基于功能化的金纳米探针比色检测饮用水或细胞中ALSUP3/SUP的方法.pdf

本发明涉及基于功能化的金纳米探针比色检测饮用水或细胞中Al3+的方法。本发明应用多肽修饰的功能化的金纳米粒子作为检测探针，高灵敏度和高选择性的在饮用水或细胞中检测Al3+。饮用水中检出限为0.1μmol/l；细胞中检出Al3+的线性范围为(1-10)μmol/l。该检测方法简单快速，灵敏度高，选择性好，可实现裸眼检测。

1、  基于功能化的金纳米探针比色检测饮用水或细胞中Al³⁺的方法，其特征在于，步骤和条件如下：
1)合成作为探针的功能化的金纳米粒子：
首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液；
2)在去离子水中检测Al³⁺
首先，将20μl，12nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液分别加入到180μl的16种金属离子：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的水溶液中，使每种金属离子溶液的最终浓度分别为0.1-10μmol/l；5分钟后，观察溶液颜色变化；
当每种金属离子浓度为1.5μmol/l时，仅含有Al³⁺的溶液颜色发生变化：功能化的金纳米粒子探针溶液颜色的由红色变为浅紫色，而含有其他离子的溶液颜色无变化；当溶液中Al³⁺浓度从1.5μmol/l增加至6μmol/l时，溶液颜色的变化依次为浅紫、紫色、蓝紫色和蓝色；当Al³⁺浓度大于6μmol/l时，溶液的颜色不再继续变化；其它每种金属离子在浓度小于10μmol/l时，溶液颜色均不发生明显变化；
3)在饮用水中检测Al³⁺
将饮用水样用6mol/l的HCl酸化至pH 3，使饮用水中的Al转化为Al³⁺形式；再用6mol/l的NaOH将pH调至中性，将20μL，12nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液加入到180μl上述处理的饮用水样中并混合均匀，5分钟后，观察溶液颜色变化情况；若饮用水样中Al³⁺的浓度小于1.5μmol/l，溶液的颜色无明显变化，功能化的金纳米粒子探针溶液颜色的红色；若饮用水样中的Al³⁺大于1.5μmol/l，则溶液的颜色从功能化的金纳米粒子探针溶液的红色依次向浅紫色，紫色，蓝紫色，蓝色方向变化；当饮用水样中的Al³⁺浓度大于6μmol/l时，溶液的颜色不再继续变化，依然为蓝色；
4)在细胞中检测Al³⁺
首先将子宫颈癌Hela细胞放到细胞培养基中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中孵育24小时，孵育温度为37℃；细胞孵育好之后，取Al³⁺的浓度分别为1、5、8、10、50和100μmol/l的上述溶液各200μl，分别加入到上述细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养2小时，之后再用pH为7.2，成分由20mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.15mol/l的NaCl组成的缓冲溶液洗三次；再与200μl，2.4nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养45分钟，用上述缓冲溶液洗三次后，在光学明场显微镜下观察；不同浓度的Al³⁺导致金纳米粒子不同程度的聚集而使细胞呈现由浅到深的红色：Al³⁺浓度为1μmol/l时，细胞仅能看到少量的很浅的红色；Al³⁺浓度为5μmol/l时，细胞上的红色变深；Al³⁺浓度为10μmol/l时，细胞上的红色已经相当明显；Al³⁺浓度增加至100μmol/l时，细胞上依然为明亮的的红色；无Al³⁺共培养时，细胞上观察不到金纳米粒子聚集，颜色为无色。

基于功能化的金纳米探针比色检测饮用水或细胞中Al³⁺的方法
技术领域
本发明涉及基于功能化金纳米粒子比色检测饮用水中或细胞中Al³⁺的方法。
技术背景
