精制花青苷的制造方法 【技术领域】
本发明涉及从含有杂质和花青苷(anthocyanin)的粗色素成分制造精制花青苷的方法。
背景技术
随着石油化学的发展，开发出了色彩和耐久性优良的低价格合成色素(焦油类色素)作为染料，并被广泛使用。但是，尽管合成色素的上述性质优良，其安全性却受到质疑。实际上，经过毒性检测，现在只有有限种类的合成色素处于被批准使用的状态。并且，近年来，食品和环境问题被热烈地讨论，安全性也时常占非常大的比重，天然物质来源的色素再一次受到关注。
作为此类天然物质来源的色素，花青苷在很久以前即被知晓。花青苷是将花青素(anthocyanidin)转化为苷元(aglycone)而成的色素，是用作例如食品添加剂、有色油墨等的色素、药品等的染料的物质。而且，它还是一种多酚，所以预期有功能性色素的效果。这样的花青苷广泛存在于例如植物的花、叶、果皮、种子等之中，实际上使用例如红甘蓝色素、红花色素、胭脂虫色素、栀子色素、葡萄果皮色素等天然染料。但是，这些天然染料不是花青苷的精制品，而是含有杂质的未精制品，因此，期望提供高纯度的天然物质来源的花青苷。
然而，从天然物质精制花青苷时，天然物质中含有各种杂质。其中也存在与花青苷分子量相当、电荷相当等的杂质，为获得高纯度的花青苷，只有通过例如HPLC等进行纯化。此类方法极为费时费力，进行大量精制是不现实的。再者，花青苷在弱酸性水溶液中不稳定，所以纯化非常困难(非专利文献1)。因此，精制的天然物质来源的花青苷虽然安全性优良，但存在价格昂贵、获得困难的问题。例如，红紫苏的叶中所含的紫苏苷每克的价格大约在数万日元，所以出现不容易购买的现状。
非专利文献1：Goto，T.，Kondo，T.，Tamura，H.，Imagawa，H.，Iino，A.and Takeda，K.：Structure of Gentiodelphin，an acylatedanthocyanin isolated from Gentiana makinoi，that is stable indilute aqueous solution，Tetrahedron Letters 23(36)，3695-3698(1982).
非专利文献2：Tadao Kondo，Kumi Yoshida、Atsushi Nagasawa，Takatoshi Kawai，Hirotoshi Tamura & Toshio Goto；Nature，Vol.358，No6386，1992
非专利文献3：Kondo，T.，Ueda，M.，Tamura，H.，Yoshida，K.，Isobe，M.，and Goto，T.：Composition of Protocyanin，aself-assembled supramolecular pigment，from blue cornflower ofCentaurea cyanus，Angewandte Chemie，Int.Ed English 33(9)，978-979(1994).
非专利文献4：Yoshida，K.，Kitahara，S.，Ito，D.，and Kondo，T.，Phytochemistry，67，992(2006)
非专利文献5：Takeda，K.，Yanagisawa，M.，Kifune，T.，Kinoshita，T.，Timberlake，C.F.，Phytochemistry 35(5)1167-1169，1994
【发明内容】
本发明的目的是提供一种从含有杂质和花青苷的粗色素成分中容易地制造精制花青苷的方法。为了实现上述目的，本发明的精制花青苷的制造方法从含有花青苷的粗色素成分中制造精制花青苷，其特征在于，包括下述步骤(A)-(D)。
(A)准备一种类黄酮化合物，该类黄酮化合物可与碱土金属和重金属中至少一种的金属离子以及花青苷一起形成金属络合物；
(B)在碱土金属和重金属中至少一种的金属离子的存在下，在液体中，使上述粗色素成分和上述类黄酮化合物相接触，形成含有上述花青苷、上述类黄酮化合物和上述金属离子的金属络合物；
(C)从上述液体中回收上述金属络合物；
(D)从上述金属络合物中解离花青苷。
另外，本发明的精制花青苷是由本发明的制造方法获得的精制花青苷。
在植物中，例如在鸭跖草中，也有由翠雀素型花青苷、类黄酮化合物(例如鸭跖黄酮苷)和金属离子(例如镁离子)形成的金属络合物(例如鸭跖草苷(commelinin))作为色素存在的报道(非专利文献2)。此外，还有报道说在鬼灯檠中，由花青素(cyanidin)型花青苷、类黄酮化合物和金属离子形成金属络合物(非专利文献3)，在绿绒蒿和蓝色鼠尾草中也形成同样的金属络合物(非专利文献4和非专利文献5)。因此，本发明人利用花青苷自身可与类黄酮化合物和金属离子一起形成金属络合物的性质，尝试建立从混有杂质的粗色素成分中纯化花青苷的方法。上述论文中报道的金属络合物是在植物中形成的金属络合物，或者，是将作为金属络合物的构成成分的特定的花青苷与特定的类黄酮化合物单独纯化，使用这些单独纯化品在金属离子的存在下重新构成的金属络合物。即，在该技术领域中，虽然有花青苷、类黄酮化合物和金属离子形成金属络合物的报道，但是，对于在含杂质条件下可形成特异性吸收花青苷的金属络合物，对于存在多种花青苷时形成金属络合物，以及对于形成论文中记载地类黄酮化合物和花青苷的组合以外的金属络合物，则完全不知。因此，本发明人经过刻苦研究，结果发现，即使对于混有杂质的含有花青苷的粗色素成分，在金属离子的存在下，通过使上述的类黄酮化合物和上述粗色素成分中的花青苷相接触，也可形成金属络合物。并且还发现，如果是含有花青苷的金属络合物，则可以与共存的杂质相分离。在含有花青苷和杂质的粗色素成分中，上述两者的分离极为困难，但如果是含有花青苷的金属络合物，则可容易地除去共存的杂质，这是本发明人首先发现的事实。另外，从含有花青苷的金属络合物中可以容易地解离花青苷，所以可以容易地制备精制花青苷，并且，上述金属络合物是已经除去杂质的高纯度的金属络合物，所以通过解离获得的精制花青苷也有很高的纯度。
因此，通过本发明可方便且容易地从上述粗色素成分中纯化花青苷，从而可以以低成本提供高纯度的精制花青苷。因此可以说，本发明是在包括食品领域等所有利用天然色素的领域中非常有用的技术。
【附图说明】
图1是粗色素成分的HPLC的色谱图。
图2是本发明的实施例中的复合物(金属络合物)的HPLC的色谱图。
图3是在本发明的另一个实施例中，Mg2+相对于花青苷的摩尔比(物质的量之比)与丙二酰紫苏苷的前后比所作的曲线图。
【具体实施方式】
如上所述，本发明的精制花青苷的制造方法从含有花青苷的粗色素成分中制造精制花青苷，其特征在于，包括下述步骤(A)-(D)。
(A)准备一种类黄酮化合物，该类黄酮化合物可与碱土金属和重金属中至少一种的金属离子以及花青苷一起形成金属络合物；
(B)在碱土金属和重金属中至少一种的金属离子的存在下，在液体中，使上述粗色素成分和上述类黄酮化合物相接触，形成含有上述花青苷、上述类黄酮化合物和上述金属离子的金属络合物；
(C)从上述液体中回收上述金属络合物；
(D)从上述金属络合物中解离花青苷。
本发明中，含有上述花青苷、类黄酮化合物和金属离子的金属络合物在下文中也称为“复合物”。另外，本发明的制造方法也可称为花青苷的精制方法。
<类黄酮化合物>
