞)和 其它生物材料(例如，但不限于，蛋白质或者核酸)。
所述组件可包括过滤装置和储存单元。所述方法可包括通过迫使流 体通过过滤器来捕获生物材料的初始步骤，该过滤器被容置在支撑部上， 过滤器例如可移除(removable)的滤筒。在过滤之后，可以将具有过滤 内容的支撑部从过滤装置上移除并且将其放置到储存单元中，储存单元 可以容纳用于促进所捕获生物材料的储存和/或分析的合适的溶液。
相应地，在第一方面中，本发明可以提供一种生物流体过滤组件， 该生物流体过滤组件包括：用于过滤生物流体样品的过滤装置、以及储 存单元，该过滤装置具有收集室、废液池和过滤器支撑平台，该过滤器 支撑平台容置有可移除的滤筒，所述可移除的滤筒具有过滤器，所述过 滤器适用于捕获生物流体样品中存在的生物材料。其中，所述收集室、 废液池和过滤器支撑平台是可连接的，以允许生物流体从收集室经过所 述滤筒的过滤器进入到所述废液池中。并且，所述储存单元具有配置为 与可移除的滤筒接合的主体，使得当接合时，所述滤筒的过滤器被密封 在储存单元的主体内。
滤筒可以可滑动地保持在过滤器支撑平台中。即，过滤器支撑平台 可以具有凹槽，凹槽的尺寸和形状适用于容纳滤筒，使得当插入滤筒时， 过滤器就如所描述的那样放置，从而在使用时，流体通过过滤器从收集 室穿过进入到废液池中。这种可滑动接合可以通过滤筒上和凹槽中的互 补的突起和凹槽提供，以改进配合和保持，和/或提供扣合型相互作用从 而防止使用时滤筒被意外地移除。
储存单元主体可以包括凹槽，凹槽用于滑动地接收滤筒。优选地， 储存单元主体的凹槽配置为与滤筒接合，使得滤筒不会意外地移除。这 可以通过如下方式来实现：使用充分的紧密配合，或者通过在滤筒上和 凹槽中提供互补的突起和凹槽，以改进配合和保持，和/或提供扣合型相 互作用从而使滤筒保持在适当的位置。
储存单元主体可以具有开口，从而当滤筒在恰当位置时，能够访问 过滤器和/或过滤器的过滤内容和/或围绕过滤器的液体。因此，储存单 元可以进一步包括用于覆盖该开口的可移除的盖子。应理解，根据预期 用途和盖子的性质，在某些实施例中，盖子可以设置为提供凹槽以便仅 访问过滤内容(即，过滤器上捕获的供后续使用的生物材料)，或者设 置为访问供后续使用的过滤内容和/或任何周围液体。
对于某些应用，优选地，可将所捕获的生物材料在分析之前暴露 (expose)在溶液中。这可以促进分析，和/或改进储存。例如，合适的 溶液可以是，如本文所描述的适于诱导细胞溶解的缓冲剂、固定剂/防腐 剂、培养基、等渗缓冲剂、或者适于洗脱的缓冲剂。应理解，设置溶液 室和包含溶液是可选的特征。
相应地，在某些实施例中，储存单元设置为使得盖子具有溶液室， 该溶液室容纳所选择的用于促进生物材料的储存和/或分析的溶液，其 中，盖子与储存单元主体的接合使得溶液被释放从而与过滤器接触。应 理解，对于具有这种设置的组件，在过滤器上过滤和捕获生物材料后， 可以在没有盖子的情况下将滤筒插入到储存单元中。接着可以装上盖子， 从而释放溶液。
储存单元可以替代地配置为具有溶液室，该溶液室设置为使得滤筒 与储存单元的接合使溶液释放并与过滤器接触。在某些优选实施例中， 储存单元具有保持在凹槽内的活塞，该活塞和凹槽限定出远离凹槽开口 的溶液室，该溶液室容纳所选择的用于促进生物材料的储存、处理和/或 分析的溶液，活塞配置为使得将滤筒插入到凹槽中引起活塞进一步向凹 槽中移动，从而迫使该溶液室内容纳的溶液在活塞周围与过滤器接触， 并且因此与存在的任何过滤内容接触。储存单元可以设置为在溶液室中 具有合适的溶液，或者可以设置为由用户单独地在储存单元中放入溶液。 相应地，可以通过移除盖子而允许访问溶液室。
然而，应理解，本文所描述的组件可以用于仅通过使用重力，即， 通过重力渗透，来过滤生物流体，但优选地可提供构件来促进生物流体 穿过过滤器。这可以通过创建压力差来实现，例如，通过提供构件向收 集室中的流体施加压力来推动生物流体通过过滤器，或者通过提供构件 在废液池中创造真空来拉动生物流体通过过滤器。
优选地，过滤装置具有构件，，该构件能够在过滤装置被组装后向 收集室内容纳的流体施加压力，以迫使流体经过滤器进入到废液池中。 收集室本身可以是可压缩的，使得当过滤装置被组装后并且收集室容纳 流体样品时，压缩收集室向流体施加压力，从而迫使流体通过过滤器进 入到废液池中。收集室例如可以是圆柱形袋子，同时弹簧沿着袋子的圆 柱轴线包围圆柱形袋子，从而允许圆柱形袋子在其圆柱轴线的方向上压 缩。然而，可以使用替代设置。例如，收集室可以设置有活塞，该活塞 配置为：当在提供样品之后且组装了过滤装置时，迫使生物流体从收集 室通过过滤器到达废液池中。也可以使用泵系统来施加压力。
在替代设置中，可以提供用于生成真空的构件，以便拉动/抽吸流体 使其通过过滤器。这可以通过使用泵来实现，该泵设置为从废液池中抽 出空气，从而创建真空，或者废液池自身可以设置有处于真空中的室。 该室随后可以向废液池的其它部分开放(例如通过释放阀门)，以便在 过滤期间拉动流体通过过滤器。
如果使用压力差来迫使/拉动生物流体通过过滤器，则期望的是包括 一个或多个阀门，这一个或多个阀门配置为允许装置内的压力在压力/真 空的施加期间及之后保持平衡。
然而，应理解，本发明的组件可适用于过滤如本文所描述的多种生 物流体样品，但在某些优选实施例中，生物流体是尿液或者膀胱冲洗液， 最优选地为尿液。在某些其它实施例中，流体可以是血液或者血清。废 液池可以包含吸收剂和/或除臭材料，对于过滤尿液样品而言，这可以是 特别有利的。
过滤器可以选择为用于捕获需要的和如本文所描述的生物材料。优 选地，过滤器选择为用于捕获与疾病、病情或者失调(例如，癌症)的 诊断和/或预后相关的生物材料。在某些优选实施例中，生物材料是悬浮 在生物流体中的细胞，更加优选地，是悬浮在尿液中的细胞。
可以对生物材料进行测试，以便测试与疾病、病情或者失调的诊断 和/或预后相关联的标记的存在。生物材料可以是适用于测试标记的存在 的细胞，该标记指示特定疾病、病情或者失调，例如，与泌尿癌的诊断 和/或预后相关联的标记。
在另一方面，本发明可提供使用如本文所描述的组件从生物样品捕 获生物材料的方法，该方法包括：
(i)将生物流体样品提供到收集室中；
(ii)将收集室连接至过滤器支撑平台和废液池；
(iii)使生物流体样品从收集室经过过滤器流入到废液池中，以捕 获流体中存在的生物材料；以及
(iv)从过滤器支撑平台移除滤筒并将该滤筒插入到储存单元中。
该方法可以进一步包括如下步骤：例如，如果适当地设置了组件， 则通过压缩收集室向收集室中的生物流体样品施加压力，以迫使生物流 体样品通过过滤器从收集室流入到废液池中。可替代地，该方法可以进 一步包括在废液池中生成真空的步骤，以便抽吸生物流体样品使其通过 过滤器。
滤筒和储存单元组合可以提供便捷的密封单元，用于储存和/或运输 所捕获的生物材料。例如，滤筒和储存单元组合接着可以在测试之前被 储存，送到恰当的护理者(例如，执业医师)那里，或者例如通过国家 邮递员或使用国内邮递系统进行运输，两种情况均很便捷和卫生。
