以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法.pdf

来自外周血的淋巴细胞中，在施行活化培养前初始T细胞占其中的约50％，但该比率经过活化培养将会降低。另一方面，培养开始前为半数以下的记忆T细胞的占有率通过活化培养而增加、甚至达到95％，但如果进一步继续培养，其将逐渐减少。本发明的课题在于提供以不使用抗体等的方式简便且迅速地大量制备CD45RO阳性的记忆T细胞群的方法、以通过所述方法制作的记忆T细胞群为主要成分的医药用组合物等。本发明的特征在于，通过如下工序制造以记忆T细胞为主要成分的大量的淋巴细胞群，所述工序为：对采集的淋巴细胞进行活化培养，以培养中的淋巴细胞群的细胞密度大于一定的阈值为指标、检测到淋巴细胞群中的记忆T细胞的占有率达到了期望的值，收获所述细胞群，进行冷冻保存；对所述冷冻保存细胞进行解冻、培养以使其增殖。

1.  以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法，所述制造方法利用依次包括以下工序(a)～(c)的高增殖培养法来进行，
工序(a)，对采集的淋巴细胞进行活化培养；
工序(b)，基于淋巴细胞密度检测到记忆T细胞群的占有率上升，将工序(a)的淋巴细胞进行冷冻保存；
工序(c)，对被冷冻的淋巴细胞进行解冻、活化培养。

2.  如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，工序(b)中基于淋巴细胞密度对记忆T细胞群的占有率上升进行的检测以悬浮于培养液中的淋巴细胞数为指标。

3.  如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，工序(b)中的淋巴细胞密度为：悬浮于培养液中的淋巴细胞数为4×10⁵个细胞/mL以上。

4.  如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其特征在于，活化培养为在IL-2及固相化抗CD3抗体的存在下进行培养。

5.  如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其特征在于，工序(c)于解冻后2周以内完成。

6.  如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其特征在于，以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群为淋巴细胞群中记忆T细胞的占有率为75％以上的淋巴细胞群。

7.  如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其特征在于，记忆T细胞以占淋巴细胞群的70％以上的比例含有中央型记忆T细胞。

8.  如权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其特征在于，经分离的淋巴细胞来自人外周血。

9.  如权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其特征在于，淋巴细胞群是用于施予至第三者的细胞群。

10.  一种淋巴细胞群，其特征在于，含有占淋巴细胞群的75％以上的记忆T细胞。

11.  如权利要求10所述的淋巴细胞群，其特征在于，含有占淋巴细胞群的70％以上的中央型记忆T细胞。

12.  一种医药组合物，所述医药组合物以权利要求10或11所述的淋巴细胞群为有效成分。

13.  以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统，所述制造系统为包括以下(A)～(D)的手段、利用高增殖培养法的制造系统，所述手段为：
手段(A)，淋巴细胞的活化培养手段；
手段(B)，基于淋巴细胞密度检测记忆T细胞群的占有率上升的手段；
手段(C)，淋巴细胞的冷冻保存手段；
手段(D)，对被冷冻的淋巴细胞进行解冻的手段。