作为本发明中的类黄酮化合物，只要是与花青苷、上述金属离子一起形成金属络合物的类黄酮化合物就可以。这样的类黄酮化合物的实例有例如以下所示的黄酮(2-苯基色酮)及其衍生物等。上述衍生物的实例有例如含有羟基的黄酮醇、含有甲氧基的衍生物等。上述类黄酮化合物的实例有例如植物来源的黄酮，具体实例有鸭跖草来源的黄酮——鸭跖黄酮苷(Flavocommelin)(非专利文献2)、鬼灯檠来源的黄酮——芹菜素4’-(6-O-丙二酰葡萄糖苷)-7-葡糖苷酸(非专利文献3)、绿绒蒿来源的黄酮醇——黄酮醇3-龙胆二糖(getiobiose)或者黄酮醇3-(6-O-葡糖基-b-O-半乳糖苷)(非专利文献4)、蓝色鼠尾草来源的黄酮——芹菜素7，4’-二葡糖苷(apigenin 7，4’-diglucoside)(非专利文献5)、柑橘来源的黄酮——橙皮苷(hesperidin)、地奥司明(diosmin)、柑橘来源的黄酮——柚皮素7-葡糖苷(naringenin7-glucoside)、荞麦来源的黄酮——芦丁(rutin)、芹菜素、作为黄酮的芹菜素7-葡糖苷、芹菜素7-o-新橙皮糖苷、西利马林(silymarin)、橄榄来源的黄酮——藤黄菌素7-葡糖苷(luteolin 7-glucoside)等。
这些类黄酮化合物可以例如从植物中制备。通常，上述类黄酮化合物存在于花青苷集中的部位，因此，可从植物中花青苷集中的部位提取。作为具体实例，下面给出从鸭跖草制备上述鸭跖黄酮苷的方法的一个实例。
首先，压榨鸭跖草的花瓣。然后，在得到的榨汁中加入乙醇，进行乙醇沉淀，回收上清。加入乙醇的比例没有特别的限制，优选为榨汁的4-20倍(体积)。另外，在乙醇上清中含有鸭跖黄酮苷，在乙醇沉淀的沉淀物中含有由鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷、鸭跖草来源的花青苷(例如鸭跖草花色苷(Awobanin)或丙二酰鸭跖草花色苷)和金属离子构成的金属络合物(鸭跖草苷)。接着，将上述上清供给吸附剂，鸭跖黄酮苷吸附于上述吸附剂，通过结合甲醇的浓度，吸附的鸭跖黄酮苷被洗脱。此时，考虑到上述上清中所含的鸭跖黄酮苷与鸭跖草来源的花青苷以及金属离子形成金属络合物的可能性，优选在通过结合甲醇浓度洗脱之前，供给酸性水溶液，从吸附的鸭跖黄酮苷解离出鸭跖草来源的花青苷。上述吸附剂的实例有例如商品名Amberlite XAD(合成吸附剂，Oregano公司制造)。上述的酸性水溶液没有特别的限制，实例有例如盐酸等的水溶液。然后，回收通过结合甲醇浓度而洗脱的鸭跖黄酮苷成分。该鸭跖黄酮苷成分既可以直接使用，也可以例如浓缩后添加到有机溶剂和水的混合液中，加热结晶，再经干燥后使用。另外，对于类黄酮化合物，只要能够与下述的粗色素成分中的花青苷形成金属络合物就可以，例如，可以直接使用从植物中提出的粗类黄酮化合物成分。
其他的类黄酮化合物也可以通过例如与上述相同的方法来制备。例如，由鬼灯檠或绿绒蒿制备目标类黄酮化合物时，也可从例如花瓣中提取。另外，这些类黄酮化合物也可以使用例如合成品。
<金属离子>
本发明中，上述金属离子只要是碱土金属和重金属中至少一种的金属离子就可以。上述碱土金属离子的实例有例如镁离子，上述重金属离子的实例有例如锌、镍、镉、铁、钴、铝、铜、锰、铬、锡等的离子。其中，优选镁。
本发明中，在金属离子存在下、在液体中形成上述金属络合物，因此，优选在上述液体中添加离子化的金属化合物。这样的金属化合物没有限制，作为具体实例，可以举出碱土金属或重金属的乙酸盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐等。
<粗色素成分>
对于上述粗色素成分来说，只要含有花青苷就可以，但由于本发明是在花青苷与杂质共存的情况下，特别有效的花青苷的精制方法，所以上述粗色素成分优选为含有杂质的粗色素成分。这样的粗色素成分的实例有例如未经精制处理的植物提取物。植物提取液的实例有例如植物中含有目标花青苷的部位的榨汁。例如，如果是纯化花瓣中所含的花青苷，则可使用花瓣的榨汁，如果是纯化果实中所含的花青苷，则可使用果实的榨汁，如果是纯化果实或种子的皮中所含的花青苷，则可使用上述皮的榨汁等。另外，在只通过压榨不能够提取花青苷的情况下，也可以例如将含有目标花青苷的部位在溶剂中浸渍后再压榨。对上述溶剂没有限制，可列举出例如水、甲醇等有机溶剂、它们的混合溶剂，还可以进一步含有三氟乙酸等。上述植物的实例有例如紫苏、红甘蓝、葡萄、黑玉米、红萝卜、草莓、黑穗醋栗、蓝莓以及其他浆果类、黑豆、小豆等豆类、紫芋等薯类、红米等米类、紫洋葱、橄榄、苹果、金时豆、黑豆等豆类等等。这些植物的榨汁中通常含有蛋白质、糖、维生素、矿物质、脂质、花青苷以外的类黄酮化合物类、高分子化的多酚类等杂质。
对于这样提取的粗色素成分，可以例如在形成金属络合物之前，预先除去糖、蛋白质等极性成分。这样，可以更有效地从粗色素成分中纯化花青苷。作为上述极性成分的除去方法没有限制，例如可使用上述的吸附剂，具体地说，可使用商品名Amberlite XAD(合成吸附剂、Oregano公司制造)等。另外，如上所述，现有的问题是例如与花青苷的分子量和电荷类似的杂质(特别是花青苷以外的类黄酮化合物类和高分子化的多酚类等)，因此，例如在粗色素成分的准备过程中预先除去糖和蛋白质并不否定本发明的效果。
<花青苷>
本发明中，上述粗色素成分中所含的花青苷可以是一种，也可以是两种以上。并且同样地，由本发明的制造方法最终获得的精制花青苷成分中所含的花青苷可以是一种，也可以是两种以上。如上所述，花青苷是将花青素转化为苷元而形成的糖苷的总称，存在多种化合物。如上所述，在以前，这些多种花青苷之间不进行分离，在这之前，植物来源的粗色素成分中所含的花青苷和杂质的分离本身也是困难的。本发明中，由于形成金属络合物，杂质和花青苷之间的分离可以简单地进行，最终获得的精制花青苷成分中可以含有两种以上的花青苷。另外，在以前，虽然存在多种花青苷的分离技术，但存在作为其原料的花青苷成分的纯度的问题，而本发明能够提供杂质减少的精制花青苷成分，从而解决了这样的问题。从这点考虑，由本发明获得的精制花青苷成分可以含有两种以上的花青苷。再者，天然来源的花青苷即使不是单一成分的花青苷，而是多种花青苷的混合物，也具有很高的商品价值，这在本技术领域中是公知的。
这样的粗色素成分中所含的花青苷的种类没有限制，优选例如下式所示的花青苷。在下式中，R1-R7没有特别的限制，分别具有例如氢原子、羟基或者甲氧基等官能团，羟基与葡萄糖等结合形成所谓的糖苷。前面所述的官能团可以相同也可以不同，至少一个是羟基。另外，因为容易与类黄酮化合物形成金属络合物，所以优选是在下式所示的花青素的B环上具有两个以上羟基的花青苷。即，优选在下式中，R1、R2和R3中的至少两个是羟基。这样的花青苷的实例有例如：芍药花青素(Peonidin)类糖苷花青苷、翠雀素(Delphinidin)类糖苷花青苷、矮牵牛素(Petunidin)类糖苷花青苷、翠雀素类糖苷花青苷等。花青苷的具体实例有例如丙二酰紫苏苷、(甲基丙二酰)紫苏苷、紫苏苷、矢车菊色素苷(cyanin)、丙二酰鸭跖草花色苷、鸭跖草花色苷、花青素、翠雀素、木樨黄定(Luteolinidin)、矮牵牛素、欧匹尼定(Europinidin)等，但不限于此。另外，“花青素”和“花青苷”有时仅仅狭义地指下式表示的化合物及其糖苷中特定的物质，但在本发明中，更广义地指存在于例如植物的花、叶、果皮、种子等中的全部色素。
[化1]
在下式中，列出了花青苷的一个实例。
[化2]
[表1]
R1 R3 X Y 丙二酰鸭跖草花色 苷(Malonyl awobanin) OH OH 丙二酰-H (Malonyl-H) 对香豆酰 (p-coumaryl ) 鸭跖草花色苷 (Awobanin) OH OH H 对香豆酰 (p-coumaryl ) 丙二酰紫苏苷 (Malonyl shisonin) OH H 丙二酰-H (Malonyl-H) 对香豆酰 (p-coumaryl ) 甲基丙二酰紫苏苷 (Methylmalonyl shisonin) OH H 甲基丙二酰 (Methyl Malonyl) 对香豆酰 (p-coumaryl ) 紫苏苷(shisonin) OH H H 对香豆酰 (p-coumaryl