一旦分析师接收到滤筒和储存单元组合，就可以从过滤器和/或任何 周围液体得到所捕获的生物材料，并且如本文所描述的那样进行测试。 该测试可以有助于如本文所描述的病情的诊断和/或预后。相应地，在另 一方面中，本发明提供一种方法，其中，该方法已经通过使用如本文描 述的组件和/或方法过滤了生物流体，该方法包括如下步骤：
(i)从在过滤器上捕获的生物材料分离出核酸、蛋白质或者细胞和 /或如果存在的话从溶液中的生物材料分离出核酸、蛋白质或者细胞；以 及
(ii)测试分离出的材料，以便寻找与特定疾病、病情或者失调相 关的已知标记。
应理解，本文所描述的组件通常将以成套工具的形式提供给用户， 用户可以是患者本人或者合适的护理者，诸如执业医师。相应地，在本 发明的另一方面中，提供一种成套工具，其包括如本文所描述的任一实 施例中的收集室、过滤器支撑平台、废液池、以及储存单元，以及可选 地，包括如本文所描述的方法的说明。
应理解，在某些情况下，组件的单个元件可以单独地提供，并且本 发明还提供如本文描述的滤筒和如本文描述的储存单元，该滤筒和储存 单元可以单独地提供到组件的其它部分。
本发明包括本文描述的各方面和优选特征的任意组合，除了很显然 不被允许或者明确避免的组合之外。
附图说明
现在将参照附图通过示例的方式对本发明的实施例和方法进行描 述，其中：
图1示出了技术图，其示出了根据本发明的过滤组件的分解图。
图2示出了收集室(左)和过滤单元(右)的透视图。
图3示出了本发明的组合装置的侧视图。
图4示出了根据本发明的替代储存单元和其组件。
图5示出了HRAS外显子2的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。人细 胞系T24对于G12V突变是同型结合的。
图6示出了BCL2启动子中的6个CpG位点的焦磷酸测序分析。A) 已过滤的样品，B)未过滤的样品。
图7示出了来自pt.X(诊断为高等级Ta肿瘤)的尿液样品中的BCL2 启动子的荧光法(MethyLight)分析。只有过滤器样品才获得阳性信号； A表示“过滤器”，B表示“沉淀”。
图8示出了BCL2启动子的焦磷酸测序分析。A)来自pt.Y的已过滤 的样品，B)来自pt.Y的沉淀。
图9示出了通过使用装置进行过滤而从流体捕获肿瘤细胞，该装置 安装有8微米孔径的聚碳酸酯膜过滤器。一个实验的三重测量数据(分 别对4％的总DNA进行测量)表示为均数±SD。条形上的百分数表示相对 于输入细胞数量的回收细胞数量。
图10示出了在正常淋巴细胞的背景中，基于过滤得到的膀胱癌细胞 的富集。A)FGFR3R248C-FAM探针荧光信号的微滴数字聚合酶链反应 (ddPCR)荧光幅度图(上面)和FGFR3WT-HEX探针荧光信号(下面) 的ddPCR荧光幅度图。B)条形图，示出了相对于输入肿瘤细胞数量的突 变体和野生型(WT)FGFR分子的数量。FGFR分子的总数量是基于三个 独立的ddPCR测试来计算的，三个独立的ddPCR测试分别使用4％的总DNA 作为样板，并且表示为均数±SD。条形上的百分数表示相对于输入细胞 数量的回收细胞数量。
图11示出了在成对尿液样品中肿瘤派生(tumor-derived)DNA的检 测，通过装置过滤和沉积来制备上述尿液样品。通过使用ddPCR，针对 FGFR3突变，对来自过滤器和沉淀的等摩尔量的DNA进行测试。
具体实施方式
本发明的如下应用以示例的方式提供，并且没有限制作用。
组件
图1示出了根据本发明的、组装的生物流体过滤组件的部件分解图。 所组装的装置及其使用在图3中示出，同时，图2示出了通过连接以提 供所组装的装置之前的收集室(左)和由过滤器支撑平台和废液池组装 而成的过滤单元(右)。
收集室1是顶部开口的，以便便于提供样品。收集室由不透水材料 的圆柱形袋子3制成，其长度大约为100mm并且直径大约为95mm，并 且适合用于容置大约500mL的容量，以便便于当分析尿液样品时提供样 品和最大量DNA。应理解，其它尺寸和容量也可以适用于收集尿液和其它 生物流体样品。例如，对于某些用途，用于容置20mL至250mL的容量 的尺寸可能是合适的。相应地，在某些实施例中，收集室适合用于容置 高达400mL、300mL、250mL、100mL、50mL、或者直到20mL的容量。 尽管对于尿液收集，较大容量可能是合适的，但对于例如唾液的过滤， 可优选较小容量。
圆柱形袋子容纳在弹簧5内，弹簧向收集室的圆柱形袋子传递一定 刚度。盖子7位于圆柱形袋子的密封端部处并且环形弹簧附接部分9位 于圆柱形袋子的开口端部处，环形弹簧附接部分环绕圆柱形袋子的开口 端部，而实质上没有封闭开口部分。弹簧5一端连接或邻接盖子7并且 另一端连接或邻接环形附接部分9。盖子7和环形弹簧附接部分9是刚性 的并且由塑料材料制成，尽管也可以使用其它适合的刚性材料，例如， 诸如不锈钢的金属。盖子7是圆形的且无孔的，其直径略大于圆柱形袋 子的直径。盖子以如下方式成形：当组装时，其突出到圆柱形袋子的空 间中，尽管也可以使用平面盖子或者穿孔盖子。弹簧(其由盖子保持) 和环形弹簧附接部分的使用允许收集室在收集室的圆柱轴线的方向上收 缩。也可以使用其它有相同功能的合适构件，例如，一系列围绕圆柱形 袋子的弹簧或者一系列伸缩杆。在这些情况下，可以使用圆柱形之外的 其它形状的袋子。收集室具有锁环附接件11，环形弹簧附接部分9可以 通过扣合作用而固定至锁环附接件。也可以使用其它固定构件，包括互 补螺纹和可旋转的接合凸耳。
收集室可经由锁环附接件11连接至过滤单元13，从而组装完整的过 滤装置。该连接需要基本上不透水，以便允许在使用如本文描述的装置 时，在过滤之前不会损失流体，通过使用保持在过滤单元顶部周围的环 形槽中的O形环14来改进密封性。过滤单元13具有过滤器支撑平台15。 位于过滤器支撑平台15上的小突起与环形附接部分9中的互补凹痕接 合。应理解，可替代地，可以提供其它附接构件。
过滤器支撑平台15具有可移除的滤筒17，可移除的滤筒具有膜过滤 器19，并且过滤器支撑平台可连接至废液池21。应理解，也可以使用如 本文描述的其它过滤材料。废液池21是由塑料材料制成的刚性圆柱形容 器，能够容置至少500mL的容量(即，在过滤之前容纳在收集室中的液 体的总容量)。可以使用其它适合用于接收流体的合适的刚性材料来代 替塑料材料。废液池21和过滤器支撑平台15可连接为与滤筒17一起形 成过滤单元13。该连接需要基本上不透水，以便允许在使用如本文描述 的装置时，在过滤期间不会损失流体。在该实施例中，废液池21和过滤 器支撑平台15可通过如下方式连接：通过废液池21外部上的突起与过 滤器支撑平台15内部上的环形槽之间的扣合连接。在某些实施例中，废 液池21包含吸湿材料和/或除臭剂。适合的吸湿材料可包括吸收性材料， 诸如纸张、原棉或海绵、或者硅胶和/或本领域中已知的其它吸水聚合物。 包含吸湿材料改善了在使用之后对废液池的处理。适合的除臭剂可包括 诸如碳酸钾的碳酸盐。
