筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用.pdf

本发明公开了一种筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用。本发明的筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片，是在载体表面固定至少16种DNA片段阵列的DNA芯片，所述16种DNA片段阵列的核苷酸序列分别为序列表中的序列1至序列16。本发明采用生物信息学方法对黄瓜花叶病毒属的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，通过标准毒源验证，在世界范围内率先建立了一套黄瓜花叶病毒属新发病毒属级芯片筛查技术体系，有效的解决了现有监测方法的缺陷，从而加强提前预警该属新发病毒的能力。

1、  一种基因芯片，是在载体表面固定16种DNA片段阵列的DNA芯片，所述16种DNA片段阵列的核苷酸序列分别为序列表中的序列1至序列16。

2、  权利要求1所述基因芯片在黄瓜花叶病毒属病毒检疫、植物病毒病的诊断或植物病毒鉴定中的应用。

3、  一种筛查黄瓜花叶病毒属病毒的方法，是用权利要求1所述芯片进行表达检测植物中黄瓜花叶病毒属病毒。

4、  一种筛查黄瓜花叶病毒属病毒的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的基因芯片。

筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用
技术领域
本发明涉及筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用。
背景技术
本发明涉及生物信息学及生物检测鉴定技术领域，具体地说涉及黄瓜花叶病毒属已知及未知病毒鉴定的探针及操作系统。主要用于出入境检验检疫系统的黄瓜花叶病毒属病毒检疫、植保站植物病毒病的诊断以及植物病毒分类学研究中的病毒鉴定等领域。
根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次分类报告，黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)有3种确定病毒，即黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)。代表种黄瓜花叶病毒有很宽的寄主范围，可侵染1000多种双子叶和单子叶植物，是我国十字花科、茄科、豆科及葫芦科蔬菜上最主要的病原病毒之一，也是烟草、香蕉、西番莲的重要病原，还有许多花卉、药用植物及野生杂草也受到该病毒侵染。目前，我国已从39个科的120多种植物上分离到该病毒。花生矮化病毒是2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的检疫性病毒。
由于本属具有潜在新发检疫性病毒的可能，同时存在着多种分组，特异性的抗血清及引物在检测鉴定已知病毒时容易出现漏检错检，而且也无法对本属内可能存在的未知病毒进行鉴定，从而导致危险性病毒传播扩散的可能性增加，造成经济损失和社会影响的风险增大。
目前用于黄瓜花叶病毒属病毒的检测方法包括生物学方法、免疫学方法、电子显微镜技术、分子生物学技术等，这些方法主要针对黄瓜花叶病毒属已知病毒进行特异性检测，对于未知的、新发的病毒的监测无能为力。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用。
本发明所提供的筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片，是在载体表面固定16种DNA片段阵列的DNA芯片，所述16种DNA片段阵列的核苷酸序列分别为序列表中的序中的序列1至序列16。
本发明的另一个目的是提供一种筛查黄瓜花叶病毒属病毒的方法。
本发明所提供的筛查黄瓜花叶病毒属病毒的方法，是用所述芯片进行表达检测植物中黄瓜花叶病毒属病毒。
本发明的筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片中的探针具有黄瓜花叶病毒属属水平上的高兼容性和病毒属内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发病毒的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。
本发明采用生物信息学方法对黄瓜花叶病毒属的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准毒源验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片可用于黄瓜花叶病毒属病毒检疫、植物病毒病的诊断或植物病毒鉴定。
附图说明
图1为黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片探针点阵(7×9)。
图2为应用TAV标准毒源验证黄瓜花叶病毒属筛查芯片的结果。
图3为应用CMV标准毒源验证黄瓜花叶病毒属筛查芯片的结果。
图4为筛查芯片灵敏度检测结果。
图5为PCR灵敏度检测结果。
具体实施方式
实施例1、筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片
一、制备筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片