) 矢车菊色素苷 (Cyanin) OH H H H
下面，对于本发明的制造方法，以使用鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷作为类黄酮化合物为例来进行说明。另外，本发明并不限于此。
首先，如上所述，准备从植物中提取的粗色素成分。上述粗色素成分可以直接使用，但在形成金属络合物之前，优选对上述粗色素成分进行碱处理。通过这样的碱处理，上述粗色素成分中所含的花青苷变成脱水碱基或脱水碱基阴离子。由此可更高效地形成金属络合物。当花青苷变成脱水碱基时，上述粗色素成分的pH值优选设定为例如5-9，更优选设定为7-9。另外，在花青苷变成脱水碱基阴离子时，上述粗色素的pH值优选设定为例如9以上，更优选设定为9-12。另外，下式中表示了花青苷的结构变化的一个实例。
[化3]
花色(红) 脱水碱基(紫)
酸性 弱酸性，中性
伪碱基(无色) 脱水碱基阴离子(蓝)
弱酸性，中性 碱性
下面，如上所述，准备鸭跖黄酮苷，将鸭跖黄酮苷、上述粗色素成分和金属离子加入溶剂中并混合。此时，对鸭跖黄酮苷、粗色素成分和金属离子的添加顺序没有限制。对上述溶剂没有限制，可使用例如水(例如纯水)等，除此之外，使用含有花青苷的植物提取液本身也可以。鸭跖黄酮苷和粗色素成分分别可以是固体也可以是液体。对于上述金属离子，例如，可以在上述溶剂中直接添加可在上述液体中离子化的金属化合物，也可以添加金属已经离子化的金属化合物溶液(例如乙酸镁水溶液)。添加了鸭跖黄酮苷、粗色素成分和金属离子的混合液的pH值优选例如6-9。对温度条件没有限制，通常为能够足以避免类黄酮化合物和花青苷的分解的温度，因此优选低于50℃，例如20-30℃。通过将它们在液体中混合，瞬时形成由鸭跖黄酮苷、花青苷和金属离子生成的金属络合物。
上述液体中各成分的比例可以适当地确定，没有限制，但相对于粗色素成分中所含的的花青苷，优选足量添加鸭跖黄酮苷和金属离子。另外，在鸭跖草中形成的金属络合物鸭跖草苷中，通常花青苷和类黄酮化合物(鸭跖黄酮苷)和金属离子的摩尔比为6∶6∶2(上述非专利文献2)。相对于1mol的上述粗色素成分的花青苷，上述鸭跖黄酮苷，例如，优选1-20mol，更优选1-5mol。另外，相对于1mol的上述粗色素成分的花青苷，上述金属离子，例如，优选10-50mol，更优选10-20mol。花青苷(A)、鸭跖黄酮苷(F)和金属离子(M)的比例(A∶F∶M)为，例如，优选(A)1∶(F)1-5∶(M)5-20，更优选(A)1∶(F)1-2∶(M)5-20。另外，使用其他类黄酮化合物时，也可设定为相同的比例。
通过这样的方法可形成金属络合物，这可由后述的实施例来证明，因此，在本发明的制造方法中，无需确认是否形成了复合物。另外，金属络合物的形成可以通过例如非专利文献2中记载的方法来进行确认。即，对于上述金属络合物，通过观察可见光部分吸收光谱的长波长偏移、580nm(θ；+615,000)和668nm(θ；-480,000)的CD的激子型(exiton-type)的负Cotton效应，以及用分子筛柱色谱进行的高分子蓝色复合物的洗脱来判断。
然后，从上述液体中回收上述金属络合物。由此除去上述粗色素成分中所含的杂质。在上述步骤中形成金属络合物，该金属络合物是由特定成分(即类黄酮化合物、花青苷和金属离子)形成的复合物，即使在上述粗色素成分中含有多种杂质的情况下，这些杂质、鸭跖黄酮苷和金属离子形成金属络合物的可能性也极低。因此，通过回收该金属络合物，其他成分被除去，可以高纯度地回收含有花青苷的金属络合物。然后，如果能够回收含有目标花青苷的金属络合物，就可以容易地如下所述从上述金属络合物中解离花青苷，再将解离的花青苷与鸭跖黄酮苷和金属离子分离。因此，可以非常高效地除去粗色素成分中所含的杂质，获得高纯度的精制花青苷。另外，本发明的目的是除去粗色素成分中的杂质，如上所述，最终获得的精制花青苷成分中所含的花青苷可以包括一种，也可以包括两种以上。
从上述液体中分离金属络合物和杂质的方法没有特别的限制，例如使用乙醇沉淀法。如上所述，鸭跖草中的鸭跖草苷包含在例如乙醇沉淀的沉淀成分中。因此在本发明中，对由鸭跖黄酮苷、花青苷和金属离子形成的金属络合物也同样地进行乙醇沉淀，由此可以从该沉淀成分中回收。乙醇的添加比例没有特别的限制。可以根据例如水含量适当地确定，例如，相对于上述步骤中形成复合物的液体(以下也称为“反应液”)，乙醇为3-10倍量(体积)，优选3-6倍量(体积)。
另外，还可以通过例如凝胶过滤等分子量分级法将上述金属络合物和杂质分离。在凝胶过滤法中可使用例如凝胶过滤柱色谱，可使用已知的各种柱。具体实例有商品名Sephadex(amersham公司制造)等。
从这样回收的金属络合物中解离花青苷，由此可获得高纯度的精制花青苷。作为解离花青苷的方法，没有什么限制，例如对金属络合物进行酸处理的方法、进行加热处理的方法、进行超声波处理的方法等。另外，对金属络合物使用EDTA等螯合剂处理，从上述金属络合物中除去金属离子，从而解离花青苷的方法也是可以的。其中以酸处理为例在下文中进行说明。即使对上述金属络合物施加酸处理，鸭跖黄酮苷也是电中性的，而花青苷则带有正电荷。因此，如果利用例如阳离子交换树脂(酸性离子交换树脂)，则带有正电荷的花青苷吸附于离子交换树脂，中性的类黄酮化合物不被吸附。因此，将未被吸附的类黄酮化合物分离之后，通过使吸附有花青苷的阳离子交换树脂与酸相接触，使花青苷洗脱，结果从金属络合物中解离。这样，可以除去粗色素成分中所含的杂质，回收高纯度的精制花青苷。若采用这种方法，只通过酸处理即可解离花青苷，因此能够容易地制备精制花青苷。
另外，酸处理后的鸭跖黄酮苷、花青苷和金属离子也可以以例如下述方式进行分离。
如上所述，为了从金属络合物中解离花青苷而进行酸处理，结果鸭跖黄酮苷保持电中性状态，花青苷变成带正电荷的状态。因此，通过将含有这两者以及金属离子的混合液供给例如阳离子交换树脂，可以只回收花青苷。即，将上述混合液供给阳离子交换树脂时，带正电荷的花青苷吸附于阳离子交换树脂，而电中性的鸭跖黄酮苷则不吸附。因此，在除去未吸附的鸭跖黄酮苷之后，通过例如与盐浓度结合而使吸附的花青苷洗脱，回收该洗脱成分。这样也可将鸭跖黄酮苷和花青苷分离。
实施例
下面，对本发明的实施例结合比较例进行说明。但是，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
(1)从紫苏中提取粗色素
取红紫苏的叶2600g，在搅拌器中粉碎，在8.85L含有0.5％TFA(三氟乙酸)的50％MeOH中在4℃浸泡过夜。然后，将浸泡过的叶取出，使用2.55L含有0.5％TFA的50％MeOH、以手动螺旋(hand screw)压榨机压榨，回收提取液。将压榨后的残渣再一次在3L含有0.5％TFA的50％MeOH中在4℃浸泡过夜，同样进行压缩提取处理。将所得的提取液与先前的提取液混合(约15L左右)，使用蒸发器(evaporator)和真空泵在减压下进行浓缩干燥(115.9g)。取得到的干燥物49.58g，溶解于含1％HCl的MeOH水溶液中，过滤后，使溶液中的色素吸附于离子交换柱色谱(商品名Amberlite(注册商标)XAD-7，柱φ25mm×450mm)。然后，为了除去糖和蛋白质等极性成分，在流过1L 0.5％TFA水溶液之后，再流过1.5L含0.5％TFA的80％MeOH水溶液，使吸附的色素洗脱。将回收的洗脱液使用蒸发器在减压下浓缩干燥，并且为了除去微量水分和挥发性酸TFA，使用真空泵进一步干燥。由此获得粗色素12.3g。
(2)从鸭跖草中分离鸭跖黄酮苷
(2-1)粗鸭跖草苷的分离