图1所示的分解图示出了过滤器支撑平台15的组成部件。一般来说， 过滤器支撑平台可连接至收集室的开口端部和废液池，并且当装置完全 组装时，使收集室和废液池隔开。过滤器支撑平台具有开口23，以允许 收集室与废液池和过滤器支撑部分的过滤器19流体连通，在这种情况下， 滤筒17封闭该开口，从而使任何从收集室流到废液池的流体均通过过滤 器。过滤器支撑平台具有槽形凹部25，该槽形凹部适用于接收滤筒17， 从而使滤筒的过滤器如所描述的那样封闭开口。滤筒可以以滑动移动方 式插入槽形凹部中以及从槽形凹部中移除。
如在图1中示出的，过滤器支撑平台由顶部部分27和底部部分29 组装，顶部部分和底部部分通过顶部部分上的突起和底部部分上的互补 凹槽之间的扣合连接而夹在一起。也可以设想其它连接方式，包括其它 扣合作用和互补螺纹。图1中示出的实施例具有两个手柄31和32，以便 于使用。应理解，手柄不是必须的，并且也可以使用其它手柄布置，例 如，单个手柄、连续环形手柄、或者一个或多个D形手柄。
当紧固在一起时，顶部部分27和底部部分29限定出凹槽25，凹槽 25适用于接收所描述的滤筒17。提供O形环33以防止使用期间的泄漏。 过滤器支撑平台进一步包括回流膜35和泄压阀37。泄压阀配置为在特定 压力下致动，以便当过滤器饱和时允许液体穿过到废液池中。回流膜35 适用于：在间歇性地施加压力期间，允许空气从废液池21穿过到收集室 1中，间歇性地施加压力是为了防止过滤内容由于湍流而变得混乱。在 29中还具有小孔(未示出)，该小孔允许空气完全从该单元排出。在该 实施例中，泄压阀是伞型阀，其在10-12kg压力下打开，但也可以使用 其它合适的阀门。
滤筒17具有主体，主体的宽度与凹槽的宽度互补，并且其长度足够 长以便使得主体的一部分在使用期间从槽形凹部上突出(如图2所示)， 从而便于从装置上移除滤筒。滤筒壳体可具有一个或多个缺口或者孔眼 41，以改善夹固性并且有助于移除。过滤器19容置于滤筒壳体中的开口 内的壁架(ledge)上并且由穿孔的上部支撑部43保持到位，穿孔的上 部支撑部通过在其上的突起与壳体中的互补凹槽之间的扣合连接而连接 至壳体。也可以设想其它连接方式，包括其它扣合作用和互补螺纹。O 形环45、47和48改善密封性。O形环47改善所组装的滤筒17在过滤器 19周围的密封性，而O形环45和48则存在于滤筒17的外表面上，并且 当滤筒17容置于过滤器支撑平台内用于过滤生物流体时，两者均用于改 善密封性，以及当滤筒17插入到根据本发明的储存单元49中时，均用 于改善密封性。
图1还示出了根据本发明的储存单元49。在使用之后可以将滤筒17插入到储存单元49中，以方便储存和运输并且可以在储存期间保存样品。储存单元49还提供了一种这样的构件，该构件用于促进对用于分析的过滤内容(和任何周围液体)的访问，而不需要从储存单元移除滤筒。如在图1中示出，一般来说，储存单元包括具有凹槽53的基座51，凹槽适用于接收滤筒。基座具有开口55，以便当插入滤筒时，允许访问用于分析和处理的过滤内容。该开口由盖子57覆盖，以便保存样品并且允许进行储存和运输。在图1中，盖子通过互补螺纹连接至基座，尽管也可以设想其它连接方式，包括合适的扣合作用或者铰接盖子。盖子57包括容纳有合适液体的室，该室在盖子与基座51接合期间释放。例如，盖子可以是来自的由DNA研发的OG-250盖子，并且包含DNA裂解缓冲液。基座51具有尖突出，当将盖子旋拧到基座上时，该尖突出打破盖子中的室的密封，从而释放出溶液。移除盖子以进行分析，从而不仅允许访问过滤内容，也允许访问所容纳的溶液，过滤内容储存在该溶液中。滤筒17和储存单元49在过滤器、过滤内容以及任何可能存在的周围液体的周围形成水密封。
图4示出了根据本发明的替代储存单元和其组件。储存单元490包 括壳体510，壳体510具有适用于接收滤筒的凹槽530和第一开口550， 以便当插入滤筒时，允许访问过滤内容。盖子570通过壳体上的突起与 盖子上的互补凹槽之间的滑动配合而与壳体接合，并且通过与挡板相抵 接且通过固定夹保持在恰当位置。储存单元还具有底部571，底部以与盖 子类似的方式与壳体接合。活塞600保持在凹槽内第一开口之外的点处， 并且在凹槽的远离凹槽开口的端部处限定出室602。壳体具有在该室中的 第二开口603。室602适用于接收流体，这些流体例如但不限于，用于细 胞溶解以及核酸和/或蛋白质保存的缓冲剂、用于制备保留有特征形态 (用于细胞学检查)的细胞的固定剂/防腐剂、维持细胞生长的培养基、 或者适用于储存生物材料的等渗缓冲剂、或者用于从过滤器洗脱生物材 料的合适的缓冲剂。相应地，在某些实施例中，储存单元在室内提供有 这种类型的合适的流体。应理解，可以根据待储存的样品的性质和随后 的分析需要来选择流体。
活塞600保持在凹槽内，但是例如通过插入滤筒来施加压力能够进 一步向凹槽中推动活塞，从而减小室的尺寸并且迫使室中的流体进入到 凹槽的其它部分中，并与过滤器和过滤内容接触。滤筒17和储存单元490 在过滤器、过滤内容以及任何可能存在的周围液体的周围形成水密封。 应理解，为了实现所述水密封，改变滤筒和储存单元的尺寸以及提供和 放置合适的O形环对于技术人员而言是显而易见的。
组件和使用
本发明的组件可以作为成套工具直接提供给用户，然后用户可以：
将样品提供到收集室中，如本文所描述的那样组装该装置；
使用如本文所描述的装置来过滤样品；
移除滤筒；以及
将过滤器部分插入到如本文所描述的储存单元中，以便运输给合适 的护理者或者合适的医疗中心或测试机构。
有利的是，根据本发明的组件可以在家里使用，将样品可选地储存 在所选择的溶液中以易于储存和/或分析所捕获的材料，并且将样品运输 给相关的护理者或者合适的医疗中心或测试机构。根据本发明的储存单 元的使用例如允许通过使用普通国家邮递服务来卫生地且有效地运送样 品，该样品根据本发明的方法在过滤器上捕获。被认为有患例如膀胱癌 风险的患者或者目前正从膀胱癌恢复的患者需要经常进行定期的膀胱镜 检查，因此必须频繁地去医院，这很不方便。膀胱镜检查通常令人不舒 服并且可能带有并发症的风险。膀胱镜检查对于医疗保健服务提供者而 言还很昂贵。因此，提供用于在家里获取和处理样品的合适的装置或者 成套工具对于患者幸福来说是一项重大的改进，而由这种合适的装置或 者成套工具获取的样品可以在不需要患者参与的情况下进行分析。
因此，在本发明的某些实施例中，提供了成套工具，其包括：如本 文描述的收集室和如本文描述的过滤单元、以及可选地如本文描述的方 法中的组件的使用操作指南。在某些实施例中，提供的过滤单元是完全 组装的。接着，例如通过正常排尿来将样品提供到收集室中。接着将过 滤单元固定至收集室。接着，用户翻转组装后的装置，使收集室现在在 装置的顶部处倒置，如图3所示，并且接着提供手动压力以迫使液体通 过过滤器到达废液池中。一个或多个阀门和/或回流膜的提供允许装置内 的压力达到平衡。在流体流过过滤器期间，生物材料(例如，细胞)就 被捕获到过滤器上。所捕获材料的量和类型可以根据使用的过滤器的不 同类型(诸如但不限于，膜过滤器或者滤珠过滤器)或者不同性能(诸 如但不限于，不同的孔径或者涂层)而不同。在过滤之后，移除带有过 滤内容的滤筒并且可以丢弃装置的其它部分。在滤筒被保持在凹槽或者 凹处的实施例中，用户仅需将滤筒从装置的其它部分中拉出来。本发明 的成套工具还可包括如本文所描述的储存单元。接着用户将滤筒插入到 储存单元中以便于储存和运输，例如在图4中所示。在某些实施例中， 储存单元提供为盖子和基座(在图1中，分别由57和51表示)。在这 些实施例中，首先将滤筒插入到基座51中。接着添加盖子57，盖子与基 座的接合使得盖子内容纳溶液的室的密封被打破，从而释放溶液使其与 过滤内容接触。
