一种不溶性葡聚糖的制备方法 【技术领域】
本发明涉及不溶性β葡聚糖的制备，具体说是一种用酶碱法生产以β-1，3-D为主链、β-1，6-D为侧链的不溶性葡聚糖的方法。
背景技术
葡聚糖有多种不同的类型，其中最广为人知的是纤维素和淀粉。葡萄糖分子键合方式的改变会影响整个葡聚糖分子的立体结构，物理性能以及生物学功能。葡聚糖是一个葡萄糖分子的碳-1与另一个葡萄糖分子的碳-2、碳-3、碳-4、碳-6以a-或β-糖苷键结合的聚葡萄糖分子。β-葡聚糖最常见有β-1，3、β-1，4、β-1，6这3种构型。以β-1，3为主链，β-1，6为侧链的葡聚糖被认为是免疫活性最强而且最易被人体吸收的葡聚糖构型。
β-D-葡聚糖的生物学功能已受到广泛的关注。β-D-葡聚糖具有抗癌、抗肿瘤作用；能抵抗病毒、真菌、细菌等引起的感染，提高抗病力；具有免疫增强和抗辐射作用，是有效的口服免疫增强剂；有清除自由基和抗氧化作用；作为膳食纤维能促进肠内有害物的排泄，对霉菌毒素等有很好的吸附作用。
β-D-葡聚糖存在于许多细菌、真菌和高等植物中，它的一个主要来源是酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母是一种重要食品和工业微生物，在其细胞壁上存在大量的以β-1，3-D为主链、β-1，6-D为侧链的不溶性葡聚糖。这种葡聚糖具有抗肿瘤、抗辐射、抗真菌、降血脂、抗感染性疾病等生物学功能，
酵母细胞壁外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，在分离制备碱不溶性葡聚糖时，如何除去其中的蛋白和甘露聚糖是一个关键点。目前国内外报道的葡聚糖制备工艺多采用碱法、酸碱法或者酸碱与有机溶剂结合的方法。酸法提取是最早采用的酵母β-1，3-葡聚糖提取方法，此法虽然产品的得率较高，但纯度较低，产品中的蛋白质和甘露糖的含量较高，需要进一步的纯化，由于此方法提取的产品纯度低，其应用也受到一定的限制。
近年来，研究者主要采用酸碱结合的方法对葡聚糖进行纯化，此方法快速高效，但提取条件剧烈，酸碱试剂易腐蚀设备、对环境污染严重，同时在提取的过程中会造成部分β-1，3-葡聚糖的降解，使产品的得率和生物活性降低。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种以β-1，3-D为主链、β-1，6-D为侧链的不溶性葡聚糖的制备方法。本发明方法操作简单，可获得高纯度的β-1，3/1，6-葡聚糖。
本发明所提供的以β-1，3-D为主链、β-1，6-D为侧链的不溶性葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：
1)酶处理：将1-5g酵母来源的葡聚糖粗品悬浮于100ml pH8.0-10的磷酸缓冲液中，在40-60℃下加入Alcalase蛋白酶水解，离心，收集沉淀；
2)醇处理：将步骤1)得到的沉淀加无水乙醇搅拌后抽滤，真空干燥；
3)碱处理：将步骤2)得到的产物在质量分数浓度为1％-3％的NaOH溶液中，在60-100℃下搅拌3-8小时，离心收集沉淀；
4)醇处理：碱处理后离心得到的沉淀用无水乙醇搅拌洗涤，抽滤、真空干燥后得到水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。本发明方法操作简单，可获得高纯度的β-1，3/1，6-葡聚糖。
所述步骤1)中，所述葡聚糖的质量分数浓度为1％-5％，最好为2％，酶的体积分数浓度为0.5％-4％，最好为1％、反应时间为6小时，酶解温度为60-100℃，最好为60℃。
所述步骤2)和4)中无水乙醇相对于沉淀物的用量为沉淀物体积的5-20倍。
所述步骤3)中，所述碱处理时，NaOH溶液为2.5％，用量为相对于沉淀物质量的5-20倍，在80℃下搅拌6小时为最佳。
本发明方法操作简单，设备投资少，产品纯度高，不含甘露聚糖，可避免酸法中酸对设备的腐蚀和对人体健康的危害；另外此方法分别考虑酶、碱、无水乙醇处理步骤中的各个影响因素，确定最佳的处理条件，使得到的以β-1，3-D为主链、β-1，6-D为侧链地不溶性葡聚糖具有较高的纯度和得率。经动物实验验证可以作为水产养殖中动物的免疫调节剂，因而本发明具有良好的应用前景。
【附图说明】
图1：样品的红外吸收图谱。
图2：标准β-1，3葡聚糖样品的红外吸收图谱。
【具体实施方式】
下面通过实施例对本发明的技术进一步说明。
实施例1：
2g葡聚糖悬浮于100ml pH8.0的磷酸缓冲液中，在60℃下加入2mlAlcalase蛋白酶，反应6h后，在沸水浴中灭活10min，离心，沉淀部分加10倍体积无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后用NaOH进行进一步的纯化。
称取除蛋白后的葡聚糖30mg放入水解管中，加入8ml、质量浓度2％的NaOH溶液，置于90℃的干浴器中处理6小时，离心后，沉淀部分加10倍体积的无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后进行红外图谱分析。结果表明其红外光谱与标准β-1，3-D-葡聚糖相似，成品的特征峰说明其糖苷键为β-1，3构型，产品主要含有β-1，3葡聚糖，而无甘露糖的吸收峰，说明没有甘露聚糖的存在。
实施例2
3g葡聚糖悬浮于150ml pH8.0的磷酸缓冲液中，在50℃下加入0.03g中性蛋白酶，反应6h后，在沸水浴中灭活10min，离心，沉淀部分加10倍体积的无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后用质量浓度2.5％10倍体积的NaOH溶液置于80℃的干浴器中处理6小时，离心后，沉淀部分加10倍体积的无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后进行红外图谱分析。结果表明其红外光谱与标准β-1，3-D-葡聚糖相似，成品的特征峰说明其糖苷键为β-1，3构型，产品主要含有β-1，3葡聚糖，而无甘露糖的吸收峰，说明没有甘露聚糖的存在。
实施例3
4g葡聚糖悬浮于200ml pH8.0的磷酸缓冲液中，在60℃下加入0.04g木瓜蛋白酶，反应8h后，在沸水浴中灭活10min，离心，沉淀部分加10倍体积的无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后用3％的NaOH置于100℃的干浴器中处理6小时，离心后，沉淀部分加10倍体积的无水乙醇搅拌5min后抽虑，真空干燥后进行红外图谱分析。结果表明其红外光谱与标准β-1，3-D-葡聚糖相似，成品的特征峰说明其糖苷键为β-1，3构型，产品主要含有β-1，3葡聚糖，而无甘露糖的吸收峰，说明没有甘露聚糖的存在。