技术领域
本发明涉及一种低温保存方法，具体涉及一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超 低温保存方法。
背景技术
甜樱桃(Prunusavium)是我国北方重要的果树树种之一。它具有营养价值高，经 济效益好、前景广阔等优点，发展潜力巨大。但是甜樱桃砧木的选择在很大程度上影响甜樱 桃栽培的成败。砧木与品种的亲和性影响甜樱桃的成活率与产量。亲和性好的砧木，嫁接易 成活，树木长势旺盛，产量较高。反之，亲和性差的砧木影响生长，对其产量也会造成影响。
‘吉塞拉’（Gisela）甜樱桃砧木，是以酸樱桃（Prununcerasus）和灰毛叶樱桃（P. canescens）为亲本开展种间杂交得到的三倍体杂种矮化砧木。‘吉塞拉’树体开张，分枝基 角大，与大多数甜樱桃品种亲合性良好，具有明显的矮化、丰产、早实性强、抗病、耐涝、土壤 适应范围广、固地性能好、抗寒、产量效率高等优良特性。‘吉塞拉’的引进及推广利用，有利 于克服我国甜樱桃生产的树体高大、难于管理等问题。‘吉塞拉’作为甜樱桃矮化砧木具备 以上这些优良性状，然而在甜樱桃的栽培过程中，‘吉塞拉’的遗传稳定性却影响着甜樱桃 的生长，因此其种质资源的长期稳定保存具有重大意义。
超低温冷冻保存方法被认为是对植物遗传资源进行长期保护的一种理想手段。虽 然在过去十几年的研究中已经取得了很多进展，但是现有技术中，超低温保存技术大多针 对水稻、马铃薯等作物，对于甜樱桃矮化砧木吉塞拉的超低温保存方法尚未见报道。玻璃化 超低温保存方法中，玻璃化溶液、卸载液等的选择起到关键作用。化冻也是决定保存后茎尖 成活率的重要原因，传统的利用卸载液直接洗涤，但这种方法对于甜樱桃砧木吉塞拉的适 应性不强，存活率不高。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超 低温保存方法，该方法保存的甜樱桃种质资源遗传稳定，且冷冻保存的稳定性好，砧木的存 活率高。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化超低温保存方法，该方法包括 以下步骤：
a.低温锻炼
将继代生长90天的吉塞拉无菌苗置于4℃的光照培养箱中低温锻炼4周；
b.蔗糖预培养
将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的茎尖，将茎尖迅 速转移到装有预培养液的冻存管中，进行预培养1-5d，所述预培养液按每升计含：MS+0.3- 0.9mol蔗糖；
c.装载及冻存
预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液，室温静置30min，去除装载液， 加入玻璃化溶液，在0℃条件下放置60-90min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化 溶液浸没茎尖，然后将冻存管放入液氮进行超低温保存，所述玻璃化溶液为：50%甘油+50% 蔗糖；
d.化冻及恢复培养
将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，加入卸载液采用两步洗涤 法进行洗涤，每次7-9min，无菌滤纸吸干茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗 培养一周，一周后转至温度为25±2℃的光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d，所述卸载 液按每升计含：MS+0.9/1.2mol蔗糖；所述恢复培养基按每升计含：MS+0.5mg6-BA+0.5mol 蔗糖+PH值为5.8，质量浓度为0.7%琼脂。
步骤b所述的预培养液按每升计含：MS+0.3mol蔗糖。
步骤d所述的两步洗涤法为首先采用每升含MS+1.2mol蔗糖的卸载液洗涤7-9min， 然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤7-9min。
所述的装有预培养液的冻存管中，每管茎尖不低于30个。
所述的MS是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐 和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合 适，能满足植物细胞的营养和生理需要。
所述的6-BA为6-苄基嘌呤。
本发明中所采用的玻璃化溶液为50%甘油+50%蔗糖，甘油的渗透速度快，毒性低， 分布均匀，能够有效的防止细胞脱水，甘油含量对茎尖保护起主要作用，浓度过高则会导致 液体粘性过大，导致细胞脱水，过低则起不到对细胞的保护作用；采用非渗透性蔗糖在细胞 外起到辅助作用，降低溶液中自由水的含量，减少冰晶的形成，减轻溶质损伤。
本发明采用两步洗涤法进行洗涤，通过梯度性的降低卸载液的浓度，避免因浓度 差过大造成细胞的破裂，同时，能提高洗涤效率，减少玻璃化溶液在茎尖中的残留，提高存 活率。
本发明液氮中保存时间的长短对于吉塞拉茎尖存活率没有影响，因此可以实现长 期保存的目的。
本发明的优点及有益效果为：
1.该方法保存时间长，保存的甜樱桃种质资源遗传稳定性好，且经济简便。
2.该方法适合于木本植物种质资源的长期保存，保存后采用两步洗涤法洗涤，然 后进行恢复培养，存活率高。
附图说明
图1为吉塞拉茎尖及恢复培养后茎尖的图片，A：剥取的吉塞拉茎尖；B：超低温冷冻 保存恢复培养4周的茎尖；C超低温冷冻保存恢复培养两个月的组培苗。
