表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法 【技术领域】
本发明属于材料合成领域，涉及一种用于生物样品中分离核酸的材料的制备方法，具体涉及一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法。
背景技术
生物磁分离技术是在传统磁分离技术的基础上发展起来，以细胞、细菌、核酸和蛋白质等生物体为应用对象的高效分离技术。它利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下做定向运动这一特性，对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。早期的工作主要集中于发展磁性标记物的制备技术上，包括通过在磁流体中浸渍将磁性纳米粒子吸附到琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。这种微球以颗粒大小分布均匀和磁性粒子含量均匀为特征，保证了不同生物分离过程的可重现性和可控性。生物磁分离技术与标准分离步骤相比有一定优势。首先磁分离过程通常非常简单，只涉及几个处理步骤，所有的纯化步骤都可在单个试管或者容器中发生，不需要昂贵的液相色谱系统、离心机、过滤器或者其它设备。分离过程可以在含有悬浮固体物质的粗制样品上直接进行。在某些情况下，例如细胞内蛋白质的提取，甚至可以整合裂解和分离步骤，从而缩短整个分离时间。磁分离技术对细胞、蛋白质和核酸等生物体通常是非常温和的。与高速离心和亲和色谱相比，磁分离技术具有较低的剪切力，能较好地保持被分离细胞的活力和生物分子的生物活性。
目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在分子生物学领域中，核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。作为遗传信息的携带者，DNA是基因表达的物质基础，除在生物体正常生长、发育和繁殖等生命活动中的作用外，它与生命异常如肿瘤的发生、遗传疾病等也密切相关。因此，对核酸分离纯化是许多研究领域的重要前提和保障。
目前常见的核酸分离方法有酚提取/沉淀法、层析法、密度梯度离心法等。这些传统方法往往比较费时，步骤繁琐，需使用有机试剂，有损操作者健康。所以有必要研究一种新的快速、方便的提取基因组DNA的方法。
Levison应用一种以磁性琼脂糖微球作为基质，表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的磁性微球用于核酸提取。
孙敏莉通过磁性纳米粒子与葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一种磁性葡聚糖-DEAE微球，并应用于大场杆菌中提取质粒。
上述两种表面修饰DEAE的磁性微球与核酸结合，主要是由于磁性微球表面修饰的DEAE在水溶液中带有正电荷，可与带负电荷的核酸结合，从而达到分离纯化核酸的目的。但是DEAE与核酸结合能力强，在洗脱过程中需用高浓度的盐溶液洗脱。这给下游核酸的应用带来不便，因为核酸在低浓度的盐溶液中才能用于下游应用。所以Levison和孙敏莉用表面修饰DEAE的磁性微球提取核酸后，还需采用乙醇沉淀的方法除去高浓度的盐，然后再将核酸沉淀重新溶解在缓冲溶液中。因此，该核酸纯化过程费时费力，而且在乙醇沉淀的过程中造成核酸的损失。
【发明内容】
本发明的目的：
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法，依该方法制备出的表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球在提取核酸时不需高浓度的盐溶液洗脱，省时省力，有效减少了核酸的损失。
解决本发明的技术方案：
一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法，该方法以磁性二氧化硅微球作为模板，以环氧烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作为活化剂，以阳离子作修饰剂制备成表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球；所述磁性二氧化硅微球是以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，其特征在于：所述阳离子修饰剂是一类在水溶液中带正电荷的化合物，该阳离子修饰剂pKa值介于4～8之间。
上述制备方法包括以下步骤
(1)制备磁性二氧化硅微球；
(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化；
(3)阳离子表面修饰：
(a)将步骤(2)制得的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸混合，边搅拌边加热反应；
(b)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤；
(c)将阳离子修饰剂溶于超纯水中，调节pH值为7～10，加入步骤(3.2)洗涤后的沉淀物，搅拌均匀，加热反应；
(d)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤，再用预处理溶液洗涤后，放入预处理溶液中，制备成表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球。
上述阳离子修饰剂为组氨酸、多聚组氨酸、咪唑或其衍生物、2-(N-吗啉代)乙磺酸或N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸。
上述步骤(a)稀盐酸的浓度为0.01～0.05mol/L，浓度为0.01mol/L时效果最好；表面键合环氧基地磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1∶100～500，该比例为1∶100～300时效果较好，该比例为1∶150时效果最好；搅拌速度为600～800转/分钟，加热至80～100℃，反应时间为2～4小时；
上述步骤(c)阳离子修饰剂是一类pKa值介于4～8的化合物，搅拌速度为600～800转/分钟，加热至55～100℃，反应时间为4～6小时；
上述步骤(d)预处理溶液的成分是：10mM MES、1mM EDTA和10mMNaCl。
上述步骤(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化的方法是：
(a)取步骤(1)制得的磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100配成混合溶液，该比例为1∶1020～1080时效果最好；以50～70Hz的频率超声处理10～30分钟；
(b)在气体流速为2～3mL/min的氮气保护下，加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，边滴加边以600～800转/分钟搅拌，再以90～110℃回流12～24小时，得到沉淀物，所述3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(a)的混合溶液的质量比为1∶22～26；
