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本发明提供一种利用分/离子谱实现个体化用药的方法，属医学领域。该方法以患者活体采集或体外培养材料为样本，测定施加药物前后样本的各种分/离子谱，通过分析归纳该分/离子谱与患者使用药物疗效的相关性，实现个体化指导患者用药的目的。

1、  一种利用分/离子谱实现个体化用药的方法，其特征是通过对患者活体或体外培养材料施加不同种类、剂量和组合的药物，测得的施加药物前后静态和动态分/离子谱；将该分/离子谱与不同种类、剂量和组合的药物的疗效数据进行相关性分析，获得个体化指导患者用药的方案。

2、  根据权利要求1所述的利用分/离子谱实现个体化用药的方法，其特征在于：静态和动态分/离子谱包括分/离子种类、分/离子绝对浓度及其变化、分/离子流动速率及其变化、分/离子流动方向及其变化等样本所有的分/离子时空特征的信息。

利用分/离子谱实现个体化用药
技术领域
本发明属医学领域，提供了一种利用分/离子谱实现个体化用药的方法，可用于多种药物种类、剂量和组合的选择，辅助医生预测药物对患者的疗效，针对具体患者找到适宜的药物、药物用量和药物组合。
背景技术
药物是临床治疗的重要手段之一，但当前药物治疗过程当中普遍存在药物的疗效和不良反应具有个体差异的现象。在临床治疗中，患者经相同途径接受相同剂量的药物后，治疗反应往往差异很大。有的患者疗效显著，有的患者没有疗效或疗效甚微，而另一些患者却已出现了明显的毒性反应。疗效好又没有毒性反应的患者只占接受治疗患者的一部分。从给药到产生药效是一个复杂的过程，年龄、体重、疾病状态、遗传因素、饮食及合并用药等个体的生理差异和病理特点都会影响药物的体内的代谢分解过程，以致相同用药方案产生的临床反应不尽相同。因此，实现药物治疗个体化不仅是当今药理学和临床药物治疗学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济价值。
药物剂量和所产生的药理强度受很多因素影响，存在很大的个体差异，因此理想的用药方案应当是根据每例病人的具体情况订制实现个体化用药。在医药临床工作中，用药个体化主要通过凭借临床医药人员的多年工作经验，根据临床症状，尽可能使用药适合每例病人的需要。如苯妥英钠常用剂量为每日300mg，对一部分病人尚不能预防癫痫发作，但对另一部分病人却已引起中枢神经系统的不良反应。这就要求医药人员掌握药物的药理作用和药理反应指标，每例病人的药动学情况，而且要求医药人员要有丰富的科学知识和临床经验。这种凭经验调整用药方案的方法具有一定的不科学性、盲目性和冒险性，准确性不高，容易延误治疗时机，影响患者的健康并导致医疗资源的浪费。对那些治疗指数低，安全范围窄，不良反应大，还有一些非线性药物动力学特征的药物依靠这种用药方式则更加危险。
目前所广泛应用的科学手段是以测定药物动力学参数，血药浓度指标，控制症状、计算出病人体内的药物动力学参数，然后再根据这些参数计算出用药的个体化方案。根据肾功能(肾清除率)调整用药剂量和给药间隔时间也有报道。国内外用于实验室的基因分析技术，包括测序、基因芯片、荧光PCR等手段均是通过检测患者的基因型来实现个体化用药。这些检测方法分别有价格昂贵，检测速度慢，技术稳定性和结果可靠性较差，操作复杂等缺点，不易推广到临床应用。
本发明针对目前治疗过程中用药种类和剂量难以确定的情况，提供了一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的利用分/离子谱体外预测患者对药物反应的方法。具体说来是通过选择或特异性识别分/离子信息手段，以活体或体外培养材料为样品，获得进出样品的各种分/离子绝对浓度及其变化、分/离子流动速率及其变化、分/离子流动方向及其变化等样本所有的分/离子时空特征的信息，建立各种分/离子信息的关系数据库，通过对比分析判断患者对某种药物、药物剂量和药物组合的敏感性。
发明内容