以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法
技术领域
本发明涉及以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的大量制造方法、含有所述淋巴细胞群的医药组合物、以及所述淋巴细胞群的制造系统(装置等手段的组合)等，所述大量制造方法为用于简便地大量获得来自含有T细胞的外周血的CD45RO阳性且CD62L阳性的T细胞群、CD45RO阳性且CD62L阴性的T细胞群的方法。
背景技术
淋巴细胞作为支持用于机体防御的免疫系统的重要手段近年来备受关注。淋巴细胞的表面表达有被称作分化抗原的抗原型，淋巴细胞根据该抗原型被分类为各种各样的亚群(subset)。例如，根据单克隆抗体的反应性对有无CD3(CD为分化簇(cluster of differentiation)的略称)表达进行检验，由此将淋巴细胞区别为与细胞免疫相关的T淋巴细胞(CD3阳性，也表示为CD3+；以下有时也将阳性记载为+、阴性记载为-)和与体液免疫相关的B淋巴细胞等(CD3阴性，也表示为CD3-)。而且这些淋巴细胞各自的功能也不同。进一步地，与细胞免疫相关的T淋巴细胞(也称作T细胞)被分类为表达CD4的CD4阳性细胞和表达CD8的CD8阳性细胞。以往，一直认为CD4阳性细胞发挥辅助功能、CD8阳性细胞发挥细胞抑制性功能，因此迄今为止，多数情况下，将CD4阳性细胞和CD8阳性细胞分离之后再进行研究。
通过形态对淋巴细胞进行区别是困难的，多数情况下如上文所述根据抗原型将淋巴细胞分为各亚群并对功能进行分析。但是，其多半是使用与各细胞的抗原型相对应的主要为单克隆抗体(例如抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体)来进行的。而且，是使淋巴 细胞与结合在磁性微珠粒(magnetic microbeads)上的抗体进行反应、从容器外部利用贴附的磁石的磁力收集磁性微珠、分离介由抗体结合在所述珠粒(beads)上的细胞或者利用分离柱来进行分离的方法。此外，为了大量获得CD4阳性细胞、CD8阳性细胞，也有在利用微珠粒法将其各自分离之后，进一步进行活化、扩增培养的方法(参见专利文献2)。此外，近来，由于测定仪器的进步，利用针对各自的表面抗原的荧光标记抗体对淋巴细胞进行染色、使用细胞分选仪(cell sorter)进行分辨的方法也被实施。该方法中，预先用荧光染料对针对细胞表面抗原的抗体进行标记，使标记抗体结合在淋巴细胞上，将该淋巴细胞供给至使用细胞分选仪进行的测定从而检验表面抗原的表达状态，进而对亚群进行分离。但是，该方法存在仅小规模适用的问题(参见非专利文献2)。无论采用以往的何种方法，都无法避免用高价的抗体对淋巴细胞进行标记等繁杂的操作，要获得大量的细胞需要费钱费力。
关于活化T淋巴细胞的制造方法，最初为由Sekine等人进行的报道。这是对选择性地刺激活化T淋巴细胞群的增殖从而获得经增殖的活化T淋巴细胞群的方法的首次报道，具体而言，其中将人外周血淋巴细胞(PBMC：Peripheral Blood Mononuclear Cell)在固相化了OKT3抗体(其为抗CD3抗体之一)的培养烧瓶中进行第一期培养、将经此培养的细胞在不存在OKT3抗体的情况下进行第二期培养。采用该方法获得的活化淋巴细胞群进一步经过在白细胞介素2(IL-2)存在下的培养，可以作为癌症的过继性免疫疗法(adoptive immunotherapy)施予至作为上述外周血采集来源的患者(参见专利文献1)。此外，以同样的方式，将来自供体的外周血淋巴细胞在固相化了OKT3抗体的培养容器中于IL-2存在下进行培养，从获得的活化淋巴细胞群中分离CD4阳性细胞，可以将作为以相对于总细胞而言90％以上的量含有分离得到的CD4阳性细胞的制剂的、用于预防及治疗传染病、肿瘤复发、自身免疫性疾病的医药组合物施予至患者(参见专利文献2)。作为它们的淋巴细胞源，可使用肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL：Tumor Infiltrating Lymphocyte)、脐带血、骨髓等(参见专利文献2)。
另外从功能性观点来考虑，有时将淋巴细胞分类为初始淋巴细胞(lymphocyte)和记忆淋巴细胞(memory lymphocyte)。初始淋巴细胞是尚未受到抗原刺激的、细胞表面表达有CD45RA抗原的淋巴细胞，已知其于在局部淋巴结等处与抗原相遇并受到刺激的过程中被活化。记忆淋巴细胞是已经受到抗原刺激(无论是特异性刺激还是非特异性刺激)而表达有CD45RO抗原的淋巴细胞。T淋巴细胞和B淋巴细胞还可以根据各自的状态分为初始T细胞和记忆T细胞、初始B细胞和记忆B细胞。记忆T细胞可以进一步分为效应型记忆(effector memory；EM)T细胞和中央型记忆(central memory；CM)T细胞。中央型记忆T细胞具有归巢至淋巴结、迎击侵入体内的异物和抗原的功能，效应型记忆T细胞具有处于本应所在的部位、捕捉异物和抗原的作用。因此，预期含有记忆T细胞群作为主要成分的制剂能够在过继性免疫疗法中取得高的治疗效果。因此，Osumi等人为了阐明在过继性免疫疗法中使用的活化淋巴细胞的作用机制，着眼于记忆T细胞亚群，对活化扩增培养获得的活化淋巴细胞群的功能进行了分析。其结果，确认了活化淋巴细胞群中包含的效应型记忆T细胞在与肿瘤细胞的共培养开始24小时后呈现出对癌症细胞的细胞抑制活性；另一方面，中央型记忆T细胞在开始与癌症细胞进行共培养、识别了肿瘤抗原的48小时后呈现出对癌症细胞的细胞抑制活性，那时分化成了效应型记忆T细胞(参见非专利文献2)。
关于采集记忆T细胞的报道，可追溯至由Sekine等人于2000年发表的文献(参见专利文献3)，其将来自脐带血的淋巴细胞于抗CD3抗体和IL-2的存在下进行活化培养、使其活化增殖7天，结果采集到了CD3阳性细胞的比例为98％、且CD45RO阳性细胞的比例为73％的细胞团。但是，此时期的细胞存在增殖不充分、细胞数少的问题。
上述活化淋巴细胞需要在增殖培养后迅速施予患者，难于进行适应病情的迅速施予和稳定的品质管理。因此，有报道称考虑到患者的方便，由患者血制备淋巴细胞时，在活化培养后将淋巴细胞冷冻保存(参见非专利文献1)。其中已经算出了将经冷冻、解冻的淋巴细胞再次活化培养而得到的活化淋巴细胞中CD4淋巴细胞及CD8淋巴细胞的占有率，结论为：几乎所有种群(population)基本平行地进行增殖。非专利文献3中，公开了分离来自脐带血及外周血的淋巴细胞、之后暂且冷冻保存、解冻后进行活化培养、此时对培养期间的亚群变化进行跟踪的结果。报道称，来自脐带血及外周血的淋巴细胞均存在下述情况：作为记忆T细胞的亚群的中央型记忆T细胞在培养开始后迅速增殖、于6天至7天内达到增殖的高峰、其后减少，效应型记忆T细胞在培养后期增殖。此外，Sekine等人公开了如下的施予用制剂的制造方法：使患者的淋巴细胞在体外进行增殖·活化培养，然后在超低温冰箱(freezer)内冷冻·保存，使用时由冷冻状态解冻后立即添加生理盐水并混悬，从而制成给药用制剂(参见专利文献4)。
如上所述，在过继性免疫疗法中利用记忆T细胞的有效性已被暗示，可以说大量简便地采集记忆T细胞丰富的组分是社会性的需求。但是，现状是没有在不给淋巴细胞提供者强加很大的负担的情况下大量简便地采集为供给于临床而所需的记忆T细胞的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平3-80076号公报
专利文献2：日本专利第4389039号公报
专利文献3：日本特开2002-171966号公报
专利文献4：日本专利第4395644号公报
非专利文献
非专利文献1：Sekine T.,Human Cell,5(3)243-245(1992)
非专利文献2：第32届癌症免疫外科研究会议程(Program)·摘要集103页平成23年4月
非专利文献3：Shikamura M.等人，Biotherapy 23(3)257-262(2009)
发明内容
来自外周血的淋巴细胞中，在施行活化培养前初始T细胞占其中的约50％，但该比率通过活化培养而降低。另一方面，培养开始前为半数以下的记忆T细胞的占有率通过活化培养而增加、甚至达到95％，但如果进一步继续培养，其将逐渐减少。本发明的课题在于提供以不使用抗体等的方式、利用简便且迅速的高增殖培养法大量地制备CD45RO阳性的记忆T细胞群的方法，提供以通过所述方法制作的以记忆T细胞群为主要成分的医药用组合物等。
本发明人等以提高活化淋巴细胞中包含的记忆T细胞的比率为目的，在各种各样的条件下反复进行研究、付出努力，结果发现：如果将外周血淋巴细胞在抗CD3抗体固相化烧瓶中、于含有IL-2的培养液中进行活化培养，则随着时间的推移，细胞表面抗原为CD45RO阳性且CD62L阳性(CD45RO+，CD62L+)的T细胞群和CD45RO阳性且CD62L阴性(CD45RO+，CD62L-)的T细胞群(即记忆T细胞群)增加，在淋巴细胞群中占有的比例上升。但是还确认到：由于在此时间点时总细胞数仍较少，所以还需要继续培养，但如果继续培养的话，记忆T细胞群的比例转为减少。因此，本发明人等对以不使记忆T细胞群的比例减少的方式使淋巴细胞增殖、大量地制造以记忆T细胞群为主要成分的细胞群的方法进行了锐意研究。其结果，为了大量地获得记忆T细胞，当继续培养直至活化培养中的淋巴细胞群中的表面抗原为CD45RO+、CD62L+和/或CD45RO+、CD62L-的T细胞群的比率上升至期望的比率、然后收获上升至该期望的比率的淋巴细胞群时，以细胞密度大于一定的阈值为指标，将所述收获的细胞进行冷冻保存，然后再次进行活化扩增 培养，由此解决了上述问题。
即，由于发现了记忆T细胞群的占有率的上升与活化培养淋巴细胞群的细胞密度之间的关系，因此细胞密度达到作为收获细胞的指标的一定的阈值以上就意味着上述记忆T细胞群达到了期望的占有率。由此，利用测定细胞密度这样的简便且低成本的方法，就能够检测到最适于收获具有足够的细胞数以及高的记忆T细胞群占有率的细胞群的时期。此外，还发现了通过对接种时的细胞密度进行管理，能够对到收获为止的培养期间进行最合适的控制，从而可以在短时间内收获具有足够的细胞数以及高的记忆T细胞群占有率的细胞群。如上所述，成功开发了以不使用抗体等的方式简便且低成本地大量制造以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的方法。
即，本发明包括以下[1]～[4]的制造方法：
[1]以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法，所述制造方法利用依次包括以下工序(a)～(c)的高增殖培养法，所述工序为：
工序(a)，对采集的淋巴细胞进行活化培养；
工序(b)，基于淋巴细胞密度检测到记忆T细胞群的占有率上升，将工序(a)的淋巴细胞进行冷冻保存；
工序(c)，对被冷冻的淋巴细胞进行解冻、活化培养；
[2]如上述[1]所述的制造方法，其特征在于，工序(b)中基于淋巴细胞密度对记忆T细胞群的占有率上升进行的检测以悬浮于培养液中的淋巴细胞数为指标；
[3]如上述[1]或[2]所述的制造方法，其特征在于，工序(b)中的淋巴细胞密度为：悬浮于培养液中的淋巴细胞数为4×10⁵个细胞/mL以上；
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其特征在于，活化培养为在IL-2及固相化抗CD3抗体的存在下进行培养。
此外，本发明包括以下[5]～[9]的制造方法：
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其特征在于，工序 (c)于解冻后2周以内完成；
[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其特征在于，以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群为淋巴细胞群中记忆T细胞的占有率为75％以上的淋巴细胞群；
[7]如上述[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其特征在于，记忆T细胞以占淋巴细胞群的70％以上的比例含有中央型记忆T细胞；
[8]如上述[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其特征在于，经分离的淋巴细胞来自人外周血；
[9]如上述[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其特征在于，淋巴细胞群是用于施予至第三者的细胞群。
此外，本发明包括以下[10]～[13]：
[10]一种淋巴细胞群，其特征在于，含有占淋巴细胞群的75％以上的记忆T细胞；
[11]如上述[10]所述的淋巴细胞群，其特征在于，含有占淋巴细胞群的70％以上的中央型记忆T细胞；
[12]一种医药组合物，所述医药组合物以上述[10]或[11]所述的淋巴细胞群为有效成分；
[13]以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统，所述制造系统为具备以下(A)～(D)的手段的、利用高增殖培养法的制造系统，所述手段(A)～(D)为：
手段(A)，淋巴细胞的活化培养手段；
手段(B)，基于淋巴细胞密度检测记忆T细胞群的占有率上升的手段；
手段(C)，淋巴细胞的冷冻保存手段；
手段(D)，对被冷冻的淋巴细胞进行解冻的手段；
根据本发明，能够简便且大量地提供以来自外周血的活化淋巴细胞中含有的CD45RO+且CD62L+、CD45RO+且CD62L-的记忆T细胞群为主要成分的淋巴细胞群。在对活化淋巴细胞群中包含的记忆T细胞群的增殖进行追踪时，能够不采用以往的方法中进行的细 胞表面抗原分析这样的使用高价抗体的繁杂方法，而通过计测活化培养液中的细胞数(特别是悬浮淋巴细胞数)而算出细胞密度、与预先设定的一定的阈值进行比较这样的极其简便且廉价的方法，就能掌握记忆T细胞的增殖及占有率的状况。由此，可以找到最适于收获细胞的时期来收获细胞，进而通过将该收获的细胞冷冻保存，能够维持处于记忆T细胞占有率增加了的状态的淋巴细胞群、并对其适当地使用。进一步地，通过将冷冻了的记忆T细胞群于解冻后再次进行活化培养，在维持高的记忆T细胞群的占有比例的同时，细胞群得以扩增，结果能够获得以记忆T细胞群为主要成分的大量的淋巴细胞群。此外，对淋巴细胞数和培养时间、以及最终获得的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的量进行了详细的研究，结果发现，本发明的制造方法还具有能够在解冻后2周以内这样的短时间内大量制造以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的效果。
本发明中，对包含中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞的记忆T细胞群的、由活化培养引起的占有率增加进行检测，经过进行冷冻处理的工序，制造记忆T细胞占有率高的淋巴细胞群。中央型记忆T细胞具有归巢至淋巴结、迎击侵入体内的异物和抗原的功能，效应型记忆T细胞具有处于本应所在的部位、捕捉异物和抗原的作用。因此，所述以记忆T细胞群为主要成分的淋巴细胞群可以作为施用回同一生物体的过继性免疫疗法或施予至第三者的医药组合物使用，能够期待其比以往被用于过继性免疫疗法等的、记忆T细胞占有率低的淋巴细胞群具有高得多的治疗效果。
附图说明
[图1]是表示将活化培养期间第1、5、6、13天的淋巴细胞根据有无细胞表面抗原(CD45RO、CD62L、CD3)进行分类的结果的图(n＝3)。作为外周血淋巴细胞中存在的CD45RO+CD62L+的T淋巴细胞(CM)及CD45RO+CD62L-的T淋巴细胞(EM)的合计而言的记忆T细胞(memory)的占有率在第5天、第6天时大于90％， 但随着培养的继续有所降低。
[图2]是表示在冷冻保存前进行活化培养后的细胞群中占有率上升了的记忆T细胞群在冷冻解冻后、活化培养及扩增培养的过程中仍维持着高的存在比率的图(n＝3)。
[图3]是表示本发明的以记忆细胞为主要成分的医疗组合物的制造工序的概要图。
[图4]是表示对采用不进行冷冻保存的现有方法制作的活化淋巴细胞群(A)和通过本发明的方法制作的活化淋巴细胞群(B)中各细胞的存在比率基于有无细胞表面抗原(CD45RO、CD62L、CD3)进行分类、调查获得的结果的图。“PBMC”表示培养开始时的、由外周血管采血分离的单核细胞(淋巴细胞富集的组分)；“+50”表示在培养开始后第4天马上要添加50mL培养基之前的细胞；“+150”及“冷冻”表示在培养开始后第5天马上要第2次添加培养基或进行冷冻处理之前的细胞；“生BP”表示未经过冷冻工序、马上要用“+150”进一步扩大培养规模之前的细胞；“生H”表示完成了上述生BP的培养、临收获前的细胞；“TW(解冻)”表示刚刚将冷冻细胞进行解冻后的细胞；“OKT”表示扩大培养完成后、马上要进行利用OKT3抗体进行活化培养2之前的细胞；“解冻BP”表示马上要进入扩增培养之前(活化培养2之后)的细胞；“解冻H(收获)”表示扩增培养2之后的细胞。
具体实施方式
本发明中所谓“记忆T细胞”，是指表达作为淋巴细胞表面抗原的CD45RO的T细胞，作为所述记忆T细胞，可以举出中央型记忆T细胞、效应型记忆T细胞。淋巴细胞在其表面表达有多种细胞表面抗原，可根据表面抗原将其分类区别为多种亚群。例如，淋巴细胞可以分为T细胞和B细胞，而T细胞因在其表面具有CD3表面抗原而与B细胞区别开。进一步地，作为表面抗原，有CD45RO和作为CD45RO的异种型(isoform)的CD45RA抗原，存在根据有无 这些抗原进行的分类。CD45RO是在表达CD45RA的初始淋巴细胞受到抗原刺激(无论是特异性的还是非特异性的)时取代CD45RA而表达的、成为记忆细胞的指标之一的抗原型。CD62L是属于选择素家族(selectin family)的74kDa的糖蛋白，在大部分的淋巴细胞中表达,是与淋巴细胞向淋巴结的归巢有关的细胞粘附分子。其也作为细胞表面抗原表达于初始细胞中，但伴有CD45RO的表达时，根据CD62L的表达强度，可区别中央型记忆、效应型记忆等记忆细胞亚群。而且，具有CD45RO+且CD62L+的表面抗原的T细胞被认为是中央型记忆T细胞，具有CD45RO+且CD62L-的表面抗原的T细胞被认为是效应型记忆T细胞。
即，在淋巴细胞表面表达抗原CD3的CD3阳性(CD3+)T细胞中，细胞表面抗原CD45RO阳性且CD62L阳性的T细胞群(CD45RO+，CD62L+)为中央型记忆T细胞群，细胞表面抗原CD45RO阳性且CD62L阴性的T细胞群(CD45RO+、CD62L-)为效应型记忆T细胞群，这些中央型记忆T细胞群和效应型记忆T细胞群共同构成记忆T细胞群。对所述细胞表面抗原的检验可以通过下述方法进行：使用经荧光染料标记的抗体(抗CD3抗体、抗CD45RO抗体、抗CD62L抗体)对淋巴细胞进行染色，例如利用FACS Calibur(Becton·Dickinson公司制)等流式细胞仪(Flow Cytometer)来计测有无该荧光染料标记抗体以及细胞数。此外，也可以用经荧光染料标记的抗体、或用第一抗体及经荧光标记的第二抗体对淋巴细胞进行染色、用激光扫描共聚焦荧光显微镜进行观察。
通常，健康人的外周血淋巴细胞群中记忆T细胞的占有率为40％左右，但通过本发明的制造方法能够提高该占有率。作为本发明中的“以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群”(以下，也称为“记忆T细胞含量高的淋巴细胞群”)，表示记忆T细胞含量高的淋巴细胞群中记忆T细胞的占有率为优选60％以上、更优选70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的淋巴细胞群。其中，淋巴细胞群中的记忆T细胞的占有率优 选为75％以上。进一步地，作为本发明的淋巴细胞群，优选地，淋巴细胞群的70％以上、更优选75％以上、80％以上、85％以上、更优选90％、进一步优选95％以上为中央型记忆T细胞。需要说明的是，本发明的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群并不排除记忆T细胞以外的T细胞的混入。
此外，本发明的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法中，通过依次包括工序(a)～(c)的高增殖培养法，可以提供足以用于实施施用回同一生物体的过继性免疫疗法或用于制备施予至第三者的医药组合物的量的、记忆T细胞含量高的淋巴细胞群。此处，所谓高增殖培养法，是能够使血样中的淋巴细胞数增殖至500倍以上、优选600倍以上、700倍以上、800倍以上、更优选900倍以上的培养方法，通过所述培养法，可以获得例如下述以高含量含有记忆T细胞的淋巴细胞群，其中，由50mL血液获得的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群中的总淋巴细胞数为优选5×10⁸个以上、更优选8×10⁸个、进一步优选1×10⁹个以上、最优选3×10⁹个以上。此外，可以获得其中以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的细胞密度为5×10⁴个/mL以上、优选1×10⁵个/mL以上、5×10⁵个/mL以上、更优选1×10⁶个/mL以上的记忆T细胞含量高的淋巴细胞群。
此外，作为工序(a)中的“采集的淋巴细胞”，可以举出通过常规方法采集的来自外周血或脐带血、以及来自骨髓的淋巴细胞，但从采集的时机、采集的容易程度方面来看，优选来自外周血的淋巴细胞。作为所述外周血,可以举出来自他人的外周血、来自自身的外周血，用于过继性免疫疗法时，可以有利地使用来自自身的外周血。从对肿瘤及其复发、以及病毒感染症、自身免疫性疾病的预防及治疗的观点来考虑，对于接受了器官移植或骨髓移植等的患者而言，优选为来自移植器官或骨髓等的提供者的外周血。此外，作为采集的淋巴细胞，优选使用经分离的淋巴细胞，所述经分离的淋巴细胞可以通过用一般性方法对利用从血管采血、利用单采法(pheresis)等采集的外周血(优选采集自静脉的外周血)进行处理 来获得。关于从外周血分离淋巴细胞，可以通过使用了蔗糖、市售的淋巴细胞分离剂等的不连续密度梯度离心法等公知的淋巴细胞分离法来实现。关于用于分离淋巴细胞的外周血，可以使用添加了肝素或柠檬酸以防止发生血液凝固的外周血。关于所述外周血的量，没有特别限定，可以根据供体的负担、采血所需的人力物力、淋巴细胞的分离操作等进行适当设定，可以将单次采血的量设定为0.01mL～100mL左右、更优选5mL～50mL左右、进一步优选10mL～20mL。
此外，淋巴细胞的来源并不特别地仅限定于人，也可以举出猴、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、大鼠、小鼠、仓鼠，在将本发明的淋巴细胞群施予人时，优选为来自人的。此外，本发明的淋巴细胞群可以为来自施予对象，也可以来自施予对象以外的个体，即，供体和受体可以相同也可以不同。
作为工序(a)和工序(c)中的“活化培养”，只要是通过体外培养能够使记忆T细胞群的占有率上升的活化培养(例如日本特开平3-80076号公报中记载的公知的淋巴细胞的活化培养)即可，没有特别限定，优选在白细胞介素2(IL-2)的存在下进行培养,更优选在IL-2和抗CD3抗体的存在下进行培养。例如，可以优选地举出使淋巴细胞悬浮于含有IL-2的培养用培养基中、在固相化了抗CD3抗体的培养容器中进行的培养。进一步地，可以根据需要使用各种分裂促进剂(mitogen)来进行淋巴细胞的活化。作为所述抗CD3抗体，只要是能够识别淋巴细胞表面的CD3表面抗原并促进增殖·活化的抗体即可，可以使用任意的抗CD3抗体。用于刺激淋巴细胞的活化的抗CD3抗体可以使用经过纯化的CD3分子在动物或细胞内产生，但可有利地使用稳定性、操作容易性优异的市售品OKT-3抗体(制造商：eBIO公司)。此外，作为以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统中的淋巴细胞的活化培养手段，可以举出通常用于细胞培养的手段，例如细胞培养容器、细胞培养装置、细胞培养槽等。
作为上述活化培养中的培养法，只要在高增殖培养法实施完成之后能够以高增殖率大量地制造以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群即可，其条件没有特别限定。关于活化培养，由于其以抗CD3抗体的刺激信息被传达至淋巴细胞、以及记忆T细胞群增殖从而相对于淋巴细胞群而言的占有率上升、进而所述上升了的占有率不大幅地减少为前提，所以作为活化培养的培养时期为获得足够数目的淋巴细胞为止，可以举出1～10天、更优选2～8天、进一步优选3～7天、特别优选4～6天。关于此培养时期中的培养基的更换频度，没有特别限定，为了防止培养液劣化及IL-2活性降低，优选1～7天进行1次，优选以相对于添加前的培养液中的液量而言0.1～5倍左右的量添加。
在工序(a)中进行淋巴细胞的活化培养，通常，活化培养淋巴细胞中既有附着于烧瓶底面而增殖的细胞，又有经过活化后以悬浮于培养液中的状态进行增殖的细胞。附着增殖的细胞与悬浮细胞同为活细胞。关于培养方法，可以是培养液与活化培养开始时的培养液等量的培养方法,也可以是在培养过程中进一步添加培养液、继续活化培养数日(例如1～2天)、进一步增殖淋巴细胞的培养方法。所述培养液的添加量优选为活化培养开始时的培养液量的0.5～2倍量，其中，可以优选地举出与活化培养开始时的培养液量等量的培养液。在进一步添加上述培养液继续进行培养时，可以仅对悬浮于培养液中的淋巴细胞进行继代培养，但也可以对悬浮淋巴细胞再加上粘附于培养容器的淋巴细胞的双方均进行继代培养。
此外，工序(a)的活化培养中，关于培养开始时的淋巴细胞数，没有特别限定，但如果细胞培养中培养开始时的细胞数过少，则到细胞增殖曲线抬高所需的时期延长，相反地，如果过多，则提前达到平台期，不能采用添加培养液来增加总量等的方法，所以无法获得足够量的细胞。因此，优选对开始时的接种数进行调节，以使淋巴细胞的增殖曲线迅速抬高，同时上述T细胞群增殖、在活化淋巴细胞中占有的比例迅速地上升，从而能够获得足够量的细胞。例如， 优选调整为1.0×10⁵～1.0×10⁶个细胞/mL、优选1.5×10⁵～6.0×10⁵个细胞/mL、更优选4.0×10⁵～6.0×10⁵个细胞/mL再开始培养。此外，关于培养容器的容量及培养液量，可以考虑操作性来进行适当选择，可以举出例如在225cm²的烧瓶中使用50mL培养液、在25cm²的烧瓶中使用5mL培养液的例子。
如上所述，本发明中的活化培养中，关于抗CD3抗体，从淋巴细胞的增殖效率、操作的容易性的观点来考虑，优选固相化后进行使用。作为固相化抗CD3抗体的支持体，可以使用由玻璃、聚氨酯、聚烯烃、聚苯乙烯等材质构成的各种烧瓶、培养皿、培养板(plate)、袋。因为容易获得，也可以使用市售的塑料制的已灭菌的细胞培养用烧瓶等器具，其大小可以进行适当选择。关于上述抗体的固相化方法，也可以施行利用非特异性吸附或化学键合的方法，只要是通过固相化了的抗CD3抗体可以对淋巴细胞进行刺激的固相化方法，则可以是任意方法。固相化可以通过将所述抗CD3抗体的稀释液注入用来进行固相化的器具中、于例如4～37℃下静置2～24小时来进行。关于所述抗CD3抗体的稀释液，优选将抗CD3抗体在经灭菌的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)等生理性缓冲液中稀释成1～30μg/mL的浓度而用作为稀释液。经固相化的器具在直至使用前可以保存在冷藏室(cold room)、冰箱(4℃)中，优选在使用时除去所述稀释液、用常温的杜氏磷酸盐缓冲液等生理性缓冲液进行清洗。此外，如上所述，在本发明中的活化培养中，从淋巴细胞的增殖效率的观点来考虑，优选在培养用液体培养基中使用白细胞介素2(IL-2)。优选将IL-2稀释为使培养用液体培养基的浓度为1～2000U/mL而使用。作为所述IL-2，可以使用市售品。IL-2可以溶解在水、生理盐水、杜氏磷酸盐缓冲液、RPMI-1640、DMEM、IMDA、AIM-V等通常被广泛使用的细胞培养用液体培养基等中而使用。此外，其一旦溶解，则优选冷藏保存以防止活性降低。
此外，作为上述活化培养中的培养液，只要是适于淋巴细胞的培养的培养液即可，没有特别限定，可以使用含有血清等生物来源 的成分的培养液，或在平衡盐类溶液中加入了氨基酸、维生素、核酸碱基等的合成培养基。具体而言，可以举出RPMI-1640、DMEM、IMDA、AIM-V等，其中特别优选AIM-V。关于培养用培养基，添加了正常人血清的培养基增殖效果优异，因此优选。这些培养基及人血清可以使用市售品。培养可以按照通常的细胞培养方法来进行。例如，可以在CO₂培养箱(incubator)内进行。CO₂浓度为1～10％、特别优选为5％，温度为30～40℃、特别优选为37℃，湿度为90～100％、特别优选为95％。
本发明中的高增殖培养法中，在上述活化培养的前后，也可以进行用于使淋巴细胞增殖的培养。作为所述培养，可以举出在存在IL-2、且不存在抗CD3抗体的条件下进行的培养(扩大培养、扩增培养)，其培养基成分可以进行适当调节。例如，可以举出在工序(c)中对解冻了的淋巴细胞进行活化培养之后实施的扩增培养中，对悬浮淋巴细胞及粘附淋巴细胞进行传代、实施4～13天的培养。此外，作为上述扩大培养、扩增培养中的培养液，只要是适于淋巴细胞的培养的培养液即可，没有特别限定，可以使用含有血清等生物来源的成分的培养液，或在平衡盐类溶液中加入了氨基酸、维生素、核酸碱基等的合成培养基，可以获得市售品。具体而言，可以举出RPMI-1640、DMEM、IMDA、AIM-V等，其中特别优选AIM-V。
此外，工序(b)中的所谓“基于淋巴细胞密度……进行检测”，是指在工序(a)中对淋巴细胞进行的体外活化培养中，根据需要，直至细胞密度达到一定的阈值以上之前，在逐次计测培养液中的细胞数的同时作出继续进行活化培养的判断。如果细胞密度达到一定的阈值、例如4×10⁵个细胞/mL以上，则为检测到活化培养液中的记忆T细胞的占有率上升。所述基于淋巴细胞密度的检测，除包括使用显微镜对淋巴细胞数的直接测定、使用细胞计数装置的直接测定以外，还包括从一定的细胞培养条件下间接地检测到淋巴细胞数。即，还包括如下进行的检测：根据预先将规定细胞数的淋巴细胞在一定的活化培养条件下进行培养时的细胞数的测定数据，间接地推 测淋巴细胞数。此外，对淋巴细胞进行活化培养时，一部分细胞附着于培养容器的底面进行活化增殖，一部分细胞悬浮于培养液中进行增殖。另一方面，在活化培养中，一边逐次计测培养液中的细胞数一边继续进行培养。因此有时多次计测淋巴细胞数。该情况下，如果将附着于底面的淋巴细胞用移液管等剥离、将剥离淋巴细胞和悬浮淋巴细胞制成均匀的混悬液来进行计测，则有时剥离了的淋巴细胞于剥离后停止增殖。从收获更多的淋巴细胞的观点来考虑这存在问题，因此，对培养中的细胞数的计测优选不使附着的细胞剥离地对悬浮淋巴细胞数进行计测。由于可以认为悬浮淋巴细胞数与附着淋巴细胞数和总淋巴细胞数在一定程度上相关，因此可以通过计测悬浮淋巴细胞数来推算增殖的趋势。因此，从操作简便的简便性和防止由其产生污染的观点、以及从促进增殖的观点来考虑，计测悬浮淋巴细胞是有用的。此外，从收率等观点来考虑，优选在培养结束时通过轻拍将附着于培养容器底面的细胞也剥离下来、对总淋巴细胞数进行计测。
因此，工序(b)中的所谓“记忆T细胞群的占有率上升”，是指工序(a)中经过活化培养的淋巴细胞的总数中的记忆T细胞的占有比例的上升，具体而言，记忆T细胞的占有率达到例如80％以上、优选85％以上、90％以上、更优选95％以上。该记忆T细胞的占有率也可以通过使用流式细胞仪利用抗体直接对CD3、CD45RO、CD62L等细胞表面抗原进行调查来算出。此外，作为以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统中的、基于淋巴细胞密度检测记忆T细胞群的占有率上升的手段，可以举出通常用于测定淋巴细胞数的手段，例如悬浮淋巴细胞的细胞计数装置等。
工序(b)中的“冷冻保存”可以按照通常的细胞冷冻方法来进行。例如，可以将淋巴细胞混悬于Bambanker(Lymphotec公司制)、CP-1(极东制药工业株式会社制)等细胞冷冻保存液制品中并贮藏于冷冻保存容器中，将该容器放入冻存杯(BICELL)(日本Freezer公司制)中，暂时保管于-80℃的超低温冰箱(三洋电机株式会社制) 中，2天后移入液氮罐(MVE)中，作为冷冻保存细胞保存在液氮中。此外，从冷冻·解冻后的活化培养中的增殖曲线抬高的观点来考虑，优选对1个冷冻保存容器中贮藏的淋巴细胞数进行调节，优选每1个冷冻保存容器中保存1×10⁷～5.0×10⁷个细胞。可将保存于多个冷冻保存容器中的细胞进行合并、用于冷冻解冻后的培养，但是从操作的容易性及品质管理的观点来考虑，优选将1个冷冻保存容器中的淋巴细胞移至1个或2个以上的培养容器中进行培养。此外，作为以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统中的淋巴细胞的冷冻保存手段，可以举出通常被用于冷冻保存细胞的手段，例如冷冻保存容器、冻存杯、超低温冰箱、液氮罐等。
工序(c)中对被冷冻了的淋巴细胞的“解冻”可以按照通常的冷冻细胞的解冻方法来进行。例如，可以通过使用37℃的干式加热单元(Dry thermo unit，Taitec公司制)等加热处理4分钟来进行解冻。优选通过在将所述解冻了的淋巴细胞移入适量的培养基中后于室温下进行离心操作、除去上清液来除去细胞冷冻保存液。此外，关于所述解冻后的淋巴细胞的活化培养，还可以在抗CD3抗体存在下的活化培养之后进一步继续进行不存在抗CD3抗体的活化刺激下的扩增培养。即，可以继续在未固相化抗CD3抗体的器具(例如，培养用烧瓶、转瓶(roller bottle)、透气性培养袋等)中继续进行培养直至获得大量的细胞。此时，优选为白细胞介素2(IL-2)存在下进行。关于上述条件下的淋巴细胞的培养，除没有抗CD3抗体的刺激以外，人血清的浓度等优选与存在活化刺激的培养的条件相同，从操作性、成本性、安全性等方面来看，更优选适时地使用无血清培养基。此外，作为以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造系统中的对被冷冻的淋巴细胞的解冻手段，可以举出通常用于冷冻细胞的解冻的手段，例如干式加热单元等。
根据本发明的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法，能够获得包含75％以上、优选80％以上、85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的记忆T细胞的淋巴细胞群，包含70％ 以上、更优选75％以上、80％以上、85％以上、更优选90％、进一步优选95％以上的中央型记忆T细胞的淋巴细胞群。此外，本发明可以制成含有上述以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群作为有效成分的、用于过继性免疫疗法或用于施予至第三者的医药组合物。所述医药组合物可以用作为抗肿瘤剂、HIV治疗药物、病毒感染症治疗药物、自身免疫性疾病治疗药物、细胞或器官移植后的移植细胞或器官的成活促进药物、预防肿瘤复发的药物。此外，本发明的以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群由于记忆T细胞群的比率高达80％以上，所以可以不实施使用针对淋巴细胞群的细胞表面存在的表面抗原的抗体等来分离记忆T细胞群等繁杂的分离浓缩操作，而将其混悬于合适的溶液中而得的混悬液用作为医药材料。作为本发明的医药组合物的形态，优选为非经口施予，优选为混悬了本发明的淋巴细胞群的注射剂、点滴剂等液状。特别地，更优选为将本发明的淋巴细胞群混悬于以0.01～5％的量添加了人血清白蛋白的输液用生理盐水等中的注射剂、点滴剂，但并不限定于此。作为施予方法，优选为向静脉的点滴或向静脉、动脉、局部等的注射。施予的液量根据施予方法、施予的部位的不同而不同，通常优选为1～500mL，优选使此液量中包含下文所述的淋巴细胞给药量的淋巴细胞数。此外，本发明的医药组合物中，除含有记忆T细胞含量高的淋巴细胞群以外，还可含有稳定剂、缓冲液成分、其他治疗药物、补充剂等。关于本发明的医药组合物的施予量、施予次数、施予时期等、以及本发明的医药组合物中的淋巴细胞群的浓度，没有特别限定，可以根据施予对象的体征、病情、体重、年龄、性别等进行适当调节，在通常的情况下，优选以1×10²个～1×10⁹个为基准来设定相对于施予对象的每1Kg体重的淋巴细胞施予量。为进一步有效，优选将相对每1Kg体重的淋巴细胞施予量设定为1×10³个以上，但是由于即使大于5×10⁸个也不能预见到效力进一步增大，所以最优选将每1Kg体重的施予量设定为1×10³个～5×10⁸个。关于施予频率，可以优选地举出1次/天～1次/月，此外，施予次数必须为至少1次以上。在 本发明的医药组合物的使用中，也可以并用其他的手术、给药治疗。
以下给出实施例，具体地说明本发明，但本发明不限定于以下记载。
实施例1
[淋巴细胞的活化增殖]
(1)外周血淋巴细胞的制备
以添加肝素的方式从静脉采集3名已征得同意的健康人的外周血各50mL。将各采血测试样品移至250mL的离心沉淀管(BD Falcon；352075)中，在每份测试样品中加入100mL清洗用溶液(添加了0.1％的人白蛋白的生理盐水：生理盐水500mL，制造商：大塚制药，2.0mL 25％人献血白蛋白，制造商：田边三菱制药)，慢慢地混合，稀释3倍。包括本操作在内的以下操作在无菌条件下进行。对于每1份测试样品，在4支注入了15mL的聚蔗糖(Ficoll)(GE Healthcare Bioscience公司制)的50mL离心沉淀管(BD Falcon；352070)中使经3倍稀释的血液重层，将该离心沉淀管于室温下以1800rpm连续离心20分钟(离心机：株式会社KOKUSAN制；H-700)。将中间层的单核细胞层回收至预先注入了清洗用溶液的50mL离心沉淀管中。盖上离心沉淀管的盖，颠倒混合2～3次，于室温下以1800rpm离心15分钟。离心后除去上清液，使沉淀物分散，然后添加清洗用溶液,得到了总量为50mL的细胞混悬液。将所述混悬液于常温下以1800rpm离心10分钟，在得到的沉淀物中加入50mL的培养基1(含有2％人血清(Lymphotec公司制)及350U/mL的rIL-2(Proleukin：Novartis公司制)的AIM-V培养基(Invitrogen公司制))，混悬，得到了细胞混悬液。
将40μL的提尔克氏溶液(Turk’s solution)(武藤化学药品公司制)注入至5mL圆底试管(BD Falcon；352008)中，向其中加入10μL上述细胞混悬液并混合，将10μL混合液灌入Neubauer型 血细胞计数板(Elmer公司制；9731)，在显微镜(Olympus光学工业株式会社制；211320)下算出了细胞数。
此外，将20μL的台盼蓝染色液(SIGMA公司制；93595)注入至5mL圆底试管(BD Falcon；352008)中，向其中混合10μL上述细胞混悬液，将10μL混合液灌入Neubauer型血细胞计数板，在显微镜下计测未被染色的活细胞，算出了存活率。
(2)OKT3固相化烧瓶的制备
用生理盐水将OKT3(进口销售商：Janssen协和株式会社，制造商：Ortho Pharmaceutical：OKT3注)溶液调配为5μg/mL，将10mL调配液注入至底面积为225cm²的培养用烧瓶(住友Bakelite株式会社制；MS-2180R)中，使底面全部被OKT3溶液覆盖。静置3小时以上，然后用吸引机吸取烧瓶内的OKT3溶液，注入约100mL的生理盐水(制造商：大塚制药)，盖上烧瓶盖，剧烈振荡，然后弃去其中的液体。再次将约100mL的生理盐水(制造商：大塚制药)灌入烧瓶中，使固相化面朝下，于室温下静置15分钟。其后，盖上盖，剧烈振荡1分钟，弃去其中的液体。用吸引机小心地吸取残留在烧瓶内和瓶盖上的液体，得到了OKT3固相化烧瓶。如果在制备当天不使用，则保留少量的生理盐水，直至使用前保存于4℃。
对于底面积为25cm²的培养用烧瓶(住友Bakelite株式会社制；MS2105R)，也与上述记载同样地实施了固相化处理。
(3)对接种淋巴细胞数的研究-1
将(1)中制备的细胞混悬液于室温下以800rpm离心15分钟。用培养基1将细胞密度分别调配为0.2×10⁵个/mL、1.0×10⁵个/mL、2.0×10⁵个/mL、2.0×10⁶个/mL、6.0×10⁶个/mL。将各细胞密度的细胞混悬液以各5mL分别注入接种至上述(2)中制备的OKT3固相化25cm²瓶中，用培养基1在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％进行培养。在培养期间中合适地采用与(1)同样的方法计测·算出悬浮细胞数和存活率，一边观察培养液随增殖状态的颜色变化一边适 当地添加培养基1，连续培养10天。并且，在培养结束时，轻拍培养烧瓶，将附着于底面的淋巴细胞也进行回收，用与(1)同样的方法计测·算出了总淋巴细胞数及存活率。
结果：
由表1可知，接种细胞密度为0.2×10⁵个/mL时，即使培养10天也不能获得足够的细胞数，此外，为6×10⁶个/mL时，增殖低下、存活率也不良，由此判定了这两种接种细胞密度不合适。进一步地，在存活率不会成为90％以下的接种细胞密度1.0×10⁵个/mL和2.0×10⁶个/mL之间，对接种细胞密度进行了进一步研究。此外，本研究中，以培养液的颜色变化和悬浮细胞数为指标适当地补加了培养基1，为了使操作更简便、实现更迅速的细胞增殖，需要从细胞密度和培养天数来确定培养基的补加时期，因此对培养液补加时期进行了研究。
表1 接种细胞密度和增殖及存活率的变化