(c)用外部磁铁将步骤(b)得到的沉淀物分离出来，将该沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
上述步骤(1)磁性二氧化硅微球的制备方法是：
(a)将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20混合，该比例为1∶12～18时效果最好；以800～1000转/分钟将该混合物搅拌均匀；
(b)将FeCl2·4H2O与FeCl3·6H2O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液；该浓度为140～150g/L效果最好；
(c)在气体流速为2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h的速度将步骤(b)的水溶液滴加到步骤(a)的混合物中，边滴加边以600～800转/分钟持续搅拌4～6小时；
(d)加入质量浓度为25％的氨水，以600～800转/分钟持续搅拌2～4小时，有四氧化三铁纳米颗粒形成，所述氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0.1～0.2∶1，该比例为0.15～0.2∶1时效果最好；
(e)再以2～3mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，边滴加边以600～800转/分钟搅拌反应，调节pH值至8～9，滴加完毕1～2小时后，停止通氮气，常温常压下以600～800转/分钟搅拌4～5天，得到产物，所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1～1.5∶1，该比例为1.2～1.5∶1时效果最好；
(f)在产物中加入乙醇，以1500～2000转/分钟离心30～50分钟，得到上层液和沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为2～2.5∶1，该比例为2.1～2.4∶1时效果最好；
(g)弃上层液，将沉淀物在乙醇中以70～80℃回流12～24小时，得到上层亮黄色溶液和黑色沉淀物，所述乙醇与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为20～25∶1，该比例为20～24∶1时效果最好；
(h)弃上层亮黄色溶液，将黑色沉淀物用乙醇，水，丙酮交替洗涤后，放入真空干燥箱内，50～70℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
上述方法中所用阳离子修饰剂是一类在水溶液中带正电荷的化合物，该阳离子修饰剂pKa值介于4～8之间，随着溶液pH值的升高，阳离子基团可由带电状态转变为不带电状态。用上述方法制备出的表面修饰此类阳离子的磁性二氧化硅微球，可利用磁性微球表面所带电荷变化提取核酸。当磁性微球表面带正电荷时可取表面带负电荷的核酸结合，从而将核酸分离出来，再改变溶液中pH值，使磁性微球表面不带电荷，将核酸洗脱下来。
本发明的优点是：
1、采用该方法制备的表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球，由于修饰的阳离子是一类pKa值介于4～8的化合物，用它提取核酸时不需高浓度的盐溶液洗脱，从而就不需要采用乙醇沉淀的方法除去高浓度的盐，省时省力，也不会因为在乙醇沉淀的过程中造成核酸的损失。
2、该方法制备出的表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球提取核酸量大。
3、该方法设计合理、工艺可行性好，操作简单。
【附图说明】
图1是实施例1表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球的VSM磁滞回线。
图2-a是实施例1制备的磁性二氧化硅微球的扫描电子显微镜照片。
图2-b是实施例1制备的磁性二氧化硅微球的透射电子显微镜照片。
图2-c是实施例1制备的表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球的扫描电子显微镜照片。
图3是实施例1制备的表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱图。
图4是实施例1制备的表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图。
图5是实施例1制备的表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球的全自动X-射线衍射图谱。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于这些实施例。
实施例1制备表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与109.3g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.329g FeCl2·4H2O与0.987g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为140g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水2mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯9.79mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇16.4g，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇164g回流12小时，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯105g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.2g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.组氨酸表面修饰
取4.13g组氨酸溶于90mL超纯水中，用NaOH固体调节pH值至8.0。加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.3g，加热至80℃反应4小时，制备成表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球。
实施例2制备表面修饰多聚组氨酸的磁性二氧化硅微球
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与109.3g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.329g FeCl2·4H2O与0.987g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为140g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水2mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯9.79mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇16.4g，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇164g回流12小时，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯105g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.2g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.多聚组氨酸表面修饰