一种利用分/离子谱实现个体化用药的方法，该方法以患者活体采集或体外培养的细胞或组织为样本，测定施加药前后样本的分/离子信息，包括多种分/离子绝对浓度及其变化、分/离子流动速率及其变化、分/离子流动方向及其变化等样本所有的分/离子时空特征的信息，对各种分/离子信息进行分析归纳，通过与具体患者使用不同种类、不同剂量和不同组合药物的疗效信息进一步整合及进行相关性分析，得出某种药物、某种剂量和某种药物组合对该患者具有最佳疗效的信息，直接个体化指导该患者的临床用药。
现有的个体化判断患者对药物反应的方法，无论是凭借医生的临床经验还是测定患者的血药浓度和肾清除率，都需先对患者施药，待患者自身产生了疗效、无效或毒副作用后作出相应判断，而本发明则是在对患者施药前仅仅依靠其少量组织或细胞体外预测该患者对某种药物、药物剂量和药物组合的反应，避免了对患者试探施药的健康风险，做到有的放矢，同时减少了患者的医疗支出。本发明基于分子、离子水平判断患者对药物的敏感性，较比上述方法不仅准确性高，而且更快捷、有效；所需样本材料仅为患者的少量组织或细胞，取材方便，易于实施。
通过对患者基因型的分析确立个体化用药方案必须建立在已知某具体病症由某一特定基因控制的前提下，但多数疾病并非由一个基因控制而是受多个基因共同影响，况且目前大多数疾病所对应的基因并未完全被了解，所以该法实施起来具有很大的局限性。从基因到人体细胞的生理功能和表现过程是一个极为复杂的表达和修饰过程，即使掌握了病人的基因型，病人对于药物的反应还受到其年龄、体重和饮食状况等诸多因素的影响，如何用药还具有很大的不确定性。判断患者的基因型需经由DNA到PCR到对比分析等一系列繁杂程序，而本发明所采用的方法通过测定反映患者细胞的生理功能的分/离子谱，更加直接、简便、快捷，通过计算机直接输出结果，有效节约了医务工作者的人力资源，并为患者节约了宝贵的治疗时间。本发明可满足多种药物、不同药物剂量、不同药物组合的多重对比同时进行，应用范围广，个体化水平高。
附图说明
图1为乳腺癌细胞耐药株MCF-7/R和敏感株MCF-7/S加药(10μg/ml ADR)前后pHe的变化图。图中结果来自5个独立实验中的代表性数据。
图2为乳腺癌细胞耐药株MCF-7/R和敏感株MCF-7/S加药(10μg/ml ADR)前后H⁺流的变化图。图中结果来自5个独立实验中的代表性数据。
图3为MCF7细胞外H⁺活性加药(10μg/ml ADR)前后的变化图。图中箭头所示为H⁺选择性微电极在MCF7细胞附近外环境的监测点。每个柱形的数据为5个独立实验的均值。
图4为不同患者对解热止痛药泰诺(Tylenol)的离子流动速度差异图。
图5为不同浓度化疗药物紫杉醇(PTX)对同一患者肿瘤组织H⁺谱影响的变化曲线。样品编号为007。A中紫杉醇的浓度为10μg/ml，B中为100μg/ml，C中为100μg/ml。
图6为不同化疗药物对同一患者肿瘤组织H⁺影响的变化曲线。样品编号为009。A为施加浓度为10μg/ml的阿霉素EPI，B为施加8μg/ml的吡柔比星THP，C为施加100μg/ml的紫杉醇PTX。上述浓度均为厂家建议使用浓度。
图7为不同患者对相同浓度紫杉醇H⁺不同反应的变化曲线。A为样品为007，B为样品008，C为样品009。浓度为厂家建议使用浓度。
具体实施方式
取患者的少量组织、细胞直接为样本材料或通过体外培养手段获得样本材料。将待测样本置于样本检测池中，施加药物于检测液中，使用选择或特异性检测分子/离子信息的微电极，于分/离子谱检测平台上检测和记录样本的分/离子信息的变化，获得分/离子谱。对各分/离子谱进行关联比较分析，获得该患者对不同药物种类、药物剂量、药物组合的敏感性数据，从而实现体外预测患者对药物的反应。
实施例
实施例1
不同人乳腺癌细胞在化疗药物阿霉素处理下H⁺流动方向和速率的变化