金属纳米粒子所表现出来的距离依赖的光学特性和大的比表面积等特点，使其可以作为重要的比色材料而进行应用。它们的表面等离子共振吸收的摩尔消光系数是有机染料的100倍以上。利用它们的尺寸和形状依赖的光学性质，以纳米粒子为基础的分子识别方法提供了可以与荧光方法相比拟的灵敏度和选择性(化学综述，Chem.Rev.，2005，105，1547-1562；化学综述，Chem.Rev.，2004，104，293-346)。目前，基于金属纳米粒子的传感器已经被应用于DNA、蛋白质、抗原-抗体免疫反应以及金属离子检测等多个方面(美国化学会志，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，6642-6643；纳米通讯，Nano.Letters，2008，8，529-533)。
研制金属离子检测器一直是相关领域研究的热点。金属离子在环境以及生物体内都起着至关重要的作用。尽管在人体内的含量不多，但与人的生存和健康息息相关。它们的摄入过量、不足或缺乏都会不同程度地引起人体生理的异常或发生疾病。因此无论在环境或生物体内检测金属离子都是非常重要和必要的。金属离子检测器也从以往的传统的检测方法如原子吸收、色谱以及诱导等离子体质谱等转变为需要简单、快速、能够定量检测和实时监测的灵敏度高和选择性好的检测器来检测各种有益或有害的金属离子。目前已经发展了很多离子检测器，但是较少有应用于Al³⁺的检测器。
铝在生物体内有重要的生理作用。一方面，大量的体外(in vitro)实验证明了铝能抑制许多基础代谢如三羧酸循环和糖酵解中的酶的活性；另一方面，通过许多途径(食物、药物和饮用水)进入人体中的铝会导致一系列神经系统疾病，如老年痴呆症、阿尔茨海默症、帕金森症、透析脑病、骨软化和贫血症等(科学，Science，1980，208，297-299；科学，Science，1973，180，511-513)。传统的检测铝的方法一般是原子吸收和发射光谱等，但仅能检测总铝含量。目前还未有基于功能化的金纳米粒子在水中或细胞中检测Al³⁺的报道。
发明内容
为了解决已有技术存在的问题，本发明的目的是提供基于功能化的金纳米粒子检测饮用水或细胞中的Al³⁺的方法。
本发明是利用氨基酸序列为半胱氨酸-丙氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺(CALNN)对纳米金表面进行修饰而得到的一种检测探针。CALNN与金表面有很强的亲和性，能够形成致密的保护层，使金纳米粒子溶于水溶液，并可以保持长期的稳定性。CALNN肽链N端半胱氨酸的硫醇键与金表面可以形成牢固的共价键，疏水性的丙氨酸和亮氨酸能够促进多肽的自组装，在C端的两个天冬酰氨使多肽亲水。因此CALNN修饰的纳米金粒子具有良好的水溶性。而CALNN的C端带有羧基，可以和Al³⁺特异性的络合，能够灵敏度高选择性好的检测Al³⁺而不受其他金属离子影响。而由CALNN功能化的纳米金粒子带有负电荷，不会与细胞发生作用。因此，本发明可以利用该体系在饮用水或细胞中高灵敏和高选择性的检测Al³⁺。
实现本发明的方法的具体的技术方案如下：
1.合成作为探针的功能化的金纳米粒子：
首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液；
2.在去离子水中检测Al³⁺
首先，将20μl，12nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)分别加入到180μl的16种金属离子：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的水溶液中，使每种金属离子溶液的最终浓度分别为0.1-10μmol/l；5分钟后，观察溶液颜色变化和测定相对应的紫外可见吸收光谱；
当每种金属离子浓度为1.5μmol/l时，仅含有Al³⁺的溶液颜色发生变化：功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)颜色的由红色变为浅紫色，而含有其他离子的溶液颜色无变化；当溶液中Al³⁺浓度从1.5μmol/l增加至6μmol/l时，溶液颜色的变化依次为浅紫、紫色、蓝紫色和蓝色；当Al³⁺浓度大于6μmol/l时，溶液的颜色不再继续变化；其它每种金属离子在浓度小于10μmol/l时，溶液颜色均不发生明显变化；
测定上述溶液的紫外可见吸收光谱，当溶液中Al³⁺浓度为1.5μmol/l时，紫外可见吸收光谱发生微小偏移：从522nm偏移至524nm；当溶液中Al³⁺浓度为6μmol/l时，紫外可见吸收光谱偏移至580nm；继续增加Al³⁺浓度，紫外可见吸收光谱不再继续发生偏移；其他的每种金属离子浓度小于或等于10μmol/l时，紫外可见吸收光谱无明显偏移。因国际标准规定饮用水Al含量最高为0.2mg/l，即7.4μmol/l，所以该探针可以不借助于任何仪器仅通过溶液颜色变化：由红色向蓝色渐变，就可以裸眼检测水体系中的Al³⁺；