取鸭跖草的蓝色花瓣的冻结物4.4kg，以手动螺旋压榨机压榨，获得3.64L蓝色的榨汁。在其中加入21L乙醇，在-20℃放置过夜，使色素成分沉淀。对其进行离心分离(商品名SCR20B，HITACHI公司制造，5000ppm，10分钟)，分离上清和沉淀，回收沉淀。将该回收的沉淀在减压下用氯化钙干燥。由此，获得蓝色固体物质粗鸭跖草苷14.5g。另外，粗鸭跖草苷的吸收光谱数据及其测定条件如下所示。
·UV光谱的测定条件
装置：日本分光公司制造。商品名V-520-SR型分光光度计
溶剂：0.05M乙酸缓冲液(pH5.6)
腔长(cell length)：1mm
·鸭跖草苷吸收光谱数据
UV-visλnm(ε)：645(66000)，590(140200)
(2-2)鸭跖黄酮苷的分离精制
将上述(2-1)中乙醇沉淀后分离的上清，使用蒸发器和真空泵在减压下进行浓缩干燥。由此得到主要含有鸭跖黄酮苷的深蓝色油状物和黄色的固体物质。将黄色的固体物质溶解于二甲亚砜，对该溶液进行HPLC分析，结果能够确认为黄酮的一种“鸭跖黄酮苷”。将该溶液与用超纯水稀释的上述深蓝色油状物混合并过滤后，使溶液中的鸭跖黄酮苷吸附于离子交换柱色谱(商品名Amberlite(注册商标)XAD-7，柱φ25mm×450mm)。首先，在上述柱中流过0.72L 1％的盐酸水溶液。由此，即使在吸附于离子交换树脂的鸭跖黄酮苷与鸭跖草来源的花青苷形成复合物的情况下，上述鸭跖草来源的花青苷也能够与鸭跖黄酮苷解离。接着，在上述柱中，按顺序流过超纯水7.5L、20％MeOH水溶液6L、30％MeOH水溶液6L、40％MeOH水溶液9L、60％MeOH水溶液3L，使吸附的鸭跖黄酮苷洗脱。鸭跖黄酮苷被确认在流过2L 20％MeOH水溶液的时间点开始洗脱。因此，从该时间点到流过5L 40％MeOH水溶液的时间点所回收的作为级分I，继而，从流过5L 40％MeOH水溶液的时间点到流过1L 60％MeOH水溶液的时间点所回收的作为级分II，继而，从流过1L 60％MeOH水溶液到流过3L 60％MeOH水溶液的时间点所回收的作为级分III。将级分I在减压下浓缩，获得干燥固体物质6.98g。从级分II和III没有获得干燥固体物质。在从上述级分I获得的干燥固体物质中加入超纯水50mL和乙腈100mL，通过加热析出鸭跖黄酮苷。将析出的鸭跖黄酮苷在减压下进行干燥，由此获得5.28g(纯度90％)鸭跖黄酮苷。另外，获得的鸭跖黄酮苷的吸收光谱数据及其测定条件如下所示。如上述非专利文献2所示，鸭跖草苷可由可见光部分吸收光谱的长波长偏移、可见光部分的强激子型的负Cotton效应来判断。
·UV光谱的测定条件
装置：日本分光公司制造。商品名V-520-SR型分光光度计
溶剂：超纯水
腔长：1mm
·鸭跖黄酮苷吸收光谱数据
UV-visλnm(ε)：326(19800)、271(22260)
(2-3)从鸭跖草残渣中分离粗色素和鸭跖黄酮苷
将上述(2-1)中获得的压榨后的残渣，在3L含0.5％TFA的50％MeOH中在4℃浸泡1个月后，将提取液和残渣分离。将该残渣再一次用3L含0.5％TFA的50％MeOH浸泡，同样进行提取，回收提取液。将该提取液和先前的提取液混合，用蒸发器和真空泵在减压下浓缩干燥(10.18g)。将该干燥物10.18g用超纯水溶解，过滤后，使溶液中的色素成分和鸭跖黄酮苷吸附于离子交换柱色谱(商品名Amberlite(注册商标)XAD-7，柱φ25mm×450mm)。然后，为了除去糖和蛋白质等极性成分，在流过4L0.5％TFA水溶液之后，再按顺序流过10％MeOH水溶液2L、30％MeOH水溶液4L、40％MeOH水溶液2L，使吸附的鸭跖黄酮苷洗脱。鸭跖黄酮苷被确认在流过30％MeOH水溶液的时间点开始洗脱，所以回收该时间点之后的洗脱液。将回收的级分在减压下浓缩，得到干燥固体物质。在该干燥固体物质中加入超纯水20mL和乙腈150mL，通过加热析出鸭跖黄酮苷。通过将析出的鸭跖黄酮苷在减压下干燥，获得0.61g鸭跖黄酮苷。接着，在洗脱鸭跖黄酮苷之后，在上述离子交换柱中流过1.5L含0.5％TFA的80％MeOH水溶液，使吸附的色素成分洗脱。将回收的洗脱液使用蒸发器在减压下浓缩干燥，并且为了除去微量水分和挥发性酸TFA，进一步通过真空泵干燥。由此，获得鸭跖草的粗色素0.82g。
(3)紫苏来源的花青苷和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷的复合物形成
在由上述(1)制备的紫苏来源的粗色素(干燥物)3mg中加入超纯水1mL，以0.5N氨水1mL中和后，在减压下浓缩干燥。另外，通过中和，紫苏来源的粗色素中所含的花青苷转化为无水碱型。在该干燥物中加入超纯水50μL以及将3mg由上述(2-2)制备的鸭跖黄酮苷溶解于50μL水中形成的鸭跖黄酮苷溶液，再加入0.5M乙酸镁水溶液25μL。该混合液在混合后瞬时变为蓝色。将该混合液在减压下浓缩，使混合液中的复合物吸附于凝胶过滤柱色谱(商品名sephadexG-10，柱φ10mm×150mm)，用水洗脱，从而进行纯化。然后，回收深蓝色洗脱成分作为含有复合物的成分。另外，对于含有紫苏来源的花青苷和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷的复合物的形成，与上述鸭跖草苷一样，通过可见光部分吸收光谱的长波长偏移、可见光部分的强激子型的负Cotton效应来判断。
确认了紫苏来源的花青苷和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷的复合物的收率。首先，将复合物形成中使用的粗色素溶解于含1％TFA的MeOH中，进行吸光度测定。另一方面，在形成的复合物中，以与上述粗色素相同的稀释倍数添加含1％TFA的MeOH。然后，对该溶液超声波处理10分钟，从上述复合物中解离紫苏来源的花青苷，然后进行吸光度测定。然后，将复合物的吸光度(C)占粗色素的吸光度(P)的比例值的百分率(100×C/P)作为复合物的收率(％)。结果，粗色素的吸光度(P)为0.514，复合物的吸光度(C)为0.144，因此收率(100×C/P)为“约28.02％”。
·UV光谱测定条件
装置：日本分光公司制造。商品名V-520-SR型分光光度计
溶剂：含1％TFA的MeOH
腔长：1mm
波长：529nm(粗色素)、529nm(复合物)
如上确认了复合物的形成，所以可知即使使用含有杂质的粗色素，也可形成花青苷和鸭跖黄酮苷的复合物，通过解离花青苷，可纯化花青苷。另外，已知红紫苏的叶中至少含有4种花青苷。由此可知即使使用含有2种以上花青苷的粗色素，也可形成花青苷和鸭跖黄酮苷的复合物。从该结果可知，根据本发明，在以例如红紫苏的叶作为原料的情况下，仅仅通过形成复合物(金属络合物)就可以纯化花青苷。
另外，紫苏来源的花青苷和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷的复合物，与鸭跖草来源的花青苷和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷的复合物相比，呈现出偏紫的蓝色。认为这是由于前一种复合物与后一种复合物相比，可见光区的极大吸收波长向短波长侧偏移。据推测这是因为，紫苏来源的花青苷的母核是花青素，与之相反，鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷中本来所含的鸭跖草来源的花青苷的母核是翠雀素。
(4)复合物的构成成分分析
下面确认鸭跖黄酮苷是否与各种花青苷形成复合物。如上所述，在红紫苏的叶中至少含有紫苏苷(S)、丙二酰紫苏苷(MS)、(甲基丙二酰)紫苏苷(MMS)和矢车菊色素苷(C)。因此，确认了各种花青苷以什么样的组成比与鸭跖黄酮苷形成复合物。