在某些实施例中，储存单元提供为单个单元(在图4中表示为490)。 该储存单元包括活塞，活塞保持在凹槽内第一开口之外的点处，并且在 凹槽的远离凹槽开口的端部处限定出室。储存单元的基座具有在室中的 第二开口。该室容纳溶液，例如但不限于，用于细胞溶解和核酸保存的 缓冲剂、用于制备保留有特征形态(用于细胞学检查)的细胞的固定剂/ 防腐剂、或者维持细胞生长的培养基。将滤筒插入到储存单元的凹槽中， 这进一步向凹槽中推动活塞，从而减小室的尺寸并且迫使室中的液体到 活塞周围且与过滤内容接触，在储存和运输期间可以保持在这里。
接着，可以便捷地且卫生地将组合的滤筒和储存单元运输至测试/分 析机构或者合适的医疗中心。通过移除盖子(在图1或者图4中分别由 57或者570表示)揭开储存单元壳体中的相关开口，从而有助于访问过 滤内容。可以在存在或者不存在特定的已知标记(用于提供诊断)的情 况下，使用本领域中已知的方法和本文描述的方法来分析过滤内容，过 滤内容例如DNA。
可替代地，组件可以提供为成套工具，该成套工具包括：还未固定 在一起的废液池和过滤器支撑基座。在这些实施例中，用户首先必须组 装过滤单元。应理解，由于可以根据预期用途来具体地选择滤筒和储存 单元，所以滤筒和储存单元(可选地包括容置于如本文描述的室内的溶 液)可以单独地提供至组件的其它部分。
合适的过滤器
本发明是基于发明者的如下洞察：包括特定且合适的过滤器的装置 可以用于从生物流体捕获材料以进行有效的分析，以便用在相关病情和 疾病的诊断和监控中。
在某些实施例中，本发明的组件和方法可以用于从生物流体捕获细 胞。之前的研究已经显示，能够使用机械过滤来从流体捕获和分离细胞 (Wilding等人，1998；Mohamed等人，2004；Zheng等人，2007；Lin 等人，2010)。然而，这些方法没有一个提供了与本发明的组件和方法 相关联的便捷性和效率，即，提供用于低成本地且容易地收集和处理样 品的组件，患者或者其它护理者可以使用该组件来提供捕获的细胞样品， 捕获的细胞样品适用于通过邮寄储存和送到测试机构或者合适的医疗中 心。
任何具有用于捕获有关(interest)材料的必要特征的过滤材料均 可用在本发明的组件和方法中。应理解，为了不同疾病和病情的检测、 诊断和监控，本发明的组件和方法可用于从不同的生物流体捕获不同类 型的生物材料。相应地，应理解，过滤器可以从本领域中已知的过滤介 质中选择以便具有特定的期望特性，并且在某些情况下，需要提供连续 的多重过滤器。在使用多重过滤器的情况下，每个过滤器可以是相同的， 或者与组件中的任何其它过滤器具有不同的特征。
例如，可以通过如下方式来实现捕获不同尺寸和不同类型的细胞： 使用配置为排除特定尺寸或形式的细胞的过滤器或者多重过滤器，最适 合的是通过选择过滤器孔径和/或孔布置形式。在某些实施例中，可能需 要提供两个或多个连续的过滤器，其中，第一过滤器捕获较大细胞(例 如，人体细胞)并且具有较小孔径的第二过滤器捕获较小细胞(例如， 细菌细胞)。可以通过使用特定孔径或者其它孔径、或者通过使用特定 的孔形式来实现尺寸排除。
还可以使用由材料制成的或者具有涂层的过滤器，这些过滤器专门 设计用于捕获特定材料，例如，诸如蛋白质、DNA、RNA和代谢分子的大 分子。
如下过滤器特性的示例可用在本发明的某些实施例中，这些示例以 说明的方式提供，而不意在将本发明限制为任何特定的过滤器类型。这 些过滤器以及其它合适的过滤器在本领域中是已知的，并且可以在市场 上买到。
为了捕获细菌细胞，可以优选约为0.5μm至4μm的孔径。为了 捕获病毒颗粒、病毒或者噬菌体，可以使用约为20nm至300nm，更加 优选地约为20nm至约50nm的孔径。为了捕获没有血小板的血液成分， 可以优选约为4μm至10μm的孔径。为了捕获没有红细胞的血液成分， 可以优选约为7μm至12μm的孔径。为了捕获肿瘤细胞，可以优选约 为8μm至20μm，尤其优选约为8μm至12μm，最优选的是约8μ m的孔径。为了捕获大分子，可以使用超滤膜过滤器，其具有选择用于捕 获有关大分子的特定分子重量阻隔极限(例如，但不限于，50kDa)。 可替代地，捕获剂(诸如特定于有关蛋白质的抗体或者具有与该蛋白质 序列互补的核酸)可以粘附至过滤介质(例如，但不限于，诸如由尼龙、 聚偏(二)氟乙烯或硝化纤维制成的膜过滤器、或者诸如琼脂糖或磁珠 等层析介质)，从而允许在过滤期间捕获有关大分子。根据情况而定， 过滤器可以由合适的聚合材料(诸如，聚碳酸酯、尼龙或聚对二甲苯) 或者适合的非聚合材料(诸如，硅树脂)制成。
对于某些应用，可以优选膜过滤器，例如，在从尿液捕获细胞时。 膜过滤器可以是聚碳酸酯膜，优选的是聚碳酸酯亲水膜，例如，追踪蚀 刻(track-etched)聚碳酸酯亲水膜。过滤器具有约为5-10μm的孔径， 优选地约为8μm。优选的膜过滤器可以包括微膜过滤器，诸如，市场上 可以买到的聚碳酸酯过滤器，例如，沃特曼核孔(WhatmanNuclepore) 追踪蚀刻聚碳酸酯亲水过滤器(直径25mm，孔径8μm)。
合适的溶液
在某些实施例中，储存单元容纳所选择的用于方便储存和/或分析生 物材料的溶液。溶液例如可以是，缓冲剂，其适用于诱导细胞溶解以允 许对细胞释放的核酸或蛋白质进行分析；固定剂/防腐剂，其用于制备保 留有特征形态的细胞；培养基，其用于维持细胞生长；等渗缓冲剂，其 适用于生物材料的储存，例如磷酸盐缓冲盐溶液；或者用于从过滤器中 洗脱生物材料的合适的缓冲剂。应理解，溶液将优选地选择为与待捕获 的生物材料和待执行的分析相对应。
在某些实施例中，本发明的组件可以用于从尿液收集剥离的肿瘤细 胞，目的在于分析其DNA的改变。例如，这可以使用孔径为8μm的聚 碳酸酯膜过滤器来捕获肿瘤细胞，然后将滤筒插入到储存单元中，并且 可选地，将诸如可从Qiagen(凯杰)或者DANGenotek买到的细胞溶解 和核酸保存溶液[例如，如在WO2003104251A9中所描述的]释放到过滤 内容上。
如果目的是分析肿瘤细胞中特定蛋白质的水平，则释放到过滤内容 上的溶液例如可以是，诸如里帕(RIPA)裂解液(可从密理博(Millipore) 买到)或者细胞提取缓冲液(可从Invitrogen(英杰)买到)的细胞溶 解和蛋白质保存溶液。