1、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计
1)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载黄瓜花叶病毒属全基因组及核酸序列数据用于设计探针。
2)分别使用病毒全基因组序列和全部核酸序列设计探针。使用全部核酸序列时需进行筛选，去除小于160bp长度的核酸序列。如果此病毒属全部核酸序列数目大于300，则使用NCBI的序列比对程序BLASTN对核酸序列去冗余，即如果某核酸序列90％以上长度与其他序列有95％相似度，则从数据库中删除此序列。
3)从NCBI RefSeq数据库下载全部植物mRNA序列数据、全部动物病毒基因组序列数据及能够感染植物的细菌基因组序列，用于做为探针设计的特异性数据库。
4)使用BLASTN联配病毒属内序列，寻找序列保守区域设计探针。探针设计时在序列保守区域内以5个碱基作为间隔，连续提取所有70bp的核酸序列，对选取的核酸序列进行筛选，标准为GC含量在40％及60％之间，任何单个碱基含量不大于50％，没有大于5bp的连续重复碱基，及不会形成大于8bp的发卡结构。
5)使用BLASTN将通过步骤4)筛选的序列与步骤3)得到的特异性数据库以及非此病毒属的其他所有植物病毒核酸序列进行特异性比对，筛选标准为联配序列长度乘以相似性小于25bp，并且无20bp以上的完全吻合序列匹配。
6)使用BLASTN将通过步骤5)筛选的探针序列与本病毒属的所有病毒序列进行比对，比对标准为联配序列长度乘以相似性大于56bp，且有连续15bp的序列匹配。满足此标准的序列，即为可以检测到相应病毒的探针。
7)使用维也纳大学理论化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry，University of Vienna)开发的RNAcofold程序计算探针与相应病毒序列结合的自由能，及自身形成RNA二级结构的自由能。
8)将步骤5)得到的探针序列进行排序，排序标准依次为探针对本病毒属所有病毒的覆盖率，探针与本病毒属序列结合总自由能，探针与本病毒属病毒序列结合总相似度，探针与特异性数据库非特异结合相似度，探针形成自身RNA二级结构自由能。
9)将步骤5)得到的探针去冗余，去掉重复探针，使得探针之间最大重复长度不超过25bp。重复的探针依步骤8)的标准排序，只保留最佳的探针。此步骤得到的探针即为非重复的特异性探针。
10)按步骤8)的标准对步骤9)得到的探针进行排序，依排序结果依次选择探针，使本病毒属每个病毒序列至少有5个探针对应。选择时，如果某些病毒序列已经达到5个探针对应，则对其他未被选择的探针的排序，优先考虑对其他未达到5个探针对应的病毒序列的覆盖率，之后再按照步骤8)的标准进行排序。如果经过步骤9)无法达到本病毒属每个病毒序列至少5个探针对应的标准，则在步骤3)降低序列保守性标准，重新设计，依此循环直到所有病毒序列都有5个探针对应。如果无法从保守区域设计探针，或病毒属内序列无保守区域，则使用所有病毒序列全长序列设计探针。探针设计标准与步骤4)到步骤9)相同。
11)将探针有效性系数定义为探针数目除以病毒核酸序列数目，有效性系数最大为5，最小为5除以序列数目。此系数用于表示病毒属内序列是否保守，即如果系数为5，则表示此病毒属内无保守序列，系数越小，序列之间保守性越高。依有效性系数选择病毒属基因组序列设计出的探针或全部核酸序列设计出的探针，选择有效性系数更小，且探针数目更接近50的探针组作为此病毒属的探针组。
根据上述原则设计了16条探针，16条探针的核苷酸序列如序列表中序列1-16所示。
2、芯片的制备
上述16条探针用点样缓冲液溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合2～10s，芯片距水面距离为2-3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50ml锥形离心管中，2000rpm/min离心1min，以去除芯片表面的液体，获得筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片。
其中一张筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片如图1所示，图1中1-16为黄瓜花叶病毒属筛查芯片探针，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控，BC为空白质控。
3、用于检测的样品总RNA提取
1)取0.2g样品，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；
2)4℃，12000rpm离心10min以除去不溶的成份，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；
3)室温下保持5min，加0.5ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-15min后，4℃，12000rpm离心15min；
4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15min；
5)4℃，12000rpm离心10min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
6)倒掉上清液，加入75％的冷乙醇洗涤沉淀，然后4℃，12000rpm离心5min，弃去乙醇；