对在上述(3)中使用的粗色素和上述(3)中形成的复合物，通过下述条件进行HPLC分析。结果如图1和图2所示。图1表示粗色素的HPLC色谱图，图2表示复合物的HPLC色谱图。另外，如下述HPLC条件所示，流动相A和B是酸性溶剂，所以通过将复合物供给HPLC，花青苷从上述复合物解离。因此，图2中的峰，直接地说，是解离的花青苷的峰，但间接地说，是含有各自花青苷的复合物的峰。即，从图2的峰可求得吸纳了各花青苷的复合物的量以及各复合物的比例等(下同)。
如图1的上段所示，在粗色素的色谱图中，在紫外部(280nm)发现有杂质(例如蛋白质、有机酸、花青苷以外的类黄酮化合物类、高分子化的多酚类等)的峰，而如图2的上段所示，在复合物的色谱图中，仅仅检测到鸭跖黄酮苷和微量不纯物的峰。从该事实可知，粗色素中所含的几乎所有杂质，特别是以前导致问题的、花青苷以外的类黄酮化合物类和高分子化的多酚类，都是无法形成复合物的物质，在复合物的形成中不被使用，通过上述柱色谱被除去。
·HPLC分析条件
送液泵：JASCO公司制造，商品名PU-980×2
检测器：JASCO公司制造，商品名MD2010Plus光电二极管阵列检测器
柱：商品名Develosil ODS-HG-5 250mm×4.6mm
流动相A：乙酸∶乙腈∶水∶磷酸＝2∶2.5∶94∶1.5
流动相B：乙酸∶乙腈∶水∶磷酸＝20∶25∶53.5∶1.5
样品注入量：10μL
流速：1mL/min
柱温度：40℃
表2：
梯度时间程序
时间(分) 流动相A 流动相B
0 100 0
5 100 0
25 0 100
30 0 100
31 100 0
然后，对于粗色素，由540nm色谱图求出各花青苷(S、MS、MMS和C)的峰面积的比例(％)，将其作为粗色素中各花青苷的组成比例(％)。并且，将紫苏苷(S)的峰面积比例(％)作为1，分别求出其他花青苷的峰面积比例。另一方面，对于在上述(3)中形成的复合物，也从540nm色谱图中求出复合物中所含的各花青苷的峰面积比例(％)，将其作为含有各花青苷的复合物的组成比例(％)。并且，对于复合物，也将S的峰面积比例(％)作为1，求出其他花青苷的峰面积比例。该结果示于下表中。另外，复合物的形成进行3次，求出平均值和标准差。
表3：
比例(％) 峰面积比 <粗色素> S MS MMS C 15.24±0.08 72.64±0.57 3.88±0.11 8.24±0.60 1 4.77±0.06 0.26±0.01 0.54±0.04 <复合物> S MS MMS C 15.59±0.11 70.57±0.64 5.37±0.64 8.80±0.58 1 4.63±0.25 0.35±0.06 8.80±0.58
如上述表3所示，确认了在粗色素中，以上述比例含有作为主成分的S、MS、MMS和C花青苷。并且确认了对于复合物，也分别以上述比例形成了含有S、MS、MMS和C花青苷的复合物。从该结果可知，即使在如上述粗色素那样存在多种花青苷的情况下，也可形成花青苷和鸭跖黄酮苷的复合物，并且鸭跖黄酮苷可与各种花青苷形成复合物。另外，在本实施例中，为了从红紫苏的叶的提取物中除去蛋白质等极性成分而用Amberlite进行处理，但是已经确认，不进行该处理的粗色素也可同样地形成复合物，通过复合物的形成可纯化花青苷。
实施例2
如上述实施例1所示，已知即使在存在多种花青苷的情况下，也可形成各种花青苷和鸭跖黄酮苷的复合物。因此，通过改变粗色素中的花青苷的组成比，确认复合物形成时的各种花青苷的选择性。
(1)粗色素的制备
(1-1)粗色素的酸水解
取上述实施例1中制备的紫苏粗色素20.6g，溶解于含1％HCl的MeOH水溶液中，通过HPLC观察水解反应，同时在室温下放置2天，从上述粗色素中所含的丙二酰紫苏苷中除去丙二酸，转化成紫苏苷。该反应液在减压下浓缩干燥，并且为了除去微量水分和挥发性酸HCl，进一步通过真空泵干燥。由此获得以紫苏苷为主成分的粗色素13.45g。将其称作粗色素A。另外，取上述实施例中制备的紫苏粗色素2.0g，溶解于含3％HCl的MeOH水溶液中，通过HPLC观察水解反应，同时在室温下放置1天，从上述粗色素中所含的丙二酰紫苏苷中除去丙二酸，转化成紫苏苷。将该反应液在减压下浓缩干燥，并且为了除去微量水分和挥发性酸HCl，进一步通过真空泵干燥。由此获得以紫苏苷为主成分的粗色素1.7g。将其称为粗色素B。
(1-2)粗色素的配合调整
将上述酸水解处理得到的上述粗色素A和上述粗色素B与上述实施例1中制备的粗色素混合，制备组成不同的粗色素。将上述组成比设定为，紫苏苷(S)和丙二酰紫苏苷(MS)之比(物质的量之比S∶MS)为规定比例(1∶0.25、1∶0.4、1∶0.49、1∶2.42、1∶3.71、1∶4.31)。另外，对于组成比，进行HPLC分析，从MS和S的峰面积比来确认。
(2)复合物的构成成分分析
与上述实施例1之(3)同样地，形成复合物，通过柱色谱进行纯化。然后，与上述实施例1之(4)同样地，对含有复合物的成分进行HPLC分析，对于各种组成的粗色素和复合物，求出峰面积的比例(％)以及将紫苏苷(S)的峰面积比例(％)设定为1时的峰面积比例。对于各种花青苷，进一步求出复合物形成前的粗色素的峰面积比(B)与复合物形成后的复合物的峰面积(A)的比(前后比A/B)。前后比A/B是指该花青苷被选择性吸纳进复合物的相对大小程度。另外，复合物的形成进行3次，求出平均值和标准差。这些结果示于下表中。
表4：
S∶MS＝1∶0.25
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 57.20±0.10 14.39±0.01 16.68±0.10 11.72±0.01 1 0.25±0.00 0.29±0.00 0.20±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 42.49±1.19 22.06±1.40 24.44±2.57 14.68±1.58 1 0.52±0.02 0.57±0.05 0.35±0.03 1 2.08 1.97 1.75
表5：
S∶MS＝1∶0.4
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 51.22±0.35 20.22±0.07 18.27±0.08 10.46±0.07 1 0.40±0.00 0.36±0.00 0.21±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 35.43±3.11 31.74±1.23 20.43±2.35 12.39±6.01 1 0.90±0.05 0.58±0.04 0.36±0.19 1 2.25 1.61 1.71
表6：
S∶MS＝1∶0.49
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 48.00±0.28 23.53±0.09 19.31±0.39 9.36±0.16 1 0.49±0.00 0.41±0.01 0.19±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 32.87±5.54 34.80±1.63 15.12±0.91 17.18±4.66 1 1.08±0.23 0.47±0.08 0.55±0.22 1 2.20 1.15 2.89
表7：
S∶MS＝1∶2.42