如果目的是通过细胞学分析细胞，则释放到过滤内容上的溶液例如 可以是，防腐剂缓冲剂，例如可从豪洛捷(Hologic)买到的(含有甲醇 的保存液(PreservCyt)溶液)；或者细胞生长培养基，例如，补充有 10％的血清(FBS)、1％的L-谷氨酰胺、100U/ml盘尼西林和100μg/ml 链霉素的细胞培养基(DMEM)。
在某些实施例和方法中，本发明的组件可以用于从尿液收集特定无 细胞蛋白质，例如，通过使用由涂有蛋白质A/G的琼脂糖滤珠组成的过 滤器，而与有关蛋白质结合的抗体附着至该琼脂糖滤珠，接着将滤筒放 置到储存单元中，并且可选地将诸如磷酸盐缓冲盐水的等渗缓冲剂释放 到过滤内容上。
本发明在医学检测、诊断和监控中的应用
如本文所描述的用于从生物流体收集生物材料，以及随后的储存和 可选地处理所述生物材料的组件和方法，尤其与疾病和病情的检测、诊 断和监控相关联。
尽管优选实施例是关于从尿液样品收集细胞，以检测泌尿生殖器癌 症，尤其是膀胱癌，但应理解，通过选择合适的过滤器、装置尺寸以及 (如果存在的话)储存单元中的室内容纳的流体，本文所描述的组件和 方法也可以用于检测、诊断和监控各种疾病和病情。例如，在前列腺癌 和肾癌中，存在肿瘤细胞中的基因(诸如GSTP1、VHL、APCRASSF1A、 Timp-3)的甲基化检测，而这些肿瘤细胞来自尿沉淀(Caims等人，癌症 自然评论(NatureReviewsCancer)2007；7:531-543)。同样，线粒 体DNA的变化检测对于早期癌症检测、疾病进展监控和治疗反馈可能是 有用的，并且体液中存在的剥离肿瘤细胞可为线粒体DNA的一个来源 (GabrielDakubo第11章(MitochondrialDNAmeasurementin ExfoliatedCellsforCancerDetectionandMonitoring:Thecopy NumberAdvantageinMitochondrialGeneticsandCancer2010(用 于癌症检测和监测的脱落细胞中线粒体的DNA测量：线粒体基因和癌症 中的复制数据优势2010)，第259-274页，ISBN：978-3-642-11415-1 (印刷)978-3-642-11416-8(在线))。对尿沉淀中MCM5的提升含量 的检测也可以用于预测膀胱癌(Stober等人，美国国立癌症研究所杂志 (JNatlCancerInst)2002；94:1071-9)。此外，已经对从尿沉淀 分离出的RNA进行了分析以便诊断肾移植后的急性排斥反应，这为肾活 检的替代提供了潜能(Suthanthiran等人，N.Engl.J.Med.2013；369: 20-31)。
本发明的组件和方法可以用于捕获尿液或者其它流体中的自由大分 子(例如，蛋白质、DNA、RNA或者代谢分子)。例如，卵巢癌患者的糖 基化嗜曙红细胞派生神经毒素、人绒毛膜促性腺激素的COOH-末端骨调素 段和β-亚基核心段、其尿液中的可溶性间皮素相关肽(SMRP)和Bcl-2 水平已经表现出变化(DasandBastBiomarkMed(Das与Bast生物标 记医学杂志)2008；2(3):291-303)。尿液中的S100A6和S100A9蛋 白质的检测可以用于检测上消化道癌(Husi等人，蛋白质组学临床应用 (ProteomicsClinAppl).2011；5(5-6):289-99)，而尿液中的 SAA4和ProEGF蛋白质的检测则可以用于检测膀胱癌(Chen等人，蛋白 组学杂志(JournalofProteomics)2013,85:28-43)。
本文描述的组件和方法还可以用于收集和过滤其它生物流体，诸如 唾液、痰和血液、以及通过使用更加侵害性方法获取的体液，诸如例如， 胸腔积液、灌洗液(例如，导管灌洗、支气管肺泡灌洗)以及血清，用 于分析所捕获的材料，包括通过对与特定疾病和失调(包括诸如肺癌和 乳腺癌的癌症)相关的基因组改变进行检测(Belinsky等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA,95:11891-11896,1989；Ahrendt等人，J.Natl.Cancer Inst.,91:332-339,1999；Evron等人，Lancet,357:1335-1336,2001)。
血液的过滤和浓缩也可以用在对循环肿瘤细胞(CTC)的分离和分析 中。CTC的分离和表征(characterization)是一个技术挑战，这是因为 其仅占血液中存在的总细胞的一小部分。然而，由于CTC反映了肿块内 细胞的分子特征，所以其提供了一种潜在的相对的非侵害性方式来诊断 或者监控患者的进展/反馈。已经在诸如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢 癌和结肠癌患者的癌症中识别出了CTC，其中，已经显示出，CTC在这些 癌症中提供了预测信息和预后信息。在胰腺癌患者中也已经识别出了 CTC，但还没有进行使用CTC来引导临床治疗的关键研究(Cen等人，生 物化学与生物物理学学报(BiochimicaetBiophysicaActa)2012；1826: 350-356)。从具有前列腺癌、结肠直肠癌和乳腺癌的患者的血液中捕获 到循环肿瘤细胞已经显示出，能够使用利用如下优势的方法：肿瘤细胞 的尺寸比正常细胞大。通过选择恰当的过滤器，本文中描述的组件和方 法也可以适用于捕获和分析循环无细胞DNA(cf-DNA)。
相应地，本文描述的方法可以涉及如下步骤：对已知的与特定疾病 或病情相关联的标记进行测试。所述标记可以是如本文所描述的和如本 领域中文件所记载的基因标记、基因组改变、蛋白质(例如，抗体)的 出现或者含量提升/减少、细菌或酵母菌的出现或者含量的提升/减少。
在本文描述的某些方法中，标记可以是已知的与癌症相关联的标记。 癌症可以是泌尿癌或者妇科癌，例如，膀胱癌、前列腺癌、肾癌、尿道 癌、输尿管癌、尿道上皮癌、脐尿管癌、子宫内膜癌或者卵巢癌。癌症 可以是与其它器官相关联的癌症，例如，肝癌、黑素瘤、结肠直肠癌、 头部癌症和颈部癌症、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、或者上消化道癌。癌症 可以是转移性癌症。与这些癌症和其它癌症相关联的标记在本领域中是 已知的。在某些优选实施例中，标记与泌尿生殖器癌症相关联，优选地 与膀胱癌、前列腺癌、或肾癌相关联。在某些优选实施例中，标记与膀 胱癌相关联，更加优选地与非肌肉侵害性膀胱癌相关联。
在某些实施例中，标记与癌症之外的病情相关联。例如，标记可以 与肾移植中的急性排斥反应相关联，这具有如下优势：潜在地避免了进 行侵害性肾活检的需要；或者标记与细菌和/或酵母菌感染相关联，例如， 诸如膀胱炎和肾盂肾炎的尿路感染。
还应理解，在本发明的某些方法中，标记本身可以不与疾病或者病 情相关联，相反，可以是与个体或者特定血统相关联的基因标志，例如， 用于司法鉴定和亲子鉴定中。
样品分析