(4)对培养液补加时期的研究
按照与(1)同样的步骤，从3名已征得同意的健康人制备外周血淋巴细胞，并计测了细胞数。
与(3)同样地对制备的淋巴细胞进行离心，用培养基1将细胞密度分别调配为0.5×10⁵个/mL、1×10⁵个/mL、2.0×10⁵个/mL、4×10⁵个/mL、8×10⁵个/mL。将各细胞密度的细胞混悬液以各50mL注入至上述(2)中制备的OKT3固相化225cm²烧瓶(住友Bakelite株式会社制；MS-2180R)中，用培养基1在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％开始培养。从培养效率化的观点来考虑，在培养开始第3天时向各烧瓶中补加了50mL培养液，采用与(1)同样的方法，在补加培养液之前计测了悬浮细胞数，在补加翌日(第4天)回收细胞时计测了总细胞数。
结果：
由表2可知，接种细胞数为2.0×10⁷(4.0×10⁵个/mL)或4.0×10⁷(8.0×10⁵个/mL)时，存在增殖率(培养后的总细胞数除以接种细胞数而得的)为2.5倍以上的测试样品。即，测试样品1的第4天(1.1×10⁸个及1.3×10⁸个)以及测试样品3的第4天(1.0×10⁸个)。在添加培养液后获得的总细胞数大于10⁸的测试样品中，该测试样品在补加培养液前的悬浮细胞数为1.9×10⁷个及6.3×10⁷(测试样品1的第3天)以及2.0×10⁷个(测试样品3的第3天)。因此，设定了在培养开始第3天之后、于悬浮细胞数达到3.8×10⁵个/mL以上、或4.0×10⁵个/mL时添加培养液。
表2