7)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μl双蒸水(DEPC处理)中，-20℃保存备用。
4、Klenow酶标记
首先cDNA合成反应，即在0.2mL的反应管中加入10μL总RNA，9N随机引物(invitrogen)(10mg/mL)2μL，混匀后于70℃加热10min，迅速转移到冰上骤冷5min，瞬时离心；然后向反应管中加入dNTP Mix(10mmol/L)4μL，5×反转录缓冲液2μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)1μL，反转录酶(200U/μL)1μL，轻轻混匀，瞬时离心；42℃反应2hr，冰上骤冷5min，获得反转录产物cDNA。
Klenow酶标记体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入cDNA产物14.3μL，9N随机引物(invitrogen)(10mg/mL)4μL，95℃变性3min，冰浴5min。然后向反应管中加入10×Klenow酶缓冲液2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5μL，cy3-dCTP 0.5μL，klenow酶(5U/μL)1.2μL。37℃反应1.5hr，70℃变性5min，冰浴5min。
5、杂交
杂交液为2.4μL 3×SSC，0.32μL 0.2％SDS，4μL 25％甲酰胺，0.32μL外标，1.6μL 5×Denhard’s，cy3-dCTP 0.5μL，标记样品7.36μL。95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖薄片盖好，42℃水浴杂交过夜。
6、洗涤、扫描
清洗体系及程序如下：
                    洗液I            洗液II
洗液组分(最终浓度)  2×SSC，0.2％SDS 0.2×SSC
清洗温度            42℃             42℃
清洗时间            4min             4min
先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体。
将上述芯片置于扫描仪中进行扫描分析，Cy3标记用532nm激光管扫描。PMT设为900，获得各点荧光强度、背景强度等数据。
7、数据分析
1)使用博奥生物开发的LuxScan 3.0从扫描的芯片中提取数据，探针的信号值为探针的前景值的中位值减去背景值的中位值。
2)依探针设计步骤6)的标准，按照探针对应的病毒序列对所有探针进行重新划分，将探针归类到单个病毒序列。
3)对每个病毒序列对应所有探针信号值进行T检验，检验标准为此病毒序列对应所有探针信号值的平均值是否大于1500，使用pvalue 0.05做为筛选标准。如此病毒种的T检验pvalue小于等于0.05，则此病毒种在检测样品中呈阳性，此病毒种所属病毒属呈阳性。
二、黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片有效性验证
分别以表现系统花叶症状的心叶烟、表现叶片斑驳皱缩症状的白肋烟叶片总RNA为模板，按照(一)中的方法进行cDNA合成、Klenow酶标记和杂交，反应结束后对芯片进行洗涤、扫描，根据能否出现阳性杂交信号判定结果。
杂交芯片扫描结果如图2和3所示，芯片固定阳性质控、杂交阳性质控、杂交阴性质控及空白质控表现良好，标准毒源杂交信号强而无背景噪音，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。
图2的探针排列与图1相同，阳性探针为：1、2、3、4、7、9、10、11、14和16。
图3的探针排列与图1相同，阳性探针为：2、4、6、9、11、12、13、14和16。
三、黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片与PCR检测灵敏度比较
准确称取0.1g人工接种番茄不孕病毒(Tomato aspcrmy virus)的发病白肋烟叶片用于黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片和PCR实验，分别进行PCR检测和芯片检测。黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片用的cDNA进行10¹～10⁹倍梯度稀释，PCR用的cDNA进行10¹～10⁶倍梯度稀释。
实验结果如图4和5所示，PCR方法可检测到待检对象的最高稀释倍数为10⁵，而黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为10⁸。黄瓜花叶病毒属病毒筛查芯片检测灵敏度比PCR方法高3倍。
图4的探针排列与图1相同，A：10^-6稀释；B：10^-7稀释；C：10^-8稀释。
图5中，1：10^-1稀释；2：10^-2稀释；3：10^-3稀释；4：10^-4稀释；5：10^-5稀释；6：10^-6稀释；N：空白对照；M：Marker DL2000。
序列表
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>筛查黄瓜花叶病毒属病毒的芯片及其应用
<160>16
<210>1
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
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