应理解，用于分析过滤内容以及(如果存在的话)溶液(具有过滤 内容的过滤器储存在该溶液中)的方法将取决于生物材料的性质和分析 的目的。用于处理材料和/或溶液以及用于检测有关标记的方法在本文进 行了描述并且在本领域中是已知的。
本文描述的组件和方法可以与和成套工具一起使用。这些系统的问题在于尿液的运输以及细胞数量低和这些样品中的肿瘤细胞的比例低。本文中描述的提供了恰当的保存方式、细胞离析方式并增加了肿瘤细胞的比例的组件和方法可以改善使用。在最近的一项研究中，将荧光原位杂交(FISH)分析(UroVysion)与细胞学和膀胱镜检查进行比较，以作为接续方法，Galvan等人(癌症细胞病理学(CancerCytopathol)2011；119:395-403)注意到：由于样品中的尿道上皮细胞太少或者其它技术原因，所以约10％的样品不能进行分析。已经在研究中使用追踪蚀刻商用过滤器过滤并结合FISH分析，并且与使用传统制备方法进行的其它研究相比，这提高了检测的灵敏度(Meiers等人，ArchPatholLabMed(病理和实验室医学文献集)2007；131:1574-1577)。Meiers等人使用了具有8μm孔径的过滤器并且发现其在收集上皮细胞上的效果极好。作者认为，灵敏度增加的部分原因是通过过滤创建了单层细胞制备。然而，本发明的发明者认为，这至少可以部分地归功于样品中肿瘤细胞比例增加的影响。Meiers等人注意到：与通过传统方法得到的85％的充足率相比，通过该过滤方法得到的充足率为95％，这显示了FISH分析的稳健性也通过过滤得到了提高，并且因此通过使用本文提供的组件和方法可以提高稳健性。
本发明的特殊优势
本发明的主要应用在于膀胱癌的诊断和监控。本发明研发用于提供 简单的方式来从尿液中捕获膀胱肿瘤细胞并且储存/保存来自这些细胞 的DNA以供后续分析。重要优势包括：
1)组件的成本低；
2)组件使用简单，使得其适合于在家里使用；
3)通过使用容纳有合适溶液的储存单元，在过滤之后立即对生物材 料进行处理，以便在分析之前对样品进行保存和/或处理；
4)可以通过基于尺寸的过滤来增加肿瘤细胞的比例，从而提高检测 的灵敏度；
5)过滤内容(例如，所捕获的细胞)可以通过普通邮递运输至合适 的医疗中心或者测试机构，从而减少了与医疗保障体系接触的需要；
6)定期地和重复地采样是没有问题的，以及
7)与膀胱镜检查相比，使用该装置来诊断和监控膀胱癌将会改善患 者的生活质量并且极大地降低医疗保健费用。
示例
列出如下示例是为了给本领域的技术人员提供如何实践本发明的完 整的公开和描述，并且不意在限制本发明的范围。
微膜过滤器上的细胞的捕获
下面描述了利用膜过滤器从尿液捕获细胞以进行分析。
收集样品
从承认在丹麦赫乐福医院进行膀胱镜检查和经尿道膀胱肿瘤切除术 (TURBT)的膀胱癌患者以及没有已知泌尿恶性肿瘤的健康志愿者收集晨 尿样品。将样品送到“丹麦癌症研究中心”，在收集之后的4-6个小时 内，在这里对样品进行处理。
尿液样品的处理
针对所有患者和对照者，从每种尿液样品取出50ml，通过10分钟 2000×g的离心分离进行沉积，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗浮筒 (pellet)后，再次进行10分钟的离心分离。丢弃上层清液并且再次将 浮筒悬浮到大约200μl的PBS中。并行地,将来自相同样品的尿液抽入 一次性注射器，并且通过正向力迫使其通过安装在过滤器保持器中的膜 过滤器。使用直径25nm，孔径8μm的WhatmanNuclepore追踪蚀刻 聚碳酸酯亲水过滤器以及相应的过滤器保持器。使样品通过过滤器直到 饱和，最多为125ml。在从过滤器保持器移除过滤器之前，使用PBS冲 洗过滤器。将尿液沉淀和过滤器均储存在-80℃下，直到进行进一步处理。
为了测试储存单元的功能，将滤筒转移至储存盒，储存盒这时安装 有盖子，盖子来自“OrageneDNA自收集成套工具”(盘格式OG-250， 加拿大安大略渥太华DANGenotek公司)。
DNA分离和亚硫酸氢盐转化
通过“QiaAmpDNA迷你成套工具”(德国希尔登QiagenGmbH公司) 从尿液沉淀和过滤器分离出DNA。使用ATL缓冲剂和蛋白酶K在56℃下 培养过滤器样品和尿液沉淀至少1小时(过滤器)或者整夜(沉淀)。 根据制造商的使用指南来进行随后的处理。来自过滤器和沉淀的DNA分 别在50μl和100μl的缓冲剂AE中进行洗脱并且储存在-80℃下。使 用NanoDrop1000分光仪来测量DNA浓度。来自16个患者和9个健康对 照者的样品包含的DNA不足以用于分析并被丢弃。
使用“EZDNAMethylation-Gold(EZDNA甲基化-黄金)成套工具” (ZymoResearch公司)根据制造商的协议进行亚硫酸氢盐转化。由亚硫 酸氢盐处理后的DNA在20μl的“M-洗脱(M-Elution)缓冲剂”中进 行洗脱并且储存在-80℃下。针对成对样品(沉淀和过滤器样品)，使用 相同量的DNA，最多500ng。在DNA浓度太低从而不能使用NanoDrop分 光仪精确地确定的情况下，则使用最大样品容量(20μl)来进行亚硫 酸氢盐处理。使用前面描述的引物、探针和条件[12]，使用基于TaqMan 的实时PCR(荧光法)化验来进行BCL2、CCNA1、EOMES、HOXA9、POU4F2、 SALL3和VIM2的启动子CpG岛的半定量分析。使用“LightCycler480 探针主要成套工具”(德国曼海姆罗氏(Roche))在LightCyler480 平台上执行反应，每次反应使用1μl的由亚硫酸氢盐处理后的DNA。体 外甲基化DNA(体外成熟(IVM)；马萨诸塞州比勒利卡抗体/密理博 (Chemicon/Millipore)，CpGenomeTM通用甲基化DNA)和全基因组放 大DNA分别作为甲基化的阳性对照和阴性对照。甲基化水平通过如下方 式计算为甲基化百分率参考(PMR；参照[WeisenbergerDJ、CampanM、 LongTI、KimM、WoodsC等人(2005)，核酸研究(NucleicAcidsRes) 33：6823-6836])：使标记-特定反应值标准化为相对的相同值的ALUC4 值，以便进行完全甲基化对照(IVM)。排除浓度小于0.25ng/μl非亚 硫酸氢盐处理的DNA的浓度的样品。HOXA9、POU4F2、SALL3和VIM2的临 界PMR值分别是3、2、0.5和2。在从健康对照者的尿液过滤器样品和沉 淀样品分离出的DNA中，BCL2、CCNAI和EOMES没有显示出背景甲基化。
实时定量甲基化-特定聚合酶链反应(荧光法)
使用荧光法、定量的基于荧光的实时PCR化验(Eads等人，2000NucleicAcidsRes.28E32)来进行甲基化分析。为7个基因启动子CpG岛和ALUC4设计引物和探针，ALUC4用于输入DNA量的对照(Weisenberger等人，2005，NucleicAcidsRes.33,6823-6836)。对亚硫酸氢盐转化后的体外甲基化DNA(体外成熟(IVM)；Chemicon公司CpGenomeTM通用甲基化DNA)进行分析，以便对目标基因与ALUC4之间的任何扩增偏移进行标准化。使用“LightCycler480探针主要成套工具”(罗氏)在罗氏480实时PCR系统上执行反应。