取5.6g多聚组氨酸溶于90mL超纯水中，用NaOH固体调节pH值至8.0。加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.3g，加热至80℃反应过夜。制备成表面修饰多聚组氨酸的磁性二氧化硅微球。
实施例3制备表面修饰咪唑的磁性二氧化硅微球
1.制备磁性二氧化硅微球
取7.2892g十六烷基三甲基溴化铵与109.3g甲苯加入到四口烧瓶内，用搅拌机以1000转/分钟搅拌均匀，将0.329g FeCl2·4H2O与0.987g FeCl3·6H2O溶解于9.4397g二次水中配制成浓度为140g/L的水溶液，在2～3mL/min氮气保护下以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水2mL，800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成，缓慢加入正硅酸乙酯9.79mL，800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇16.4g，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物80℃用乙醇164g回流12小时，去掉上层亮黄色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球。
2.磁性二氧化硅微球的环氧基化
取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯105g加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/min N2气保护下，再加入3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.2g，800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水交替洗涤3次后，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。
3.咪唑表面修饰
取3.6g咪唑溶于90mL超纯水中，用NaOH固体调节pH值至8.0。加入表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球0.3g，加热至80℃反应过夜。制备成表面修饰咪唑的磁性二氧化硅微球。
为了验证本发明的有益效果，将实施例1制备的表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球用VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、扫描电子显微镜、透射电镜、元素分析仪、原子吸收光谱仪对其进行了表征；利用琼脂糖凝胶电泳测试了表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球纯化基因组DNA的性能，各种试验情况如下：
观察物品：表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球
实验仪器：振动样品磁强计型号为vsm-9500；高分辨透射电子显微镜型号为JEM-3010；XPS光电子能谱仪型号为KRATOS AXIS ULTRA；全自动X-射线衍射仪型号为D/Max-3c；环境扫描电子显微镜型号为Quanta 200；元素分析仪；原子吸收分光度计型号为TAS 986(G)。
1、观察
按透射电镜、扫描电子显微镜使用方法对磁性二氧化硅微球修饰前后进行观察，观测结果见图2-a、图2-b和图2-c。由图2-a、图2-b可见，透射电镜观察和扫描电子显微镜观察磁性二氧化硅微球呈类球形，结构完整；由图2-c可见，扫描电子显微镜观察磁性二氧化硅微球修饰后仍呈类球形，结构完整。
2、测试
按VSM磁滞回线仪、XPS光电子能谱仪、全自动X-射线衍射仪、元素分析仪、原子吸收光谱仪，电泳分析的测试方法对表面鳌合金属离子的磁性二氧化硅微球进行测试。
3、观测结果
用VSM磁滞回线仪测试表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球，结果见图1。由图1可见，表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球顺磁性好，无矫顽力，饱和磁化强度为30.081emu/g。用XPS光电子能谱仪测试的光电子能谱图见图3，由图3可见，组氨酸成功的结合在磁性二氧化硅微球上，各元素的含量见表1。表1表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱元素含量
元素 峰面积(cts-eV/s) 灵敏常数 浓度(％) C 1s 2649.0 0.278 31.52 Si 2p 2311.1 0.328 23.57 O 1s 11093.1 0.78 43.31 N 1s 238.5 0.477 1.6
由表1可见，所得微球含有Si、C、O、N等元素，表明表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球含有制备该微球相应成分。
表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球XPS光电子能谱N元素的化学位移谱图见图4。由图4可见，N元素峰在399.4ev，说明N元素以叔胺形式存在。
用全自动X-射线衍射仪测定表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅纳米微球的X-射线衍射图谱示于图5。由图5可见，X-射线衍射图谱2θ在18.2°、30.613°、35.690°、43.420°、53.949°和57.214°等处出现了Fe3O4的特征强衍射峰，在22.700°等处出现了SiO2的特征强衍射峰，这些衍射信号与立方晶系Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)等点阵面的衍射峰[JCPDS，65-3107]相一致，在22.700°附近出现了SiO2无定型的特征衍射峰。
用元素分析仪进行测试，得到的磁性二氧化硅微球和表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅纳米微球的元素含量。测试结果见表2。
表2磁性二氧化硅微球和表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球的元素含量
由表2可见，表面修饰组氨酸的磁性二氧化硅微球与磁性二氧化硅微球相比，C、H、N的含量显著升高，说明磁性二氧化硅微球已被相应的有机成分所修饰。