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 23.98±0.09 58.12±0.61 7.73±0.10 10.17±0.58 1 2.42±0.03 0.32±0.00 0.42±0.02 - - - - <复合物> S MS MMS C 17.33±0.07 63.55±0.99 7.97±0.55 11.15±0.38 1 63.55±0.99 7.97±0.55 11.15±0.38 1 1.52 1.44 1.52
表8：
S∶MS＝1∶3.71
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 17.73±0.02 65.64±0.03 5.74±0.03 10.90±0.02 1 3.71±0.00 0.32±0.00 0.62±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 14.92±0.26 68.71±0.41 5.63±0.06 10.75±0.21 1 4.61±0.11 0.38±0.01 0.72±0.00 1 1.24 1.19 1.16
表9：
S∶MS＝1∶4.31
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 15.35±0.02 66.22±0.03 6.20±0.00 12.23±0.04 1 4.31±0.00 0.40±0.00 0.80±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 11.94±0.51 70.42±1.08 5.23±1.62 12.37±0.79 1 5.90±0.25 0.44±0.17 1.04±0.03 1 1.37 1.1 1.3
如上述表4-9所示，丙二酰紫苏苷(MS)的前后比(A/B)的值大于紫苏苷(S)的前后比(1)。例如，在表4(S∶MS＝1∶0.25)中，粗色素中，MS是S的0.25倍量，而复合物中，MS增加到S的2.08倍量。同样地，在表5(S∶MS＝1∶0.4)中，粗色素中，MS是S的0.4倍量，而复合物中，增加到2.25倍；在表6(S∶MS＝1∶0.49)中，粗色素中，MS是S的0.49倍量，而复合物中，增加到2.20倍。由该事实可知，丙二酰紫苏苷比紫苏苷在形成复合物的过程中更多地被选择性吸纳。从该结果，可以说，在复合物形成时，周围存在的花青苷并不是没有选择性地吸纳进复合物中，而是有选择性地吸纳花青苷。更详细地说，可知由于花青苷的结构不同，被吸纳进复合物的速度也不同，在MS和S中，MS被选择性地吸纳。
实施例3
在上述实施例2中确认了花青苷的选择性，但是在上述实施例2中，含有各种花青苷的粗色素和鸭跖草来源的鸭跖黄酮苷被等量(重量比1∶1)地使用。在花青苷或者鸭跖黄酮苷过量存在的情况下，花青苷和鸭跖黄酮苷的碰撞几率不同，所以要考虑对选择性可能造成的影响。所以，在花青苷或者鸭跖黄酮苷过量存在的条件下，确认花青苷的选择性。
除了粗色素和鸭跖黄酮苷的使用量按以下改变以外，与上述实施例2同样地形成复合物，以及通过HPLC分析对构成成分进行分析。作为花青苷和鸭跖黄酮苷的重量比为1∶1的等量条件，使用粗色素3mg、鸭跖黄酮苷3mg。作为鸭跖黄酮苷过量的条件，使用粗色素2mg、鸭跖黄酮苷8mg。作为花青苷过量的条件，使用粗色素8mg、鸭跖黄酮苷2.7mg。另外，使用与上述实施例1相同的粗色素和鸭跖黄酮苷。该结果示于下表。
表10：
花青苷∶鸭跖黄酮苷＝1∶1(重量比)
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 15.35±0.02 66.22±0.03 6.20±0.00 12.23±0.04 1 4.31±0.00 0.40±0.00 0.80±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 11.94±0.51 70.42±1.08 5.23±1.62 12.37±0.79 1 5.90±0.25 0.44±0.17 1.04±0.03 1 1.37 1.1 1.3
表11：
花青苷∶鸭跖黄酮苷＝1∶4(重量比)
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 15.35±0.02 66.22±0.03 6.20±0.00 12.23±0.04 1 4.31±0.00 0.40±0.00 0.80±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 13.71±0.03 63.42±0.24 9.89±0.06 13.03±0.10 1 4.62±0.02 0.72±0.00 0.95±0.01 1 1.07 1.8 1.12
表12：
花青苷∶鸭跖黄酮苷＝2.96∶1(重量比)
比例 (％) 峰面积比 前后比 A/B <粗色素> S MS MMS C 15.35±0.02 66.22±0.03 6.20±0.00 12.23±0.04 1 4.31±0.00 0.40±0.00 0.80±0.00 - - - - <复合物> S MS MMS C 12.25±0.01 68.13±0.03 7.38±0.01 12.23±0.02 1 5.56±0.01 0.60±0.00 1.00±0.00 1 1.29 1.5 1.25
在鸭跖黄酮苷过量的条件下(表11)，丙二酰紫苏苷(MS)和矢车菊色素苷(C)的前后比分别为1.07和1.12，该结果与等量条件下(表10)的丙二酰紫苏苷(MS)和矢车菊色素苷(C)的前后比1.37和1.3相比变低，即，表示在复合物的形成前后，构成成分的变化较小。在鸭跖黄酮苷过量的条件下，与等量条件相比较，鸭跖黄酮苷比花青苷过量地存在，所以认为两者的碰撞几率提高，丙二酰紫苏苷(MS)和矢车菊色素苷(C)的选择性之差变小。另一方面，在花青苷过量的条件下(表12)，丙二酰紫苏苷(MS)和矢车菊色素苷(C)的前后比分别为1.29和1.25。该结果是与等量条件(表10)的丙二酰紫苏苷(MS)和矢车菊色素苷(C)的前后比1.37和1.3等同的值，没有大的差别。该条件下，花青苷为鸭跖黄酮苷的3倍量存在，但与等量条件具有同等程度的结果，所以可知花青苷的量对花青苷的选择性没有影响。
实施例4
将粗色素中所含的4种花青苷分离，确认任意两成分之间的被复合物吸纳的选择性。
(1)花青苷的分离
使用中压液体色谱仪，从由实施例1制备的粗色素中分别分离丙二酰紫苏苷(MS)、紫苏苷(S)、矢车菊色素苷(C)、(甲基丙二酰)紫苏苷(MMS)。首先，为了更好地分离花青苷，将以下所示的100％原液(流动相溶液)100mL、20％原液(将100％原液用0.5％TFA水溶液稀释，下同)100mL按顺序在流速2mL/min的条件下预先流过上述柱内30分钟以上。将由实施例1制备的粗色素1g溶解于20％原液，使粗色素吸附于上述玻璃柱的前端。然后，继续这样流过20％原液，在色素移动到上述玻璃柱的2/3处的时间点，变换为30％原液(100％原液用0.5％TFA水溶液稀释)。之后，在流过30％原液的同时分别取出洗脱液，由目视确认回收色素浓度高的级分(200mL/级分)。紧接着，使溶剂以60％原液、80％原液、100％原液的顺序流过，同样地分别取出洗脱液，并且回收色素浓度高的级分。结果由40％原液回收了5个级分、由60％原液回收了3个级分、由80％原液回收了1个级分，共计9个级分。反复进行该操作，进行了共计7g粗色素的分别取出。
·MPLC条件
送液泵：日本分光公司制造，商品名PU-980
柱：商品名ODS Develosil 10-20μm玻璃柱300×25mm i.d.
