一种透明质酸的纯化方法 技术领域：
本发明涉及透明质酸，尤指一种透明质酸的纯化方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，分子式为(C14H21NO11)n，依据组织来源不同，分子量变化范围为2×105～7×106，双糖单位数为300～11000对。
商品透明质酸一般为钠盐形式，为白纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。透明质酸钠的大分子网状结构通过与H2O形成氢键结合大量的水，在体内具有构成多种基质、调节渗透压、调控大分子物质的转运、在细胞周围形成物理屏障以及调节细胞功能等作用。透明质酸钠可作为眼科手术辅助用药及变形性膝关节病和肩关节周围炎的辅助治疗，还在组织生成、创伤愈合、肿瘤入侵和调节细胞功能诸方面具有重要的生理功能。
透明质酸钠制剂中残留的蛋白质和核酸等杂质是导致其致炎症性地主要原因。长期以来，在生物分离纯化技术领域，寻求生物物质的分离纯化的新技术新方法，减少杂质含量成为业界关注的重点。
在以往的公开的文献中，无论是提取法还是发酵法生产透明质酸钠的纯化工艺，对于用季铵盐沉淀及解离这一步，一般使用的季铵盐是氯代十六烷基吡啶(CPC)，与透明质酸钠搅拌络合后，均采用静置，弃去上清液，收集结块后的络合沉淀，然后进行解离。这中工艺方法有诸多缺点：
1.CPC价格高，生产成本高且毒性也相对较大。
2.络合静置过程中，络合沉淀中易包裹许多杂质(如一些蛋白物质等)而带入下一工序或最终产品中。
3.络合沉淀结块后，解离时间一般需8-10小时，一方面时间长，过程中透明质酸钠会发生降解，能耗较高；另一方面不利于大生产操作。
另外，也有文献报道季铵盐用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法。
发明内容：
本发明所解决的技术问题，克服了上述生产透明质酸工艺方法的不足，提供一种减少杂质含量，尤其是减少透明质酸制剂中残留的蛋白质和核酸等杂质的纯化方法。
具体的技术方案是：
在络合沉淀阶段，透明质酸钠与CPC、CTAB或CTAC在搅拌下充分络合完全后，弃去上清液，再加入原药液体积0.3-3倍量的水，搅拌洗涤CPC、CTAB或CTAC络合沉淀3-60min，弃去上清液；重复上述方法洗涤1-5次，最后收集络合沉淀，其余步骤与现有制备透明质酸钠的方法相同。
本发明的另一目的是提供一种可缩短解离时间，降低生产成本，特别适合工业化生产的透明质酸纯化方法。
在得到上述松散的絮状或粉末状CPC、CTAB或CTAC的络合沉淀后，在解离过程中，加入解离液后，搅拌解离20-60min即可，大大缩短了解离时间，减少了生产成本。
上述优选的季铵盐采用十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，其价格为CPC的十分之一，且毒性也比CPC低。
具体实施方式：
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。
实施例1：
以现有提取法制备透明质酸，取透明质酸钠发酵液1L，经前处理过滤除菌体，加入2倍95％乙醇醇沉，收集透明质酸钠絮状沉淀，用1L注射用水搅拌溶解，加入200ml5％CTAC溶液，搅拌使络合完全，缓慢弃去上清液，再往CTAC络合沉淀中加入500ml注射用水，搅拌洗涤CTAC沉淀5-10min，再次弃去上清液；相同方法重复洗涤CTAC沉淀共1次。取出CTAC络合沉淀，加入到0.5M氯化钠的解离液中，搅拌使CTAC沉淀解离完全，约需20-60min，加入硅藻土和活性碳吸附过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠。收集透明质酸钠沉淀，用1L注射用水溶解，粗滤后再用0.2umPES滤芯除菌过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠，真空干燥后得样品。
实施例2：
以现有发酵法制备透明质酸，取透明质酸钠发酵液1L，经前处理过滤除菌体，加入2倍95％乙醇醇沉，收集透明质酸钠絮状沉淀，用1L注射用水搅拌溶解，加入200ml5％CTAC溶液，搅拌使络合完全，缓慢弃去上清液，再往CTAC络合沉淀中加入1500ml注射用水，搅拌洗涤CTAC沉淀30-35min，再次弃去上清液；相同方法重复洗涤CTAC沉淀共3次。取出CTAC络合沉淀，加入到0.5M氯化钠的解离液中，搅拌使CTAC沉淀解离完全，约需20-60min，加入硅藻土和活性碳吸附过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠。收集透明质酸钠沉淀，用1L注射用水溶解，粗滤后再用0.2umPES滤芯除菌过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠，真空干燥后得样品。
实施例3：
以现有发酵法制备透明质酸，取透明质酸钠发酵液1L，经前处理过滤除菌体，加入2倍95％乙醇醇沉，收集透明质酸钠絮状沉淀，用1L注射用水搅拌溶解，加入200ml5％CTAC溶液，搅拌使络合完全，缓慢弃去上清液，再往CTAC络合沉淀中加入2500ml注射用水，搅拌洗涤CTAC沉淀50-55min，再次弃去上清液；相同方法重复洗涤CTAC沉淀共5次。取出CTAC络合沉淀，加入到0.5M氯化钠的解离液中，搅拌使CTAC沉淀解离完全，约需20-60min，加入硅藻土和活性碳吸附过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠。收集透明质酸钠沉淀，用1L注射用水溶解，粗滤后再用0.2umPES滤芯除菌过滤，加入2倍体积95％乙醇醇沉出透明质酸钠，真空干燥后得样品。
实施例4：
对CTAC络合沉淀洗涤和未洗涤的3批样品进行平行实验，测定结果见下表1：
如上述CTAC络合沉淀洗涤前后杂质含量对比表表所示，在对透明质酸钠的提取液和发酵液纯化过程中，在络合沉淀和解离过程中采用以上方法进行纯化透明质酸钠，最终使透明质酸钠中的杂质核酸和蛋白质的吸收度和含量都大大降低，其中核酸的吸收度(A257nm)平均降低59.82％，蛋白质的吸收度(A280nm)平均降低54.25％，蛋白质含量平均降低75.52％。
实施例5：对CPC络合沉淀洗涤和未洗涤的3批样品进行平行实验测定，结果见下表2：
如上述CPC络合沉淀洗涤前后杂质含量对比表表2所示，在对透明质酸钠的提取液和发酵液纯化过程中，在络合沉淀和解离过程中采用以上方法进行纯化透明质酸钠，最终使透明质酸钠中的杂质核酸和蛋白质的吸收度和含量都大大降低，其中核酸的吸收度(A257nm)平均降低57.27％，蛋白质的吸收度(A280nm)平均降低51.06，蛋白质含量平均降低68.91％。
根据实用医药杂志2002年5月第19卷第5期第387～388的记载，核酸和蛋白质是透明质酸钠不良反应的主要原因，减少了核酸和蛋白的含量可减少炎症发生的概率。
尽管对本发明已经作了详细的说明并引证了一些具体实施例，但对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化和修正是显然的。