(5)对接种淋巴细胞数的研究-2
按照与(1)同样的步骤，从3名已征得同意的健康人制备外周血淋巴细胞，并计测了细胞数。
与(3)的接种淋巴细胞数的研究-1同样地对制备的淋巴细胞进行离心、用培养基1将细胞密度分别调配为1.0×10⁵个/mL、1.5×10⁵个/mL、2.0×10⁵个/mL、4.0×10⁵个/mL、6×10⁵个/mL、8×10⁵个/mL，将各细胞混悬液以各5mL注入至上述(2)中制备的OKT3固相化25cm²烧瓶中，用培养基1在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％进行培养。在培养开始后用与(1)同样的方法逐次计测悬浮细胞数及活细胞率，于细胞密度变为4×10⁵个/mL以上时在各烧瓶中补加5mL培养液，总计最长培养了6天。在培养结束时，与(3)同样地对附着于底面的淋巴细胞进行处理、采集全部细胞，用与(1)同样的方法计测·算出了总细胞数及存活率。
结果：
本研究中，将在最短天数内进行活化培养并获得最多的细胞作为目标。
接种细胞密度为1.0×10⁵个/mL时，即使在培养第5天，在3个测试样品中的2个测试样品中悬浮细胞数均未达到4×10⁵个/mL。在接种细胞密度为1.0×10⁵个/mL的测试样品3、1.5×10⁵个/mL的测试样品1～3、2.0×10⁵个/mL的测试样品1～3、以及4.0×10⁵个/mL的测试样品1中，第5天悬浮细胞密度超过了4×10⁵个/mL，补加了5mL培养液，结果翌日(第6天)总细胞数大多超过了1.2×10⁷。接种细胞密度为4.0×10⁵个/mL的测试样品2和3、6.0×10⁵个/mL的测试样品1～3、以及8.0×10⁵个/mL的测试样品1～3中，均在第4天时悬浮细胞密度超过4×10⁵个/mL，在补加了培养液的第5天的翌日，上述测试样品中总细胞数均超过了1.2×10⁷个。
综上所述，培养开始时的接种细胞密度为1.5×10⁵个/mL时，在第5天超过4×10⁵个/mL而于翌日完成了培养；为4.0×10⁵个/mL时， 在第4天超过约4×10⁵个/mL而于翌日完成了培养；为6.0×10⁵个/mL及8.0×10⁵个/mL时，在第4天则全部均超过4×10⁵个/mL而于翌日完成了培养。由此，认为为了缩短培养期间，将接种细胞密度设定为4.0×10⁵个/mL以上、8.0×10⁵个/mL以下是合适的。
表3 培养开始时的细胞数与增殖的关系