3.在饮用水中检测Al³⁺
将饮用水样用6mol/l的HCl酸化至pH 3，使饮用水中的Al转化为Al³⁺形式；再用6mol/l的NaOH将pH调至中性，将20μL，12nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)加入到180μl上述处理的饮用水样中并混合均匀，5分钟后，观察溶液颜色变化情况。若饮用水样中Al³⁺的浓度小于1.5μmol/l，溶液的颜色无明显变化，功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)颜色的红色；若饮用水样中的Al³⁺大于1.5μmol/l，则溶液的颜色从功能化的金纳米粒子探针溶液的红色依次向浅紫色，紫色，蓝紫色，蓝色方向变化；当饮用水样中的Al³⁺浓度大于6μmol/l时，溶液的颜色不再继续变化，依然为蓝色；
4.在细胞中检测Al³⁺
首先将子宫颈癌(Hela)细胞放到细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中孵育24小时，孵育温度为37℃；细胞孵育好之后，取Al³⁺的浓度分别为1、5、8、10、50及100μmol/l的上述溶液各200μl，分别加入到上述细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养2小时，之后再用pH为7.2，成分由20mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.15mol/l的NaCl组成的缓冲溶液洗三次；再与200μl，2.4nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养45分钟，用上述缓冲溶液洗三次后，在光学明场显微镜下观察；不同浓度的Al³⁺导致金纳米粒子不同程度的聚集而使细胞呈现由浅到深的红色：Al³⁺浓度为1μmol/l时，细胞仅能看到少量的很浅的红色；Al³⁺浓度为5μmol/l时，细胞上的红色变深；Al³⁺浓度为10μmol/l时，细胞上的红色已经相当明显；Al³⁺浓度增加至100μmol/l时，细胞上依然为明亮的的红色；无Al³⁺共培养时，细胞上观察不到金纳米粒子聚集，颜色为无色。因此，功能化的金纳米粒子探针溶液可以用来检测细胞中的Al³⁺含量。
5.细胞中检测的选择性实验
实验方法与4相同。首先将子宫颈癌(Hela)细胞放到细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中孵育24小时，孵育温度为37℃；细胞孵育好之后，将K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺等15种金属离子储备液加入到细胞培养液(DMEM)中，配制成浓度均为10μmol/l的金属离子溶液；分别取200μl，10μmol/l的各种金属离子溶液加入到上述细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养2小时，之后再用pH为7.2，成分由20mmol/l的HEPES和0.15mol/l的NaCl组成的缓冲溶液洗三次；再与200μl，2.4nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养45分钟，用上述缓冲溶液洗三次后，在光学明场显微镜下观察；在上述15种离子存在的情况下，细胞上观察不到纳米金粒子的聚集，颜色为无色。因此，功能化的金纳米粒子探针溶液不能检测细胞中除Al³⁺以外的其它金属离子，所以具有良好的选择性。
有益效果：(1)本发明应用功能性的多肽CALNN对纳米金进行表面修饰。多肽起到两种作用：一种是利用C末端的羧基与Al³⁺的选择性的识别和络合来实现高灵敏高选择性的检测；另一种是做为稳定剂，既能稳定包裹纳米金粒子，也能使体系带有负电荷而不与细胞作用。
利用多肽CALNN稳定金纳米粒子，CALNN肽链N端的半胱氨酸能够以硫醇键与金表面形成牢固的共价键，丙氨酸和亮氨酸能够促进多肽的自组装，在C端的两个天冬酰氨使多肽亲水。多肽与纳米金反应在室温下进行，条件温和，无需特殊设备的辅助。该合成方法体系稳定，操作简单，所需时间短。