细胞培养和模式系统
从DSMZ(德国微生物菌种保障中心)(布伦瑞克，德国)购买人类 输尿管移行性细胞癌细胞系639V。将细胞在37℃下保持在具有5％的CO2的湿润培养箱中的DMEM介质中，同时向EMEM介质中补充10％的胎牛血清。 根据之前描述协议从周边血液制备健康捐赠者的淋巴细胞[ThurnerB、 RoderC、DieckmannD、HeuerM等人(1999)免疫学方法杂志(JImmunol Methods)223:1-15]，并且储存在-80℃下，直到使用。对悬浮中的细 胞进行计数并且使用“伯爵夫人(Countess)自动细胞计数器”(美国 加利福尼亚卡尔斯巴德Invitrogen公司)来测量细胞的直径。将淋巴细 胞和639V细胞以不同的比率混合在100ml的PBS中并且使用过滤装置 进行处理。
突变分析
使用QX200系统(伯乐生命医学产品(Bio-RadLaboratories)公 司，赫库勒兹(Hercules)，加利福尼亚)和基于探针的水解化验(PrimePCR ddPCR突变检测化验，Bio-Rad公司)，通过微滴数字PCR(ddPCR)来执 行对FGFR3突变(R248C、S249C、G370C和Y373C)以及相应的野生型序 列的检测和量化。最终容量为22μl的PCR混合物包含：11μl的ddPCR 微滴探针超级混合物(没有dUTP(脱氧三磷酸尿苷)、1.1μl的突变 引物/探针混合物(FAM)、1.1μl的野生型引物/探针混合物(HEX)、 以及2μl的DNA。将二十微升这种混合物和70μl微滴生成油转移至 微滴生成筒的不同加样孔(well)。在使用微滴生成器形成微滴后，将 样品转移至具有96个加样孔的PCR板并且使其在94℃下进行30秒的40 个周期的扩增，以及在55℃下进行60秒的40个周期的扩增。在微滴读 数器上对微滴(每次反应平均～16000滴)进行分析，并且使用Quantasoft 软件(版本1.4.0.99)来分析DNA浓度。使用突变阳性和阴性对照DNA 样品来确定临界设置点。
发明者首先使用培养细胞来测试：1)是否能够在商用微膜过滤器上 捕获细胞，以及2)是否能够使低丰度膀胱肿瘤细胞变多。将在PBS中进 行稀释的纯净的培养的人类淋巴细胞，加入0.5％的膀胱癌细胞(人细胞 系T24)。将该细胞混合物的一半容量通过离心分离沉积，并且使剩下的 一半穿过过滤器。将通过过滤器的通过物也收集起来并且通过离心分离 沉积。从未过滤样品、过滤器样品和通过物样品分离出DNA并且对HRAS G12V突变进行分析，之前已确立HRASG12V突变出现在细胞系T24中。 PCR与变形梯度凝胶电泳(DGGE)的组合用于溶解突变和野生型HRAS。 如在图5中示出的，针对HRASG12V，过滤的样品明显是阳性，而未过滤 样品和通过物样品则是阴性(DGGE在野生型背景下具有的检测水平约为 2-3％突变等位基因)。这些结果显示：肿瘤细胞保留在过滤器上，但同 时也表明：与未过滤样品相比，过滤器中的肿瘤细胞的比例增加。
同样，针对启动子区域BCL2中的DNA甲基化水平，对相同的DNA样 品进行分析，其在T24细胞中完全甲基化并且在正常淋巴细胞中未甲基 化。如在图6中示出的，未过滤样品和通过物样品显示出的平均甲基化 水平为3-4％，与正常淋巴细胞中的水平相似。相反，过滤器样品显示出 的平均甲基化水平则为13％。该分析确定了在过滤器中肿瘤细胞的比例增 加。
接下来，在样品分割设计中对来自204位膀胱肿瘤患者和来自29位 健康对照者的尿液样品进行检查：对于所有患者和对照者，并行地将其 尿液样品进行沉积(50ml)和过滤(直到过滤器饱和或者达到最大125 ml)。分离出DNA，使用亚硫酸氢钠进行处理并且使用实时荧光 (MethyLight)化验对7个甲基化标记(CCNA1、BCL2、EOMES、POU4F2、 SALL3、HOXA9和VIM2)进行测试。文献中已经指明，所有这些标记在膀 胱癌中均会发生异常的超甲基化。通过对来自10个健康对照者的样品进 行分析，确立了背景甲基化的临界值。图7示出了对来自膀胱肿瘤患者 的相同尿液样品的过滤成分和沉积成分进行并行分析的示例。
总的来说，当对来自204位膀胱肿瘤患者的尿液沉淀的七个DNA甲 基化标记进行分析时，灵敏度为81％，而对于对应的过滤器样品则为87％ (表1)。注意，对于难以基于尿液分析来检测的低等级Ta肿瘤，灵敏 度从沉淀中的75％增加至过滤器样品中的84％。
病状 沉淀 过滤器 低等级Ta/异常 74/98(75％) 82/98(84％) 高等级Ta 24/31(77％) 25/31(81％) T1 27/30(90％) 28/30(93％) ＞T2 17/19(89％) 18/19(95％) CIS(原位癌) 24/26(92％) 25/26(96％) 合计 166/204(81％) 178/204(87％)
表1.七个DNA甲基化标记在来自膀胱肿瘤患者(数量N＝204)的过 滤尿液样品和沉淀尿液样品中的灵敏度
在所分析的大多数样品中，肿瘤DNA在过滤器中的比例比在对应的 沉淀中的比例大。焦磷酸测序确认了其中一些结果(图8)。
对于所有七个标记均为阴性的26个肿瘤中大多数肿瘤都是非肌肉浸 润性膀胱癌(NMIBC)，包括一个原位癌(CIS)、22个Ta肿瘤、以及两 个T1肿瘤。在19个对照者中，三个呈阳性(两个出现在过滤器和沉淀 两者中，一个仅出现在过滤器中)。其中一个是归类错误并且具有膀胱 肿瘤。第二个是之前膀胱存在问题，并且随后的膀胱镜检查显示存在增 生性病变。第三个在膀胱镜检查中为阴性。
总之，本发明者已经证明，使用微膜过滤器(例如，商用聚碳酸酯 膜过滤器)能够从尿液样品捕获细胞并且分离出DNA以用于随后的甲基 化分析。相应地，在某些实施例中，本发明涉及一种使生物流体样品穿 过膜过滤器的方法，所述生物流体样品例如尿液样品。一般来说，肿瘤 DNA在过滤器中的比例比在对应的沉淀中的比例大。对于87％的膀胱肿瘤 患者，过滤器样品对于肿瘤-特定DNA甲基化标记呈阳性。在81％的情况 下，其对应尿液沉淀呈阳性。
使用根据本发明的装置的细胞捕获以及随后的分析
如上文所描述的，发明者已经证明，可以使用注射器和商用过滤器 保持器在膜过滤器上捕获尿液样品中的细胞。如下非限制性示例描述了 根据本发明的包括这种膜的收集和过滤装置的详细使用。图1(在上文描 述)示出了所使用的收集和过滤装置的技术图。
从承认在赫乐福医院进行膀胱镜检查的30位患者收集晨尿样品。在 3-6小时内在“丹麦癌症研究中心”对样品进行处理。样品容量在150ml 与400ml之间不等，平均240ml(表2)。过滤装置安装有8μm孔径 的追踪蚀刻聚碳酸酯过滤器(沃特曼)。在过滤之后，从过滤装置移除 过滤器并且将其储存在-80℃下直到进行进一步处理。