                                                           n/a：不可获得
实施例2
[活化培养时的淋巴细胞表面抗原的变化]
(1)淋巴细胞的制备及活化培养
按照与实施例1的(1)同样的步骤，从3名已征得同意的健康人制备外周血淋巴细胞，并计测了细胞数。
与实施例1的(3)同样地，对制备的淋巴细胞进行离心，用培养基1将淋巴细胞的细胞密度调配为6×10⁵个/mL。将50mL该细胞混悬液注入至实施例1的(2)中制作的225cm²OKT3固相化烧瓶(住友Bakelite株式会社制：MS-2180R)中，与实施例1的(3)同样地用培养基1在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％进行培养。培养时，随时采集悬浮细胞并与实施例1的(1)同样地计测悬浮细 胞数。由于在培养第4天成为4×10⁵个/mL以上，所以补加50mL的培养基1，并继续进行培养。在培养第5天再次补加50mL的培养基1，并继续进行培养。在培养第6天，通过轻拍使附着于固相化烧瓶的底面的淋巴细胞剥离，得到了细胞悬浮液。将25mL该细胞悬浮液注入至未固相化OKT3的225cm²瓶中，进一步添加75mL的培养基1，并继续进行培养。在培养第9天添加100mL的培养基1，并进一步继续培养至第13天。在培养第13天通过轻拍使附着于烧瓶底面的淋巴细胞剥离，作为细胞悬浮液进行回收，完成了培养。
在此期间，于培养开始时、培养开始第5天(马上要添加培养基前)、第6天(附着细胞剥离前/后)、以及第13天，采集一部分细胞悬浮液，立即对采集的淋巴细胞的表面抗原进行分析。需要说明的是，已知此时淋巴细胞几乎100％为CD3阳性细胞(非专利引用文献3)。
(2)淋巴细胞表面抗原的分析方法
将按照上述(1)的流程采集的细胞悬浮液各取5mL，置于15mL离心沉淀管(BD Falcon；352097)中，于室温下以1800rpm离心5分钟。向得到的沉淀物中添加白蛋白鞘液(sheath fluid)(Beckman Coulter公司制：IsoFlow)，将各细胞混悬液调配为1.0×10⁷个/mL。在5mL圆底试管(BD Falcon)中分别注入10μL经荧光染料标记的各抗体(抗CD3抗体，Becton·Dickinson公司制349201；抗CD45RO抗体，同340438；抗CD62L抗体，Becton·Dickinson·Pharmingen公司制555544)，接着将上述各细胞混悬液各50μL注入至各试管中，于遮光、4℃的条件下使其静置反应30分钟。在反应后的各试管中添加2mL白蛋白鞘液，于室温下以1800rpm离心5分钟。吸引除去上清液，向各沉淀物中添加500μL的CellFix(Becton·Dickinson公司制)制成混悬液，针对目标抗体染色淋巴细胞团，使用流式细胞仪(Becton·Dickinson公司制；FACS Calibur)进行了测定，测定的细胞数为10,000个。
(3)对抗体染色淋巴细胞团的分析
按照上述(2)的方法对制作的抗体染色淋巴细胞团进行了分析。
结果：
通常，存在于外周血淋巴细胞中CD45RO+CD62L+的T淋巴细胞和CD45RO+CD62L-的T淋巴细胞的比率为20～40％左右(表4)。但是，通过施行活化培养，在第5天该占有率已超过90％、在第6天超过95％。但还确认了如果继续培养，则上升了的占有率降低至最初的水平(大约40％)(表4，图1)。“初始(Naive)”表示CD45RO-、CD62L+、CD3+的初始T细胞，“效应(Effector)”表示CD45RO-、CD62L-、CD3+的效应T细胞，“CM”表示CD45RO+、CD62L+、CD3+的中央型记忆T细胞，“EM”表示CD45RO+、CD62L-、CD3+的效应型记忆T细胞，作为“CM+EM”或“记忆(memory)”表示CD45RO+、CD62L+/-、CD3+的记忆T细胞。
因此，能够确认在活化培养中的悬浮细胞密度成为4×10⁵个/mL以上、补加了培养基的翌日之后，CD45RO+、CD62L+T淋巴细胞和CD45RO+、CD62L-T淋巴细胞的占有率上升。因此，为了增加收获的记忆细胞数，确定了在悬浮细胞密度成为4×10⁵个/mL以上、补加了培养基的翌日之后、且在记忆T细胞占有率发生降低之前中止活化培养，通过轻拍使附着于烧瓶底面的淋巴细胞剥离、使成悬浮细胞，回收全部细胞。
表4 活化培养时的淋巴细胞表面抗原的占有率的变化(％)