细胞培养：人乳腺癌细胞阿霉素(ADR)敏感株MCF-7/S及耐药株MCF-7/R由首都医科大学附属北京中医医院中心实验室提供。ADR对MCF-7敏感细胞系的IC50(半数生长抑制浓度)为0.12262g/ml，对MCF-7/ADR耐药细胞系的IC50为36.55036g/ml。使用高糖DMEM培养基，含10％小牛血清和双抗(青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中传代培养。检测时，通过显微形态观察，选择贴壁良好的健康细胞进行H⁺活性检测。
氢离子谱的获得：使用非损伤微测系统(BIO-001A，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)以静态和动态的方式选择性地测定H⁺谱。H⁺选择性微电极(XY-H-01型)在预先确定距离(5～30μm)的两点间重复运动，从而测得特定离子的绝对浓度或浓度梯度，微电极的运动频率设定在0.01～10.00Hz范围内。接地参比电极(DRIREF-2；World Precision Instruments)为固体电极。
H⁺选择性微电极在使用前必须经过校正，只有能斯特斜率(Nernstian slopes)＞56mv/decade的电极才可使用。检测时将MCF-7及MCF-7/R细胞的DEME培养液换为专用测试液，在三维运动控制子系统的控制下，电极在距离细胞表面2μm左右的位置以dr＝10μm的移动距离，在垂直于培养皿底的方向上对细胞的H⁺流进行检测，将测试液更换为含10μg/mlADR的专用测试液后，检测相同的细胞，对比加药前后MCF7细胞外H⁺活性的变化。
通过上述措施，在获得乳腺癌细胞(MCF-7/S及MCF-7/R)pHe(附图1)的同时，获得跨膜H⁺流的实时动态信息(附图2)。加药前，耐药株的pHe值持续稳定的高于敏感株；而加药后，二者的pHe值出现巨大反差。敏感株和耐药株的pHe值均下降，但敏感株的pHe值明显高于耐药株，且二者的pHe值差也显著增大(附图1)。附图2中H⁺流速为正值时表示H⁺外流，即流出细胞；为负值表示H⁺内流，即流入细胞。耐药株和敏感株加药前后H⁺的内流或外流均呈现振荡的特征，振荡幅度的变化不尽相同。加药前，耐药株的H⁺流速基本稳定，内流与外流交替；敏感株的H⁺大多数时间成内流趋势，流速不断发生变化。在加药后，由于弱碱性药物的作用，耐药株的H⁺全部外流，且流速增大；敏感株的H⁺出现内流与外流交替，外流速率较内流速率明显增大。加药后H⁺流振荡的幅度耐药株明显比敏感株大，且耐药株H⁺流加药后振荡幅度明显比加药前增强，而敏感株加药前后振荡幅度变化不明显。加药后，耐药株的H⁺外流速率明显高于敏感株，而两者的pHe也相应降低，且耐药株降低幅度明显大于敏感株。分别对耐药株及敏感株5个细胞所测得的H⁺流变化进行数理统计(附图3)。耐药株加药前净H⁺流接近零，加药后H⁺强烈外流，均值为34.7pico moles/cm²/s；敏感株加药前净H⁺流呈明显内流(-17.4pico moles/cm²/s)，加药后H⁺转为外流(7.5pico moles/cm²/s)。
人乳腺癌细胞耐药株和敏感株分别代表不同的典型患者即耐药患者和敏感患者的细胞，二者对化疗药物ADR的敏感程度明显不同。该实施例有效证明了根据分/离子谱来判断患者肿瘤细胞对某种化疗药物是否敏感是有效且可行的。
实施例2
不同患者对解热止痛药泰诺的差异性反应
解热止痛药泰诺(Tylenol)，又称扑热息痛、泰诺止痛片等，适用于感冒发烧、关节痛、神经痛及偏头痛、癌性痛及术后止痛。该药抑制外周前列腺素合成作用弱，对血小板凝血机制无影响，抑制中枢神经系统前列腺素合成的作用与阿司匹林相似，因此对阿司匹林不耐受或过敏者不适用。口服吸收迅速，完全，在体液内分布均匀，大部分在肝脏代谢，中间代谢产物对肝脏有毒，以葡萄糖醛酸结合物形式或从肾脏排泄，半衰期一般为1～4h。常规的用量为每次口服0.25～0.5g，1日3～4次，1日量不宜超过2g，疗程不宜超过10日。