如上面所描述的那样，从过滤器分离出DNA。在50μl的AE缓冲剂 中洗脱DNA并且将其储存在-80℃下。如上面所描述的那样执行DNA的亚 硫酸氢盐转化。通过磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的定量PCR分析确定DNA 浓度。如上面所描述的那样，使用荧光(MethyLight)化验来确定七个 甲基化标记(CCNA1、BCL2、EOMES、POU4F2、SALL3、HOXA9和VIM2)的 甲基化状态。30个尿液样品的平均DNA产量为242ng(范围从6ng至 1000ng；表2)。
表2.使用尿液过滤装置处理的来自30个尿液样品的DNA产量。DNA 浓度通过定量聚合酶链反应(qPCR)确定(*估算数字，测量超出范围)。
在本次分析中包含的30个案例中，当进行膀胱镜检查时，20个诊断 为膀胱肿瘤(表2)。对于这些肿瘤案例中的两个，DNA产量太低而不能 进行甲基化分析。针对七个膀胱癌相关联的甲基化标记，对余下的18个 样品进行测试(表3)。这些样品中的十六个对于一个或多个标记呈阳性， 相当于89％的诊断灵敏度。
由于该群体中的大部分患者具有较小的非浸润性肿瘤，众所周知， 这很难在尿液中检测到，所以上面这个数字是令人激动的。
表3.在来自18位膀胱肿瘤患者的尿液DNA中对七个DNA甲基化标 记进行荧光分析,这些案例的病理在表2中表明。
装置性能的评估
作为评估从流体样品捕获肿瘤细胞并且计算肿瘤细胞的装置的能力 的模式系统，发明者使用了639V膀胱癌细胞，639V膀胱癌细胞在基因编 码纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)中具有点突变(p.R248C；c.742C ＞T)，丢失了对应的野生型等位基因。在第一组实验中，将100ml的 PBS(包含有103至5×106的639V细胞)添加至装置的收集室，并且迫 使其通过孔径为8μm的聚碳酸酯膜过滤器。为了确定在过滤器上捕获 的639V细胞的数量，使用微滴数字PCR(ddPCR)化验来提取全部DNA 并且确定突变FGFR3分子的数量。在这种背景下，一个阳性事件相当于 一个细胞。当使用2μl(4％)的提取出的DNA作为ddPCR的模板时，可 重复地从所有样品获得阳性信号(图9A)。明显的是，对于最低细胞浓 度(100mL中有103个)，每2μl样品反应获取的平均信号数量是28， 相当于输入细胞的～70％的总回收率(图9B)。
30％的输入材料损失可以至少部分地归因于：在提取期间DNA的预期 损失。在更大的细胞浓度下，回收率降低，在5×106个细胞/100ml时， 回收率下降至～5％。该较低回收率是预期的，因为过滤器的饱和会使得 压力阀释放，并且引起余下流体流动而使其细胞内容直接流到废液池中。 该初始测试表明，过滤装置可以用于从流体有效地捕获膀胱癌细胞，并 且在低细胞浓度下(这时还没有达到过滤器的最大容纳量)，回收率尤 其高。
为了测试过滤装置的如下能力：使在正常细胞背景中以低丰度呈现 的膀胱癌细胞变多，发明者将103至5×105的639V膀胱癌细胞加入到 100ml的容纳有107正常纯净培养人类淋巴细胞(直径7-8μm)的PBS 中，并且使用该过滤装置来处理悬浮液。通过ddPCR对从过滤器提取的 DNA进行分析，对于突变体(R248C)和野生型FGFR3均显示出信号(图 10A)。垂直线表示手动设置的临界设置点。使用ddPCR从过滤器提取DNA 并且对突变体FGFR3(R248C)分子进行测试。来自正常周边血液淋巴细 胞(PBL)的DNA用作野生型FGFR的对照。示出的结果来自两个独立实 验中的一个。最重要的是，突变DNA的回收率与使用639V膀胱癌细胞的 纯溶液实现的回收率相似(图10B)。尽管通过过滤来处理样品消除了大 多数血液淋巴细胞(＞99％)，但野生型FGFR3等位基因的背景却保持一 致(图10A和图10B)。这些背景细胞可以表示为残留的单核细胞(其比 过滤器的孔径大)和凝血细胞(其较小，但倾向于形成集群，并且因此 也可以在过滤器上捕获)。
这表明，该装置能够分离低丰度肿瘤细胞，并且因此可以用于更早 诊断出较小的低侵略性的肿瘤。肿瘤的尺寸和阶段通常由尿液样品中预 期的细胞数量来反应。较小的低侵略性的肿瘤脱落到尿液中的细胞量没 有更成熟的肿瘤那么多，并且因此在标准诊断技术下可能会错失。这还 表明，可以从加入到包含有正常周边血液淋巴细胞的PBS中的肿瘤细胞 中分离出DNA，从而显示出，该装置可以从正常血液细胞中分离出肿瘤细 胞。
尿液样本中的膀胱癌检测
已经证明了可以使用该过滤装置来捕获和富集加入到纯净淋巴细胞 中的膀胱癌细胞，发明者接下来在来自具有膀胱肿瘤的患者的尿液样品 上测试了同样的方法。为了测试过滤是否能够通过增加正常细胞与癌症 细胞的比率来增加灵敏度而超过传统沉积分析，他们首先在分割样品设 置中测试了13个尿液样品，其中，每个样品的一部分通过过滤进行处理， 并且余下部分通过离心分离进行沉积。使用ddPCR针对四种常见的FGFR3 突变(R248C、S249C、G370C和Y373C)对从所有过滤器样品和沉淀样品 分离出的DNA进行筛选。其中八个样品(58％)对于这些突变中的一种呈 阳性(表4)。定量分析显示，突变体-野生型DNA的比率在过滤样品中 比在对应的沉淀样品中高(表4)。最重要的是，对于表现出最低的突变 体-野生型比率的两个样品，实现了最大的富集(分别为6.5倍和8.0倍) (图11)。
表4.通过装置过滤或者沉积收集的泌尿细胞中的突变体(Mut)和 野生型(WT)FGFR3的比例。
总结
脱落到尿液中的细胞为膀胱癌的非侵害性检测提供了便捷的来源。 在膀胱癌的诊断和监控中，通过细胞学或者肿瘤特异性标记分析进行的 细胞收集和下游测试可为膀胱镜检查提供替换方式或者附属方式。然而， 基于尿液的测试的实际使用通常受到如下不便的限制：样品处理不方便、 难以分析较大样品容量、需要快速地对样品进行处理以避免细胞内容的 退化、以及由于肿瘤细胞与正常细胞的比率较低而引起的分析灵敏度不 足。本文描述的是一种过滤装置，其设计为在家里或者医疗点使用，能 够实现从尿液收集肿瘤细胞、使肿瘤细胞变多以及立即保存或者处理肿 瘤细胞。在添加(spiking)实验中，该装置与用于DNA生物标记定量的 微滴数字PCR一起使用，有效地回收膀胱癌细胞，同时消除了＞99％的多 余淋巴细胞。该装置的性能进一步通过如下方式来评估：对从膀胱癌患 者(包括某些具有低等级Ta肿瘤的患者)的尿液收集的细胞进行基于DNA 的分析。与通过沉积处理的相同样品相比，过滤样品中肿瘤DNA与正常 DNA的比率更大，并且显示出更高的灵敏度。能够容易地从尿液收集、处 理和运送被诊断细胞的这种能力，可以扩大非侵害性测试在膀胱癌的检 测和后续治疗中的用途。
参考文献：
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