实施例3
[对冷冻工序中的冷冻细胞密度的研究]
含有通过本发明的方法获得的T细胞群的制剂将用于治疗，最终获得的淋巴细胞的数量多才高效。因此，对冷冻保存时相对每1支试管的细胞数影响之后的活化扩增培养的可能性进行了研究。
(1)对冷冻细胞密度的研究-1活化培养
按照与实施例1的(1)同样的步骤，从3名已征得同意的健康人制备外周血淋巴细胞，并计测了细胞数。
与实施例1的(3)同样地，对制备的淋巴细胞进行离心，用培养基1将淋巴细胞的细胞密度调配为6×10⁵个/mL。将50mL该细胞混悬液注入至实施例1的(2)中制作的225cm²OKT3固相化烧瓶(住友Bakelite株式会社制：MS-2180R)中，与实施例1的(3)同样地在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％进行培养。由于在培养开始第3天悬浮细胞数超过了4×10⁵个/mL，所以添加50mL的培养基1并继续培养至翌日。在培养开始的第4天中止培养，通过轻拍使附着于烧瓶底面的淋巴细胞剥离、使其成为悬浮细胞，回收全部细胞，得到了源于培养基1的细胞混悬液。按照与实施例1的(1)同样的步骤计测了上述混悬液中的细胞数。
(2)对冷冻细胞密度的研究-2冷冻保存
基于上述(1)中计测的细胞密度，针对3种测试样品，添加培养基1，使得相对每1支冻存管(Corning公司制)的淋巴细胞数被 调配为0.5×10⁷个、1.0×10⁷个、3.0×10⁷个、5.0×10⁷个，注入至15mL离心沉淀管中，于室温下以1200rpm离心5分钟。离心后，除去各离心沉淀管中的上清液，使得到的沉淀物分散，添加细胞冷冻保存液(CP-1：极东制药工业株式会社制)，使每1支冻存管的液量为1.8mL，将细胞混悬并注入至冻存管中，将该冻存管置入冻存杯(日本Freezer公司制)中，在-80℃的超低温冰箱(三洋电机株式会社制)中暂时保管2天，然后移入液氮罐(MVE)中，作为冷冻保存细胞进行保存。
(3)对冷冻细胞密度的研究-3解冻处理
将以各细胞密度冷冻保存的冻存管从液氮罐中取出，在设定为37℃的干式加热单元(Taitec公司制)中加热4分钟，对冷冻淋巴细胞进行解冻。在用10mL的培养基1对解冻了的淋巴细胞进行混悬的同时将其移入15mL离心沉淀管中，于室温下以1200rpm离心3分钟。离心后，除去上清液，使沉淀物分散、添加10mL的培养基1、制成细胞混悬液，与实施例1的(1)同样地计测了细胞数。关于解冻了的淋巴细胞，由于每管中细胞数不同，所以如果直接用同量的培养基进行混悬接种，则存在接种细胞数的差异影响增殖的可能性。为了排除此可能性，在接种解冻了的细胞并进行培养的工序中，于接种前及每个工序中对淋巴细胞数进行计测，关于接种时的细胞密度，当然通过调节添加的培养液量使细胞密度大致一定(7.5×10⁵个/mL)。在后续的扩大培养、活化培养、扩增培养中也采用了在培养开始时对因冻存管不同而各异的细胞数进行液量调节的方法。表5中示出了各工序中的培养液量和添加液量。
作为解冻时的操作，将表5所示的液量的上述混悬液以每孔各2mL接种至平底24孔多孔板(plain 24-well multi-well plates)(住友Bakelite公司制)上，将接种日作为第1天，在37℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％的二氧化碳培养箱内培养2天。
表5 各工序中的培养液量和添加的培养基1的量