(2)首次利用功能化的纳米金粒子在细胞中检测Al³⁺。一直以来，Al³⁺在生物体内有重要的生理作用。一方面，大量的体外(in vitro)实验证明了铝能抑制许多基础代谢如三羧酸循环和糖酵解中的酶的活性；另一方面，通过许多途径(食物、药物和饮用水)进入人体中的铝会导致一系列神经系统疾病，如老年痴呆症、阿尔茨海默症、帕金森症、透析脑病、骨软化和贫血症等。因此，无论是在饮用水中还是在细胞内检测Al³⁺，都具有非常重要的意义。
(3)首次将功能化的纳米金粒子应用于细胞中金属离子检测。
尽管金属离子检测器有很多，但是能应用于生物体系检测的并不多。因为这需要检测器水溶性好，灵敏度高，不与复杂的生物体系作用，等等。目前，应用于细胞中检测金属离子仅有文献中报告的几种方法，而且都是基于荧光检测原理。还未有文献报道应用功能化的纳米金粒子在细胞中检测金属离子的方法。本发明首次将纳米金粒子应用于细胞中检测Al³⁺，并得到了很好的结果。
(4)检测简单直观。相比较细胞检测的检测手段——电子显微镜，荧光显微镜等，该检测结果可由普通明场光学显微镜观察。样品不需其他预处理，检测时间短，每个小时可以检测上百个样品。金纳米粒子的显色性稳定，不会淬灭的性质可使检测样品长时间保存。检测方法简单直观。
附图说明
图1(a)是CALNN包覆的13nm金粒子的紫外可见吸收光谱；(b)是加入10μmol/l Al³⁺的紫外可见吸收光谱。其中，未加入Al³⁺时金纳米粒子呈离散状态，紫外最大吸收为λ＝522nm((a))；加入Al³⁺后金纳米粒子呈聚集状态，紫外最大吸收为λ≈580nm((b))。
图2是以摩尔消光吸收比率(ε₅₈₀/ε₅₂₂)表示的在水中检测Al³⁺的线性范围紫外光谱图。
图3是以摩尔消光系数比率(ε₅₈₀/ε₅₂₂)表示的在水中检测Al³⁺的选择性的紫外光谱图。其中：1，金纳米粒子探针溶液；2，Na⁺；3，K⁺；4，Mg²⁺；5，Ca²⁺；6，Ba²⁺；7，Zn²⁺；8，Mn²⁺；9，Cu²⁺；10，Co²⁺；11，Ni²⁺；12，Cd²⁺；13，Fe²⁺；14，Al³⁺；15，Fe³⁺；16，Hg²⁺；17，Pb²⁺。图中各种离子浓度均为10μmol/l。
图4(a)是CALNN包覆的金纳米粒子的紫外可见吸收光谱；(b)饮用水中检测Al³⁺的紫外可见吸收光谱，测得饮用水中Al³⁺浓度大于6μmol/l。
图5是在细胞中检测不同浓度的Al³⁺的光学明场显微镜照片。(a)5μmol/l Al³⁺；(b)10μmol/l Al³⁺；(c)无Al³⁺。其中(a)中细胞颜色有较少红色；(b)中细胞呈现鲜亮的红色；(c)中细胞为无色。
图6是将先与不同浓度的Al³⁺共培养再与金纳米粒子探针溶液共培养的细胞消化后的紫外可见吸收光谱。(a)1μmol/l Al³⁺；(b)5μmol/l Al³⁺；(c)8μmol/l Al³⁺；(d)10μmol/l Al³⁺；(e)50μmol/l Al³⁺；(f)100μmol/l Al³⁺。插图中所测吸光度的峰位置为λ＝530nm。
图7是当浓度均为10μmol/l时，在细胞中检测包括Al³⁺在内的15种金属离子的光学明场显微镜照片。
具体实施方式
实施例1提供了一种基于功能化纳米粒子在水体系中检测Al³⁺的方法。首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液；
将20μl，12nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液分别加入到180μl不同浓度的16种金属离子：Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的水溶液中，使各种金属离子溶液的最终浓度分别为0.1-10μmol/l；5分钟后，观察溶液颜色变化和测定相对应的紫外可见吸收光谱。
当金属离子浓度为1.5μmol/l时，仅含有Al³⁺的溶液颜色发生变化：从功能化的金纳米粒子探针溶液的红色变为浅紫色，而含有其他离子的溶液无变化；当溶液中Al³⁺浓度从1.5umol/l增加至6μmol/l时，溶液颜色的变化依次为浅紫、紫色、蓝紫色和蓝色；当Al³⁺浓度大于6μmol/l时，溶液的颜色不再变化；其它离子在浓度小于10μmol/l时，溶液颜色均不发生明显变化；
测定上述溶液的紫外可见吸收光谱，当溶液中Al³⁺浓度为1.5μmol/l时，紫外可见吸收光谱发生微小偏移：从522nm偏移至524nm；当溶液中Al³⁺浓度为6μmol/l时，紫外可见吸收光谱偏移至580nm；继续增加Al³⁺浓度，紫外可见吸收光谱不再继续发生偏移；其他的金属离子浓度小于或等于10μmol/l时，紫外可见吸收光谱无明显偏移。