流动相溶液：乙酸∶乙腈∶水∶三氟乙酸＝20∶2.5∶54.5∶0.5作为100％原液。
MPLC分别取出的结果，获得了矢车菊色素苷(Cy3，5-diglc)72mg、紫苏苷(Cy3-pc·glc-5-glc)76mg、丙二酰紫苏苷(Cy3-pc·glc-5-Ma·glc)90mg、(甲基丙二酰)紫苏苷(Cy3-pc·glc-5-Methoxy Ma·glc)44mg。另外，丙二酰紫苏苷的纯度为20％，紫苏苷的纯度为65％。
·UV光谱测定条件
装置：日本分光公司制造，商品名V-520-SR型分光光度计
溶剂：含0.1％HCl的MeOH
腔长：1mm
·丙二酰紫苏苷吸收光谱数据
UV-visλnm(ε)：529(5640)、313.4(3200)、292.5(3580)
·紫苏苷吸收光谱数据
UV-visλnm(ε)：527(13360)、313.4(9560)、292.5(10760)
(2)花青苷的两种成分的组合
在下述组合中，两种成分以物质的量相当的方式混合，制备花青苷混合物1和2。
花青苷混合物1：MS/MMS
花青苷混合物2：S/MMS
(3)复合物的构成成分分析
除了使用2种花青苷的混合物(1-2)代替粗色素以外，其他与上述实施例2相同，形成复合物并且通过HPLC分析进行构成成分的分析。结果显示于下表中。
表13：
花青苷混合物1(MS/MMS)
比例 (％) 前后比 A/B <混合物> MS MMS 37.45±0.52 62.55±0.52 - - <复合物> MS MMS 52.51±0.24 47.49±0.24 1.40 0.76
表14：
花青苷混合物2(S/MMS)
比例 (％) 前后比 A/B <混合物> S MMS 46.20±0.82 53.80±0.82 - - <复合物> S MMS 50.42±0.06 49.58±0.06 1.10 0.92
如上述表13所示，在使用花青苷混合物1(MS/MMS)的系统中，前后比的结果为MS1.4倍、MMS0.76倍，所以可以说MS比MMS具有更高的选择性(MS＞＞MMS)。如上述表14所示，在使用花青苷混合物2(S/MMS)的系统中，前后比的结果为S1.10倍、MMS0.92倍，所以可以说S的选择性略高于MMS(S＞MMS)。
以上结果表明，就花青苷在形成复合物时的选择性来说，S和MMS之间没有显著差异，而MS的选择性特别地高另外，在丙二酰紫苏苷(MS)和紫苏苷(S)中，从其结构考虑，认为丙二酰紫苏苷的结构稳定性更加优良。因此，根据本实施例的结果可推测在复合物形成中，复合物的稳定性和花青苷的选择性具有相关关系。
实施例5
自然界中鸭跖草来源的鸭跖草苷是花青苷(丙二酰鸭跖草花色苷)、黄酮(鸭跖黄酮苷)和镁(镁离子)以6∶6∶2的比例构成的金属络合物。因此，在复合物的形成中，改变镁相对于花青苷的量，确认了它对花青苷的选择性的影响。
使用上述实施例4中分离的丙二酰紫苏苷(MS)和紫苏苷(S)，制备如下所示的花青苷混合物。另外，由于MS和S不是100％的精制物，所以两者的比例以物质的量比表示。
·花青苷混合物
组成MS∶S＝0.4∶1(物质的量之比)
MS＝1mg
S＝1mg
并且，使用上述花青苷混合物代替粗色素，将花青苷混合物和鸭跖黄酮苷的添加量(3mg∶3mg)变为下述量，将乙酸镁水溶液的添加量变为下述规定量，除此以外，与上述实施例1同样地进行复合物的形成。
·花青苷混合物的物质的量
1.1μmol(S＝1mg、MS＝1mg)
·鸭跖黄酮苷的物质的量
1.1μmol(1.5mg)
·0.5乙酸镁水溶液的添加量
0.72μL(0.36μmol)、
5μL(2.5μmol)
25μL(12.5μmol)
100μL(50μmol)
125μL(62.5μmol)
并且，对花青苷混合物和所形成的复合物，分别与上述实施例1同样地进行吸光度测定，求出收率(100×C/P)。另外，与实施例2同样地进行复合物的HPLC分析。结果显示于下表。
表15：
对花青苷的物 质的量之比*1 峰面 积比*2 前后比*3 A/B 吸光度 (abs) 收率 (％) <混合物> S MS - - 1 0.40 - - 0.603 (混合物) - <复合物> Mg2+(μml) 0.36 2.50 12.5 50.0 62.5 0.33 2.27 11.36 45.46 56.82 1.27 1.30 0.99 0.62 0.57 3.18 3.25 2.48 1.55 1.43 0.088 0.087 0.110 0.141 0.145 14.59 14.43 18.24 23.38 24.05
*1将花青苷混合物的物质的量作为1时的Mg2+的物质的量之比
*2将花青苷混合物中的紫苏苷的峰面积(％)作为1，求出花青苷混合物中的MS、以及各复合物中的MS的峰面积的比例，作为峰面积比。
*3对于MS，求出复合物形成前的花青苷混合物中MS峰面积比(B)与复合物形成后的复合物(MS)的峰面积(A)的比例，作为前后比(A/B)。
另外，将Mg2+相对于混合花青苷的摩尔比(物质的量之比)与丙二酰紫苏苷的前后比绘成曲线图，显示在图3中。
如上述表以及图3所示，在镁是花青苷(花青苷混合物)的1/3当量(对花青苷的物质的量之比为0.33)的条件下，MS在复合物形成前后增加为3.18倍(前后比A/B)。并且，随着镁相对于花青苷的量增加，在复合物形成前后MS的比例(A/B)减小，具体地说，在镁是蛋白质的56.82当量(对花青苷的物质的量之比为56.82)的条件下，MS在复合物形成前后减少至1.43倍。由该结果可知，镁相对于花青苷的物质的量越小，吸纳MS的复合物的增加率越高，镁相对于花青苷的物质的量越大，上述增加率就越低。因此，若在复合物形成中调整镁的量，就可以控制例如紫苏苷和丙二酰紫苏苷的组成，因此在花青苷的精制中，可获得选择性提取复合物中所含的紫苏花青苷的效果。特别是，丙二酰基遇酸不稳定，所以在相对于丙二酰紫苏苷选择性分离紫苏苷时非常有用。
实施例6
在复合物的形成中，改变鸭跖黄酮苷相对于花青苷的量，确认了它对花青苷的选择性的影响。另外，使镁离子过量。
除了变成以下所示的条件之外，其余与上述实施例1相同，与下述同样地进行复合物的形成。
表16：
<条件1>
·花青苷混合物
组成MS∶S＝0.4∶1(物质的量之比)
MS＝1mg
S＝1mg
物质的量1.1μmol
·鸭跖黄酮苷
添加量0.75mg (1.12μmol)
1.5mg (2.23μmol)
3.0mg (4.46μmol)
7.5mg (11.2μmol)
·0.5乙酸镁水溶液
添加量100μL(50μmol)
<条件2>
·花青苷混合物
组成MS∶S＝5.44∶1(物质的量之比)
MS＝0.1mg
S＝3mg
物质的量0.83μmol
·鸭跖黄酮苷
添加量0.56mg (0.83μmol)
1.12mg (1.65μmol)
2.24mg (3.30μmol)
5.6mg (8.25μmol)
·0.5乙酸镁水溶液
添加量100μL(50μmol)
并且，对花青苷混合物和所形成的复合物，分别与上述实施例1同样地进行吸光度测定，求出收率(100×C/P)。另外，与实施例2同样地进行复合物的HPLC分析。结果显示于下表17和18。表17是上述条件1的复合物的结果，表18是上述条件2的复合物的结果。
表17：
<条件1>MS∶S＝0.40∶1
对花青苷的物 质的量之比*1 峰面 积比*2 前后比*3 A/B 吸光度 (abs) 收率 (％) <混合物> S MS - - 1 0.40 - - 0.603 (混合物) - <复合物> F*4(μmol) 1.12 2.23 4.46 11.2 1.02 2.03 4.05 10.18 0.56 0.62 0.64 0.52 1.40 1.55 1.60 1.30 0.176 0.141 0.259 0.261 29.19 23.38 42.95 43.28