患者MarkHallen和YueXu同一时间分别服用相同剂量的泰诺，同时取二者的口腔上皮细胞为样本，氢离子、钙离子和钾离子信息的获得同实施例1中氢离子的获得。
两患者用药后，Ca²⁺、K⁺和H⁺的平均流动速度具有明显差异(附图4)。二者的Ca²⁺和K⁺均呈现内流，H⁺呈现外流。患者MarkHallen的Ca²⁺流动的平均速率是患者YueXu的二倍以上。与此同时，患者MarkHAllen的K⁺流动的平均速率略高于患者YueXu。二者H⁺流动的平均速率较大，均超过了50pico moles/cm²/s。患者YueXu的H⁺流动的平均速率更高，达到65picomoles/cm²/s，而患者MarkHallen的H⁺流动的平均速率较低，为55pico moles/cm²/s左右。
上述实施例说明不同的患者对解热止痛药泰诺的敏感程度差异很大，应针对患者个体化用药。
实施例3
以三名患者的乳腺癌穿刺组织为待测材料，编号分别为007、008和009，组织取出后于美国扬格科技公司提供的专用溶液中进行检测，采集加药前后H⁺谱信息(此处为H⁺速率和方向)。H⁺流速为正值时表示H⁺外流，即流出样品；负值表示H⁺内流，即流入样品。
样品编号    姓名    性别    年龄    病历号   取样日期    取样时间  取样位置
007         吴某某  女性    43岁    95*****  20080311    9:30AM    右乳肿物
008         彭某某  女性    55岁    95*****  20080312    10:15AM   右乳肿物
009         白某    女性    70岁    95*****  20080319    11:00AM   左乳肿物
比较同一患者的乳腺癌穿刺组织对施加不同浓度化疗药物紫杉醇的H⁺谱的变化。编号为007的患者的乳腺癌肿瘤组织的H⁺谱在紫杉醇为10μg/ml时基本稳定的在0上下略微浮动，加药对其未造成显著影响，没有明显的H⁺流速变化(附图4A)。当紫杉醇的加药量提高到100μg/ml时，加药后，H⁺迅速以高速率内流，而后逐渐恢复，最终趋于平缓直到稳定在0周围(附图4B)。当紫杉醇的量提高到1000μg/ml时，H⁺全部呈现内流，内流幅度为100μg/ml时的数百倍，并持续2000秒仍未结束且保持稳定的内流状态，随时间的延长速率逐渐降低(附图4C)。由此可判断，患者007的肿瘤组织对1000μg/ml的紫杉醇最为敏感。
比较同一患者的乳腺癌穿刺组织施加不同化疗药物的H⁺谱变化，药物浓度均为厂家建议体外实验用药浓度。样品编号为009的患者对不同化疗药物的H⁺响应明显不同，施加浓度为10μg/ml的表阿霉素EPI和8μg/ml的吡柔比星THP对该患者的乳腺癌组织的H⁺信息未造成显著影响(附图5A、B)，而施加100μg/ml的紫杉醇PTX则使该患者的肿瘤组织的H⁺表现出敏感特征(附图5C)。由此可判断，患者009的肿瘤组织对紫杉醇较比另外两种化疗药物敏感。
分别对三位患者的样品007、008和009施加100μg/ml的紫杉醇，比较不同患者乳腺癌穿刺组织外H⁺谱加药前后的变化。加药后，样品007和008均出现H⁺的吸收，但强度不同，样品007的H⁺迅速呈现大幅度内流，而后随时间逐渐恢复(附图6A)；样品008在加药后的H⁺也出现了内流反应，但速率不及样品007的二分之一，且速率迅速恢复到0左右(附图6B)。与上述二者不同，样品009在加药后，H⁺显著迅速外流，出现较强的H⁺外排，速度是样品007内流速率的4倍，是样品008内流速率的8倍左右，此后迅速恢复到加药前的水平(附图6C)。该结果说明不同患者的乳腺癌组织对相同浓度化疗药物的敏感程度显著不同。
上述实施例证明，利用分/离子谱可有效判断不同乳腺癌患者对不同药物和药物剂量的敏感性。1000μg/ml的紫杉醇对患者007最为有效，紫杉醇对患者009较比另外两种化疗药物更为有效，100μg/ml的紫杉醇对患者007、008和009的疗效不同。