(4)扩大培养和活化培养
将在所述(3)中于解冻处理后进行了培养的淋巴细胞于第3天分别从24孔多孔板移至平底烧瓶中，用表5中记载的各添加液量的培养基1对24孔多孔板的孔内进行清洗从而回收残留的细胞，将烧瓶内的液量调配成表5中记载的液量。将各烧瓶在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养2天(表5，扩大培养)。
在上述扩大培养之后，为了进行活化培养，将培养烧瓶中的细胞混悬液移至与实施例1的(2)同样地制备的、表5所示的容量的OKT3固相化烧瓶内，用培养基1对所述培养烧瓶的内部进行清洗，回收残留的细胞，最终将OKT3固相化烧瓶内的液量调配为表5中记载的液量，将各烧瓶在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养2天(表5，活化培养2)。
在上述活化培养之后，轻拍各OKT3固相化烧瓶使附着于底面的细胞剥离，得到了细胞混悬液。将得到的细胞混悬液移入表5中记载的新的平底培养烧瓶(住友Bakelite公司制)或新的透气性培养袋(1000mL，Kohjin Bio公司制16087528)中，进一步地用表5所示的添加液量的培养基2(含有1％人血清(Lymphotec公司制)、175U/mL的rIL-2(Proleukin：Novartis公司制)的AIM-V培养基：Invitrogen制)对各烧瓶内进行清洗，将所述清洗液合并进所述平底 烧瓶或透气性培养袋内的细胞混悬液中，在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养3天(表5，扩增培养1)。
在上述扩增培养1之后，在上述培养容器中添加表5中记载的添加液量的培养基2，在37℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％的二氧化碳培养箱内进一步继续培养4天。此处，新补充了烧瓶作为培养容器时，向培养中的烧瓶中添加添加液量的培养基2，振荡烧瓶并对细胞混悬液进行搅拌，将容量的一半量移入新的烧瓶内，继续进行培养。作为培养容器，从烧瓶移至袋内时，向2个烧瓶中注入添加液量的培养基2，振荡烧瓶并对细胞混悬液进行搅拌，将内容量的总量移入新的袋内，继续进行培养。新增加并使用培养袋作为培养容器时，在新使用的培养袋内添加表5中记载的添加液量的培养基2，将其无菌地接合至已在上述扩增培养1中进行了培养的培养袋内，将两袋内的内容物充分混合，进一步继续进行培养(表5，扩增培养2)。
进行(3)及(4)中记载的各工序时，与实施例1的(1)同样地计测·算出了各测试样品的细胞数和存活率。将其结果示于表6中。
结果：将贮藏在冻存管中的细胞数调节至各设定值来进行冷冻保存，在各处理工序中未观察到3个测试样品之间存在大的差异。但是，本发明的方法中制造的记忆T淋巴细胞群将用于治疗，从效率的观点来考虑，由一系列的培养获得的细胞数多的细胞群是令人期望的。因此，由于期望适当的培养规模，所以认为相对一支冻存管而言的细胞数适合为1.0×10⁷个～5.0×10⁷个。在本实施例(1)～(4)的工序中，为了排除接种细胞密度对培养增殖的影响，如表5中所示，用添加液将细胞密度调节成给定值。另一方面，将扩增培养1的培养开始时的细胞数设定为1×10⁸个、2×10⁸个、3×10⁸个，使培养开始时的液量为给定值并进行培养，结果能够确认到细胞数为1×10⁸个时扩增延迟约2天，而为2×10⁸个及3×10⁸个时，则能够没有显著性差异地在上述扩增培养2的工序之后获得足够量的记忆T 淋巴细胞群。如果将上述相对一支冻存管而言的细胞数设定为1.0×10⁷～5.0×10⁷个，则可以满足此条件。
表6 解冻处理工序之后的细胞数、存活率及细胞密度(实测值)

实施例4
[经冷冻保存后进行活化扩增的工序中的淋巴细胞表面抗原的变化]
(1)冷冻保存细胞的制作
实施例2中，已经明确了：在细胞冷冻前的活化培养中，培养液中的细胞密度成为4×10⁵个/mL以上的阶段中，培养液中的细胞中的记忆T细胞群的占有比率上升。
因此，与实施例3的(1)同样地，按照与实施例1的(1)同样的步骤，从3名已征得同意的健康人制备外周血淋巴细胞，对得到的细胞混悬液的细胞数进行计测、将细胞密度调配为6×10⁵个/mL，将其50mL注入至按照与实施例1的(2)同样的步骤制作的OKT3固相化烧瓶225cm²中，在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％进行培养。由于在培养开始第3天悬浮细胞数超过了4×10⁵个/mL，所以作为记忆T细胞群的占有比率上升了的培养物，添加50mL的培养基1并继续培养至翌日。于翌日(即培养开始第4天)中止活化培养，通过轻拍使附着于烧瓶底面的淋巴细胞剥离、使其成为悬浮细胞，回收全部细胞，并用培养基1制成了细胞混悬液。按照与实施例1的(1)同样的步骤对上述混悬液中的细胞数及存活率进行计测，将相当于7.0×10⁷个细胞的量的混悬液移入50mL离心沉淀管中，于室温下以1200rpm离心5分钟。除去离心沉淀管中的上清液，向沉淀物中添加3.6mL的CP-1细胞冷冻保存液(极东制药制)，并进行混悬。在2支冻存管中注入上述混悬液各1.8mL，与实施例3的(2)同样地进行冷冻保存。
(2)对冷冻保存细胞的解冻处理
将冷冻保存细胞于1周后从液氮罐中取出，与实施例3的(3)冷冻细胞密度的研究-3同样地进行了解冻处理。在设定为37℃的干式加热单元(Taitec公司制)中加热4分钟，对冷冻淋巴细胞进行解冻。用10mL的培养基1对解冻了的淋巴细胞进行混悬的同时将其移入15mL离心沉淀管中，于室温下以1200rpm离心3分钟。离心后，除去上清液，使沉淀物分散、添加40mL的培养基1、制成细胞混悬液，与实施例1的(1)同样地计测细胞数。需要说明的是，已知冷冻保存后的淋巴细胞几乎100％为CD3阳性细胞(非专利引用文献1)。
(3)冷冻保存细胞的扩大活化扩增培养
以每孔各2mL，将所述混悬液与实施例3的(4)同样地接种至 平底24孔多孔板(住友Bakelite公司制)上，将接种日作为第1天，在37℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％的二氧化碳培养箱内培养2天。将经培养的淋巴细胞于第3天从24孔多孔板移至平底烧瓶中,用培养基1对24孔多孔板的孔内进行清洗从而回收残留的细胞，将烧瓶内的细胞混悬液的液量调配成90mL。将上述烧瓶在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养2天(扩大培养)。在扩大培养之后，为了进行活化培养，将培养烧瓶内的细胞混悬液移至225cm²的OKT3固相化烧瓶内，用培养基1对所述培养烧瓶的内部进行清洗从而回收残留的细胞，最终将OKT3固相化烧瓶内的液量调配为240mL。将烧瓶在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养2天(活化培养2)。在上述活化培养之后，轻拍OKT3固相化烧瓶使附着于底面的细胞剥离，得到了细胞混悬液。将得到的细胞混悬液移入新的透气性培养袋(1000mL，Kohjin Bio公司制16087528)中，进一步用培养基2(含有1％人血清(Lymphotec公司制)、175U/mL的rIL-2(Proleukin：Novartis公司制)的AIM-V培养基：Invitrogen制)对烧瓶内进行清洗，将所述清洗液合并进所述透气性培养袋内的细胞混悬液中、使液量为1000mL，在TE-HER型CO₂培养箱(HIRASAWA公司制)内以温度37.0±0.5℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％进一步培养3天(扩增培养1)。在上述培养之后，在新使用的培养袋内添加1000mL的培养基2，将其无菌地接合至已在上述扩增培养1中进行了培养的培养袋内，将两袋内的内容物充分混合，进一步继续进行培养。在所述培养容器为37℃、湿度95％、CO₂浓度5.0％的二氧化碳培养箱内进一步培养4天(扩增培养2)。
(4)对抗体染色淋巴细胞团的分析
本实施例4的(2)～(3)的工序中，将对冷冻细胞进行解冻的日期作为第1天，将平底烧瓶(225cm²)中培养结束、马上要开始在OKT3固相化烧瓶中的活化培养之前作为第5天，将活化培养结 束、马上要开始在透气性培养袋(1000mL，Kohjin Bio公司制16087528)内的培养之前作为第7天，将在透气性培养袋内的培养结束之后、与另一个透气性培养袋接合之后的培养结束的日期作为第14天，于第1天(刚解冻后)、第5天(马上要活化前)、第7天(刚活化后)、以及第14天(马上要结束前)以无菌方式采集培养中的细胞混悬液的一部分，采用与实施例2的(2)同样的方法，针对抗CD3抗体(Becton·Dickinson公司制349201)、抗人CD45RO抗体(Becton·Dickinson公司制340438)及抗人CD62L抗体(Becton·Dickinson·Pharmingen公司制555544)对获得的细胞的亚群实施了分析。
结果：
结果示于表7中。明确了冷冻保存前在活化培养细胞中占有率上升了的记忆T细胞群在冷冻解冻之后在通常的培养及活化培养的过程中仍能够良好地维持高的存在比率。虽然在第7天中央型记忆T细胞的存在比显示出略微的降低，但是观察到其通过继续培养而恢复，作为记忆T细胞群，虽然显示出存在比的缓慢降低，但占有率超过了80％。由上述结果可以确认，较之刚从受试者采集到的外周血淋巴细胞的淋巴细胞亚群情况而言，能够获得记忆T细胞群以高比例存在的活化淋巴细胞(图2)。“初始()”表示CD45RO-、CD62L+、CD3+的初始T细胞，“效应(Effector)”表示CD45RO-、CD62L-、CD3+的效应T细胞，CM表示CD45RO+、CD62L+、CD3+的中央型记忆T细胞，EM表示CD45RO+、CD62L-、CD3+的效应型记忆T细胞，作为CM+EM或“记忆(memory)”表示CD45RO+、CD62L+/-、CD3+的记忆T细胞。
表7 经冷冻保存后进行活化扩增的工序中的淋巴细胞表面抗原的变化(％)