图2为BPPCT030引物对吉塞拉5号及其超低温冷冻保存后再生植株的SSR分析结 果，自左向右泳道分别是：marker、吉塞拉5号、吉塞拉5号冷冻后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 marker、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21。
图3为UCD-CH12引物对吉塞拉5号及其超低温冷冻保存后再生植株的SSR分析结 果，自左向右泳道分别是：marker、吉塞拉5号、吉塞拉5号冷冻后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 marker、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21。
图4为BPPCT026引物对吉塞拉5号及其超低温冷冻保存后再生植株的SSR分析结 果，自左向右泳道分别是：marker、吉塞拉5号、吉塞拉5号冷冻后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、marker、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、marker。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了 解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
吉塞拉5号玻璃化超低温保存方法，具体包括以下步骤：
a.低温锻炼：将继代生长90天的吉塞拉5号无菌苗置于4℃、光照培养箱中低温锻 炼4周；
b.蔗糖预培养：将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的 茎尖（见图1A），将茎尖迅速转移到装有预培养液（每升含：MS+0.3mol蔗糖）的冻存管中，进 行预培养1d，冻存管中茎尖数量为35个；
c.装载及冻存：预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液（每升含：MS+ 2mol甘油+0.4mol蔗糖），室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗 糖），在0℃条件下放置90min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液（50%甘油+ 50%蔗糖）浸没茎尖，然后将冻存管放入液氮中进行超低温保存，在液氮罐中保存24h；
d.化冻及恢复培养：将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，首先采 用每升含MS+1.2mol蔗糖的卸载液洗涤8min，然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤 8min，无菌滤纸吸干茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗培养一周，一周后转 至温度为25±2℃的光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d，恢复培养4周的茎尖（见图 1B），恢复培养两个月的组培苗（见图1C）。
实施例2
吉塞拉5号玻璃化超低温保存方法，具体包括以下步骤：
a.低温锻炼
将继代生长90天的吉塞拉5号无菌苗置于4℃、光照培养箱中低温锻炼4周；
b.蔗糖预培养
将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的茎尖，将茎尖迅 速转移到装有预培养液（每升含：MS+0.6mol蔗糖）的冻存管中，进行预培养3d，冻存管中茎 尖数量为35个；
c.装载及冻存
预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液（每升含：MS+2mol甘油+0.4mol 蔗糖），室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗糖），在0℃条件下放 置60min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗糖）浸没茎尖，然 后将冻存管放入液氮中进行超低温保存，在液氮罐中保存48h；
d.化冻及恢复培养
将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，首先采用每升含MS+1.2mol 蔗糖的卸载液洗涤7min，然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤7min，无菌滤纸吸干 茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗培养一周，一周后转至温度为25±2℃的 光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d。
实施例3
吉塞拉6号玻璃化超低温保存方法，具体包括以下步骤：
a.低温锻炼
将继代生长90天的吉塞拉6号无菌苗置于4℃、光照培养箱中低温锻炼4周；
b.蔗糖预培养
将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的茎尖，将茎尖迅 速转移到装有预培养液（每升含：MS+0.9mol蔗糖）的冻存管中，进行预培养5d，冻存管中茎 尖数量为35个；
c.装载及冻存