实施例2p-GNPs的合成方法与实施例1相同。首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液；
将某饮用水样品用6mol/l的HCl酸化至pH 3，使饮用水中的Al转化为Al³⁺形式；再用6mol/l的NaOH将pH调至中性。将20μl，12nmol/l的金纳米粒子探针加入到180μl上述处理的饮用水样中并混合均匀。5分钟后，裸眼即可观察到溶液的颜色由金纳米粒子探针溶液的红色变为蓝色。
实施例3提供了一种基于功能化的纳米粒子在细胞中检测Al³⁺的方法
首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液；
首先将子宫颈癌(Hela)细胞放到细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中孵育24小时，孵育温度为37℃；细胞孵育好之后，取Al³⁺的浓度分别为1、5、8、10、50及100μmol/l的上述溶液各200μl，分别加入到上述细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养2小时，之后再用pH为7.2，成分由20mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.15mol/l的NaCl组成的缓冲溶液洗三次；再与200μl，2.4nmol/l的功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养45分钟，用上述缓冲溶液洗三次后，在光学明场显微镜下观察；不同浓度的Al³⁺导致金纳米粒子不同程度的聚集而使细胞呈现由浅到深的红色：Al³⁺浓度为1μmol/l时，细胞仅能看到少量的很浅的红色；Al³⁺浓度为5μmol/l时，细胞上的红色变深；Al³⁺浓度为10μmol/l时，细胞上的红色已经相当明显；Al³⁺浓度增加至100μmol/l时，细胞上依然为明亮的的红色；无Al³⁺共培养时，细胞上观察不到金纳米粒子聚集，颜色为无色。因此，功能化的金纳米粒子探针溶液可以用来检测细胞中的Al³⁺含量。
实施例4
实施例4与实施例3不同之处是检验功能化的金纳米粒子探针溶液的浓度不同对检测效果的影响。
纳米金粒子探针的合成方法与实施例1相同。首先，按照Frens-Turkevich方法，利用柠檬酸钠还原氯金酸制备出粒径为13nm金粒子：将浓度为1mg/ml的五肽CALNN加入到粒径为13nm金粒子水溶液中，使五肽CALNN在上述混合溶液中的的最终浓度为0.1mg/ml，室温下静置反应1小时，离心13000rpm后抛弃上清液；将离心下来的沉淀加入去离子水，再离心13000rpm后抛弃上清液；最后将离心下来的的沉淀物溶于去离子水中，得到功能化的金纳米粒子探针溶液(p-GNPs)；
首先将子宫颈癌(Hela)细胞放到细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中孵育24小时，孵育温度为37℃；细胞孵育好之后，取Al³⁺的浓度分别为1、5、8、10、50及100μmol/l的上述溶液各200μl，分别加入到上述细胞培养基(DMEM)中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养2小时，之后再用pH为7.2，成分由20mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.15mol/l的NaCl组成的缓冲溶液洗三次；之后分别将浓度为1.2、3.6或4.8nmol/l的金纳米粒子探针溶液各200μL加入到上述细胞中，在体积比为5％CO₂和95％空气的细胞培养箱中，37℃下共培养45分钟后，再用上述缓冲溶液洗三次。通过光学明场显微镜观察，尽管检测探针p-GNPs的浓度不同，但实验结果与实施例3的实验结果相同：不同浓度的Al³⁺导致金纳米粒子不同程度的聚集而使细胞呈现由浅到深的红色：共培养的Al³⁺浓度为1μmol/l时，细胞仅能看到少量的很浅的红色；共培养的Al³⁺浓度为5μmol/l时，细胞上的红色变深；当共培养的Al³⁺浓度为10μmol/l时，细胞上的红色已经相当明显；当共培养的Al³⁺浓度增加至100μmol/l时，细胞上依然为明亮的的红色；无Al³⁺共培养时，细胞上观察不到金纳米粒子聚集，颜色为无色。因此，功能化的金纳米粒子探针溶液的浓度对检测结果无影响。