(5)冷冻保存细胞的稳定性
采用与上述实施例4(1)同样的方法，将同时进行了冷冻保存的细胞于液氮下保管1周、1个月、2个月、4个月、6个月，对冷冻保存细胞的稳定性进行了研究(n＝3)。
对解冻后的细胞数、细胞表型、解冻后的细胞扩增率及扩增细胞的细胞表型进行了分析，结果发现，到冷冻保存后6个月为止，解冻后的细胞数、存活率及细胞表型、以及解冻后的培养工序中的细胞扩增率及细胞表型中均未观察到任何差异。因此显示，冷冻保存细胞在至少6个月内稳定，冷冻保存细胞可以稳定地长期保存。
实施例5
制造了本发明的以记忆细胞为主要成分的医疗组合物。制造工序的概要如图3所示。
[本发明的以记忆细胞为主要成分的医疗组合物的制造]
1.活化培养1工序
在固相化了抗CD3抗体(OKT3)的225cm²的活化烧瓶中注入与实施例1(1)同样地进行了调配的50mL的细胞悬浮液，在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的TE-HER型CO₂培养箱内进行培养。调配的细胞悬浮液量大于100mL时，向2个活化烧瓶中的每个中注入50mL的细胞悬浮液。细胞悬浮液量为50mL 以上但不足100mL时，注入50mL。在培养开始第3天采集0.01mL培养液，并计测悬浮细胞数(工序内检查II)。悬浮细胞密度为4×10⁵个/mL以上时，补加50mL培养液1(培养液补加)。
在培养开始第3天的工序内检查II中，悬浮细胞密度未达到4×10⁵个/mL时，再继续培养1天并于翌日(培养开始第4天)计测悬浮细胞数；悬浮细胞密度为4×10⁵个/mL以上时，进行培养液补加工序。
如果到培养开始第6天时悬浮细胞密度达到4×10⁵个/mL，则进行培养液补加工序，未达到的情况下，中止培养，再次进行采血。
2.冷冻保存工序
于补加了培养液的翌日使附着于烧瓶底面的细胞剥离，均匀地进行混悬，采样1mL作为工序内检查III用样品。通过室温下以1200rpm离心5分钟从细胞混悬液中回收细胞，将细胞以3×10⁷个/管进行冷冻。此处，使细胞以3×10⁷个/管悬浮于细胞冷冻保存液CP-1(极东制药制)中，贮藏在冻存管中，将该管置入冻存杯中，在-80℃冰箱内使其快速冷冻。翌日从-80℃冷冻库取出冷冻管，保存在液氮中。
3.解冻处理工序
将贮藏了冷冻保存细胞的试管从液氮罐中取出，在加热至37℃的干式加热单元中加热4分钟，对冷冻细胞进行解冻。向盛有10mL的培养基1的15mL的离心管中加入已解冻的细胞液，通过颠倒混合充分地搅拌，于室温下以1200rpm离心3分钟。除去上清液，使细胞分散，然后用40mL的培养基1使其均匀地悬浮。将细胞充分地混合，采样0.5mL作为工序内检查IV的样品。
将剩余的细胞悬浮液以2mL/孔注入至平底24孔多孔板上，在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的CO₂培养腔内培养2天。
4.扩大培养工序
在培养第3天将细胞从24孔多孔板移至平底225cm²烧瓶中。 用培养基1对24孔多孔板进行清洗从而回收残留的细胞。用培养基1使细胞悬浮，最终使成共计90mL，在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的CO₂培养箱内培养2天。
5.活化培养2工序
培养2天后，将平底225cm²烧瓶内的细胞移至固相化了抗CD3抗体(OKT3)的活化烧瓶中。用培养基1对平底225cm²烧瓶进行清洗，回收残留的细胞、最终使培养液量为250mL。在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的CO₂培养腔内培养2天。
6.扩增培养1工序
培养2天后，使附着于活化烧瓶的底面的细胞剥离而得到细胞悬浮液。采集1mL的细胞悬浮液作为工序内检查V的样品。将剩余的250mL细胞悬浮液移至填充了750mL培养基2(添加了1％人血清的培养基，其含有175U/mL的IL-2)的透气性培养袋内，在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的CO₂培养腔内培养3天(总培养液量约1L)。
7.扩增培养2工序
将培养了3天的培养袋与填充了1L的培养基2的透气性培养袋无菌地接合，将两种培养液充分混合，在温度37.0±0.5℃、湿度95.0±5.0％、CO₂浓度5.0±0.2％的CO₂培养箱内培养4天(总培养液量约2L)。
8.制备及填充工序
在扩增培养2开始之后，于第4天(总计第14～17天)从2个被连接在一起的培养袋的一方将培养液各250mL移至4支250mL的离心管中，于室温下以1,500rpm离心8分钟。除去上清液，将剩下的1袋中的培养液移至上述250mL的离心管中。在与起初的袋相同的条件下进行离心，除去上清液。使4支250mL离心管中的细胞分散，然后用500mL添加了0.1％的人白蛋白的生理盐水进行混悬，收集在2支250mL离心管中，于4℃下以1,700rpm离心8分钟, 对细胞进行清洗。重复进行同样的操作，清洗细胞2次。使清洗过的细胞分散，混悬于冷却至4℃的210mL添加了1％的人白蛋白的生理盐水中。采集10mL经混悬的细胞液作为上市检验用的样品。将剩余的200mL填充至制品填充用袋内，制成了制品。
[对本发明的以记忆细胞为主要成分的医疗组合物的分析]
采用与实施例2的(2)同样的方法，关于抗人CD45RO抗体(Becton·Dickinson公司制)及抗人CD62L抗体(Becton·Dickinson·Pharmingen公司制)，对通过本发明的方法获得的活化淋巴细胞和采用以往的方法制作的活化淋巴细胞的亚群实施了分析(图4)。
本发明的方法按照实施例5中记载的方法来进行。在OKT固相化烧瓶中对培养开始时的从外周血管采血分离出的单核细胞(淋巴细胞丰富的组分)(PBMC)进行了活化培养。在达到了4×10⁵/mL以上的该活化培养后第4天采集样品(+50)，然后添加50mL的培养基1，培养1天，采集样品(“冷冻”)后进行冷冻保存工序。在冷冻细胞解冻后立即采集样品(TW(解冻))并进行扩大培养工序，其后在OKT固相化烧瓶中进行活化培养2。在临活化培养2前采集样品(OKT)，然后立即采集样品(解冻BP)。其后在培养袋内进行扩增培养2，收获淋巴细胞，在临收获前采集细胞样品(解冻H(Harvest))。
在以往的方法中，用培养基1将培养开始时的从外周血管采血分离出的单核细胞(淋巴细胞丰富的组分)(PBMC)制成细胞混悬液，将50mL该混悬液在OKT固相化烧瓶中进行活化培养。在达到了4×10⁵/mL以上的该活化培养后第4天采集样品(+50)，然后添加50mL的培养基1，培养1天。在第5天采集样品(+150)，添加150mL的培养基1进行培养。进一步地，于翌日采集样品(生BP)。添加100mL的培养基1进行培养，在临完成培养前采集样品(生H)。需要说明的是，“+150”及“冷冻”样品是分为冷冻群和非冷冻群后立即进行采集而得到的样品，实质上是相同的。
对上述样品的细胞亚群进行了研究，结果在不包含冷冻处理工序的以往的方法中，获得的淋巴细胞群中记忆T细胞的比例为40％左右，与PBMC程度相同(图4A)，而使用本发明的方法时，获得的淋巴细胞群中记忆T细胞占约75％(图4B)。因此，根据本发明的方法，通过对采集的淋巴细胞进行冷冻保存，不仅可以提高便利性，还可以获得以在过继性免疫疗法等中作为有效成分的记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群。
Osumi等人为了阐明过继性免疫疗法中使用的活化淋巴细胞的作用机制，着眼于记忆T细胞亚群对活化扩增培养获得的活化淋巴细胞的功能进行了分析。其结果，确认了活化淋巴细胞中包含的效应型记忆T细胞在24小时时对癌症细胞显示出细胞抑制活性，而且中央型记忆T细胞在识别了肿瘤抗原后被活化，分化成效应型记忆T细胞，在48小时时呈现出细胞抑制活性。
以下，给出中央型记忆T细胞及效应型记忆T细胞对肿瘤细胞的效果。以有无抗人CD45RO抗体(Becton·Dickinson公司制)及抗人CD62L抗体(Becton·Dickinson·Pharmingen公司制)为指标，用流式细胞仪(Becton·Dickinson公司制；FACS Calibur)将活化的自身淋巴细胞(KC-362)分为中央型记忆T细胞(CM)和效应型记忆T细胞(EM)群(CM纯度99.6％，EM纯度98.5％)。接着，将分离得到的各细胞群与KT-362(来自患者的肿瘤细胞株)进行了共培养，对细胞障碍活性进行了分析(表8)。
表8

KT-362单独(对照组)时，与培养开始时的细胞数相比较，细胞数在24小时时增加至2.5倍、在48小时时增加至5.3倍。另一方面，与CM共培养时，观察到在24小时时增殖被抑制为0.9倍，在 48小时时减少至0.3倍。在培养后48小时时回收淋巴细胞，使用流式细胞仪(Becton·Dickinson公司制；FACS Calibur)进行了分析，结果发现CM的抗原型变成了EM。
在KT-362与EM的共培养中，与对照组的培养开始时的细胞数相比较，24小时时细胞数减少至0.2倍，48小时时未观察到活细胞。
因此，CM及EM均具有细胞抑制活性，其中CM虽然在抑制活性的呈现上存在时间差，但由于与EM相比其寿命长得多，所以认为其在长期内成为EM的稳定的供给源，从这点来看，表明含有选择性地扩增了CM的淋巴细胞群的组合物可以成为有效的治疗剂。
使用以往的方法获得的活化淋巴细胞群存在以下问题：只能在PBMC采集后活化培养3～7日左右的有限的期间内获得中央型记忆T细胞占有率高的活化淋巴细胞，并且在此期间细胞数尚未充分增加，而细胞数充分地增加之后，中央型记忆T细胞占有率将降低为20％以下(非专利文献3)。与此相对，根据本申请发明的方法，能够充分地增加细胞数，并且能够获得与EM相比CM占绝对多数的本发明的活化淋巴细胞群，虽然就细胞抑制活性而言较EM在活性呈现方面有一定延迟，但认为通过就活性本身而言并不比EM逊色的这种施予，能够实现细胞抑制活性高的EM的长期稳定供给，从而实现有效的治疗效果。而且，由于包含细胞冷冻阶段、该冷冻时期没有特别限定，因此对于长期保管以及急切的需求而言也可以迅速地制备记忆T细胞(特别是中央型记忆T细胞)占有率高的活化淋巴细胞群，从这点来看，便利性非常高。
产业上的可利用性
本发明可以合适地利用于包含活化淋巴细胞的治疗剂领域等。