*1将花青苷混合物的物质的量作为1时的鸭跖黄酮苷的物质的量之比
*2将花青苷混合物中的紫苏苷的峰面积(％)作为1，求出花青苷混合物中的MS、以及各复合物中的MS的峰面积的比例，作为峰面积比。
*3对于MS，求出复合物形成前的花青苷混合物中MS峰面积比(B)与复合物形成后的复合物(MS)的峰面积(A)的比例，作为前后比(A/B)。
*4鸭跖黄酮苷
表18：
<条件2>MS∶S＝5.44∶1
对花青苷的物 质的量之比*1 峰面 积比*2 前后比*3 A/B 吸光度 (abs) 收率 (％) <混合物> S MS - - 1 5.44 - - 0.535 (混合物) - <复合物> F*4(μmol) 0.83 1.65 3.30 8.25 1.00 2.00 4.00 10.00 5.82 5.36 5.59 5.53 1.08 0.98 1.03 1.02 0.292 0.237 0.295 0.3 54.58 44.30 55.14 57.01
*1将花青苷混合物的物质的量作为1时的鸭跖黄酮苷的物质的量之比
*2将花青苷混合物中的紫苏苷的峰面积(％)作为1，求出花青苷混合物中的MS、以及各复合物中的MS的峰面积的比例，作为峰面积比。
*3对于MS，求出复合物形成前的花青苷混合物中MS峰面积比(B)与复合物形成后的复合物(MS)的峰面积(A)的比例，作为前后比(A/B)。
*4鸭跖黄酮苷
如上述表17所示，使用花青苷混合物(MS∶S＝0.40∶1)、改变鸭跖黄酮苷的量时，不管鸭跖黄酮苷的量如何，MS的复合物形成前后的增加率(A/B)均为1.5左右。另外，如上述表18所示，使用花青苷混合物(MS∶S＝5.44∶1)、改变鸭跖黄酮苷的量时，不管鸭跖黄酮苷的量如何，MS的复合物形成前后的增加率(A/B)均为约1倍，组成上几乎没有变化。从这些结果可知，在镁过量的条件下，鸭跖黄酮苷的量对花青苷的选择性没有特别的影响。
另外，在本实施例中，镁相对于花青苷混合物使用45当量，是镁过量的条件，鸭跖黄酮苷也使用相对于花青苷的1当量至10当量的过剩量。因此，在理论上可以说是所有的花青苷均可用于复合物形成的条件。但是，在条件1(MS∶S＝0.40∶1)中，并非所有的花青苷都被吸纳，如上所述，在复合物形成后，MS的组成比增加了1.5倍左右。另一方面，在条件2(MS∶S＝5.44∶1)中，花青苷混合物和复合物中的MS的组成比几乎没有变化。另外，在条件1(MS∶S＝0.40∶1)中，复合物的最大收率为57.01％，与之相比，在条件2(MS∶S＝5.44∶1)中，复合物的最大收率为43.28％，与上述条件1相比降低了约14％。从以上几点可以认为，在复合物形成中，即使是如条件1一样MS的组成比低的粗色素原料(花青苷混合物)，选择性高的MS也会比S更优先地吸纳，所以在复合物形成后的MS的比例增加，但是复合物的收率却降低。
实施例7
在实施例1-6中使用了鸭跖黄酮苷，下面使用其他黄酮来确认复合物的形成。
首先，准备紫苏粗色素的TFA盐。紫苏粗色素的TFA盐是将由实施例1(1)的方法提取的红紫苏叶的色素提取液进行干燥而获得的盐，不通过柱色谱进行纯化。另一方面，使用芹菜素7-葡糖苷(Funakoshi公司制造)作为黄酮。
然后，取上述紫苏粗色素TFA盐约9mg，溶解于150μL超纯水中，在该溶液中加入1mL 0.5M氨水溶液，立即在减压下浓缩干燥。向其中以固体本身的形式加入量取的10μmol上述芹菜素7-葡糖苷。然后加入含有0.5M乙酸镁的50％乙醇水溶液600μL(300μmol)。将其通过适当的超声波溶解，浓缩干燥，冷冻保存直至分析时。然后将冷冻保存的样品溶解于最小量的超纯水中，吸附于sephadexG-10(商品名)凝胶过滤柱色谱(0.8-1.0cm×10.5-11.5cm)，流过超纯水。然后，分别取出sephadexG-10中最早洗脱、色素浓度最高的2个级分。结果，在Shephadex中的洗脱时间早的级分中，有色素和芹菜素7-葡糖苷被洗脱的级分。通过加入乙醇，它显示出色素和该黄酮的共沉淀。即，确认了可由芹菜素7-葡糖苷纯化紫苏来源的花青苷。
进一步，为替代芹菜素7-葡糖苷，分别使用鸭跖黄酮苷、柑橘来源的黄酮——橙皮苷(hesperidin)、地奥司明(diosmin)、柑橘来源的黄酮——柚皮素7-葡糖苷(naringenin 7-glucoside)、荞麦来源的黄酮——芦丁(rutin)、芹菜素、芹菜素7-o-新橙皮糖苷、西利马林(silymarin)、橄榄来源的黄酮——藤黄菌素7-葡糖苷(均由Funakoshi公司制造)，除此之外，进行与实施例7相同的操作。结果确认了各种黄酮与紫苏来源的花青苷的共沉淀。
产业上的利用可能性
根据本发明的精制花青苷的制造方法，可方便且容易地从上述粗色素成分中纯化花青苷，并能够进一步提供低成本、高纯度的精制花青苷。因此可以说，本发明在包括例如食品领域等的利用天然色素的所有领域中，都是极其有用的技术。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种精制花青苷的制造方法，该方法从含有花青苷的粗色素成分中纯化精制花青苷，其特征在于，包括下述步骤(A)-(D)：
(A)准备一种类黄酮化合物，该类黄酮化合物可与碱土金属和重金属中至少一种的金属离子以及花青苷一起形成金属络合物；
(B)在碱土金属和重金属中至少一种的金属离子的存在下，在液体中，使上述粗色素成分和上述类黄酮化合物相接触，形成含有上述花青苷、上述类黄酮化合物和上述金属离子的金属络合物；
(C)从上述液体中回收上述金属络合物；
(D)从上述金属络合物中解离花青苷。
2.权利要求1所述的制造方法，其中，所述类黄酮化合物是从鸭跖草来源的黄酮、矢车菊来源的黄酮、绿绒蒿来源的黄酮醇以及蓝色鼠尾草来源的黄酮中选出的至少一种黄酮类。
3.权利要求1所述的制造方法，其中，所述类黄酮化合物是从鸭跖黄酮苷、芹菜素7，4’-二葡糖苷、芹菜素4’-(6-O-丙二酰葡萄糖苷)-7-葡糖苷酸、黄酮醇3-龙胆二糖和黄酮醇3-(6-O-葡糖基-b-O-半乳糖苷)中选出的至少一种。
4.权利要求1所述的制造方法，其中所述粗色素中所含的花青苷为两种以上花青苷。
5.权利要求1所述的制造方法，其中，所述花青苷是从在B环上具有2个以上OH基的芍药花青素类糖苷花青苷、翠雀素类糖苷花青苷、矮牵牛素类糖苷花青苷以及翠雀素类糖苷花青苷中选出的至少一种花青苷。
6.权利要求1所述的制造方法，其中，所述粗色素成分是从植物中提取的含有花青苷的粗色素成分，所述植物为从紫苏、红甘蓝、葡萄、黑玉米、红萝卜、浆果类、豆类、薯类、谷类、紫洋葱、橄榄和苹果中选出的至少一种植物。
7.权利要求1所述的制造方法，其中，所述碱土金属离子为镁离子。
8.权利要求1所述的制造方法，其中，所述重金属离子是从锌、镍、镉、铁、钴、铝、铜、锰、铬和锡中选出的至少一种金属离子。
9.权利要求1所述的制造方法，其中，在所述(B)步骤之前包括下述步骤：对所述粗色素成分进行碱处理，使所述粗色素成分中所含的花青苷转化为无水碱或无水碱阴离子。
10.权利要求1所述的制造方法，其中，在所述(C)步骤中，通过乙醇沉淀法或者分子量分级法从所述液体中回收所述金属络合物。
11.权利要求10所述的制造方法，其中，在所述(C)步骤中，所述分子量分级法为过滤法。
12.权利要求1所述的制造方法，其中，在所述(D)步骤中，对所述金属络合物施加从酸处理、加热处理和超声波处理中选出的至少一种处理，从所述金属络合物中解离花青苷。
13.权利要求1所述的制造方法，其中，在所述(D)步骤中，对所述金属络合物施加酸处理，从所述金属络合物中解离花青苷，在所述(D)步骤之后，将通过所述(D)步骤中的酸处理获得的包含带正电荷的花青苷、电中性的类黄酮化合物和所述金属离子的混合物供至阳离子交换树脂，吸附所述花青苷，除去所述类黄酮化合物，然后将所述吸附的花青苷洗脱。