预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液（每升含：MS+2mol甘油+0.4mol 蔗糖），室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗糖），在0℃条件下放 置75min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗糖）浸没茎尖，然 后将冻存管放入液氮中进行超低温保存，在液氮罐中保存72h；
d.化冻及恢复培养
将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，首先采用每升含MS+1.2mol 蔗糖的卸载液洗涤9min，然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤9min，无菌滤纸吸干 茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗培养一周，一周后转至温度为25±2℃的 光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d。
对比例1
吉塞拉5号玻璃化超低温保存方法，具体包括以下步骤：
a.低温锻炼：将继代生长90天的吉塞拉5号无菌苗置于4℃、光照培养箱中低温锻 炼4周；
b.蔗糖预培养：将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的 茎尖（见图1），将茎尖迅速转移到装有预培养液（每升含：MS+0.3mol蔗糖）的冻存管中，进行 预培养1d，冻存管中茎尖数量为35个；
c.装载及冻存：预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液（每升含：MS+ 2mol甘油+0.4mol蔗糖），室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液（50%甘油+50%蔗 糖），在0℃条件下放置90min，然后吸出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液（50%甘油+ 50%蔗糖）浸没茎尖，然后将冻存管放入液氮中进行超低温保存，在液氮罐中保存24h；
d.化冻及恢复培养：将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，采用每 升含MS+1.2mol蔗糖的卸载液洗涤10min，无菌滤纸吸干茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢 复培养基中，暗培养一周，一周后转至温度为25±2℃的光照培养室内进行恢复培养，光照 12h/d。
对比例2
吉塞拉5号玻璃化超低温保存方法，具体包括以下步骤：
a.低温锻炼：将继代生长90天的吉塞拉5号无菌苗置于4℃、光照培养箱中低温锻 炼4周；
b.蔗糖预培养：将无菌苗在无菌条件下剥取长度为1-1.5mm，含有1-2个叶原基的 茎尖（见图1），将茎尖迅速转移到装有预培养液（每升含：MS+0.3mol蔗糖）的冻存管中，进行 预培养1d，冻存管中茎尖数量为35个；
c.装载及冻存：预培养结束后，室温下吸出预培养液，注入装载液（每升含：MS+ 2mol甘油+0.4mol蔗糖），室温静置30min，去除装载液，加入玻璃化溶液（MS+30%（w/v）甘油+ 15%（w/v）乙二醇+15%（w/v）二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。），在0℃条件下放置90min，然后吸 出玻璃化溶液，重新注入新的玻璃化溶液（每升含：MS+30%（w/v）甘油+15%（w/v）乙二醇+15% （w/v）二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。）浸没茎尖，然后将冻存管放入液氮中进行超低温保存， 在液氮罐中保存24h；
d.化冻及恢复培养：将冷冻后的冻存管取出，迅速放入40℃水中化冻1min，首先采 用每升含MS+1.2mol蔗糖的卸载液洗涤8min，然后再用每升含MS+0.9mol蔗糖的卸载液洗涤 8min，无菌滤纸吸干茎尖残留的卸载液，将茎尖放入恢复培养基中，暗培养一周，一周后转 至温度为25±2℃的光照培养室内进行恢复培养，光照12h/d。
将实施例1-3及对比例1-2保存后的吉塞拉茎尖通过恢复培养后的存活率进行了 统计，结果见表1
表1
从表1中可以看出，洗涤方式的改变和玻璃化溶液的选择对茎尖的存活率有着直 接的影响，通过本发明提供的两步洗涤法及新型的玻璃化溶液，茎尖的存活率高。
对实施例1的吉塞拉5号茎尖超低温保存后的遗传稳定性进行检测：
剥取茎尖时，提取无菌苗的叶片DNA作为对照，茎尖经过玻璃化超低温保存后，提 取其中21株再生的苗叶片DNA，共22份样品采用SSR分子标记进行遗传稳定性检测。经过PCR 扩增体系的优化以及PCR扩增条带的筛选，共筛选17对引物，根据扩增结果选取3对进行后 续SSR分析，PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，根据SSR分析引物筛选的原则，挑选扩 增多态性好，条带清晰易区分的3对引物，BPPCT030，UCD-CH12和BPPCT026，具体引物序列见 表2。
表2
用这三对引物进行SSR分析。SSR分析结果见图2、图3、图4。
从图2可以看出BPPCT030引物扩增后的结果，即超低温保存后的21份样品与超低 温保存前的样品没有出现差异性条带。图3、图4可以看出UCD-CH12和BPPCT026引物扩增后 都没有出现差异性条带。也就是超低温保存后再生的植株与未超低温保存的材料之间没有 发生遗传变异，因此，玻璃化超低温保存方法的遗传稳定性好，种质资源稳定，可以进行长 期保存。