技术领域
本发明属于农作物培育领域，涉及一种采用琼脂糖基质筛选或鉴定抗除草剂水稻的方法。
背景技术
水稻是我国乃至世界的主要粮食作物之一，每年种植面积约为3000万公顷，产量达2亿吨。在水稻的生产过程中，杂草与水稻争夺资源，不仅降低稻谷产量，还影响稻米的品质。为控制杂草生长，每年需投入大量的人力物力。随着城市化进程的加快，农村劳动力的大量转移，传统的生产作业方式将逐渐消失，水稻生产将面临劳动力短缺的问题。因此，发展高效低耗的新型栽培模式，如水稻直播、抛栽是未来的发展方向。但由于直播、抛栽使杂草控制难度加大，而传统手工除草的方式不再适应新的播种模式。随着科学技术的发展,通过化学方法来控制杂草已成为现代农业中不可缺少的一部分，化学除草剂具有省工省力、高效的特点。在欧美等发达国家，杂草治理主要依靠化学除草剂。因此通过培育抗除草剂水稻新品种是解决水稻生产问题的理想途径。另一方面，利用除草剂抗性基因也可以有效的解决常规稻及两系杂交水稻制种中的纯度问题，并且能简化杂交制种程序，实现机械化制种，降低杂交种成本。
然而目前水稻除草剂的抗性筛选或鉴定主要是依靠田间试验进行，即在田间对水稻进行播种，一定时期后进行除草剂的喷施。此方法费时费力，而且喷施的浓度及均匀度不易控制，从而影响了结果的准确性。而采用分子标记的方法成本较高，且技术环节多，对设备也有一定的要求；对已知基因有效，而对未知基因的筛选及鉴定就无法应用。因此一种快速高效准确的抗除草剂筛选或鉴定方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明公开了一种采用琼脂糖基质筛选或鉴定抗除草剂水稻的方法，它是按如下的步骤进行：
（1）浸种催芽：
将100-105粒水稻种子装在纸袋中，做好标记，浸泡在32-34℃的温水中，连同盛放容器置于光照培养箱中32℃保温，每天早中晚换水三次，待3-4天露白后方可播种；所述的种子指的是：将咪唑乙烟酸抗性的水稻品种与咪唑乙烟酸非抗性水稻品种杂交，收获得到F1代种子；播种F1代种子，育苗，移栽，混收F1代植株上的F2种子；单株种植F2代且按株收获F3代种子，获得到所述的水稻种子；或将咪唑乙烟酸敏感的水稻品种种子进行诱变处理，得到M1代种子；播种M1代种子，按常规育苗、移栽和种植，培育成M1植株，成熟后收获得到M2代种子，即为所述的水稻种子；
（2）培养基准备：
1）配制除草剂母液：将除草剂普施特稀释十倍，即2ml的普施特加水18ml；
2）配制0.4-0.6%(w/w)的琼脂糖平板：将2L水倒入电磁锅中，加入10g琼脂糖，搅拌均匀，煮沸直至琼脂完全溶解，待温度降低到60-70℃后分装到三角瓶中，每瓶500ml，加入500ul稀释10倍的除草剂咪唑乙烟酸母液，即终浓度为0.1ml/L，摇匀后倒平皿，培养基凝固后即可使用；
（3）播种：
在培养皿上标记所播品系名称，选取露白的种子50-55粒，均匀的播种在培养基上，同时播种抗和不抗的品种各两粒作为正负对照，并划线分隔做好标记，为防止水分散失，将10-12个的培养皿叠到一起并用保鲜膜包裹，最后放到32℃连续光照的培养箱中；
（4）观察统计
待3-4天后进行观察统计，与抗和不抗的正负对照品种进行比较，统计出抗除草剂的种子数与不抗除草剂的种子数。
本发明选择的抗性对照品种指的是：具有抗性基因不能被除草剂杀死（不敏感）的品种。本实验用：歼1。
本发明选择的不抗对照品种指的是：没有抗性基因能被除草剂杀死（敏感）的品种。本实验用：日本晴。
本发明所述的种子，典型的待测水稻种子可以通过诱变育种或杂交育种两种方法得到：
采用诱变育种时，所述的水稻种子可以通过如下方法培育：将咪唑乙烟酸敏感的水稻品种种子进行诱变处理，得到M1代种子；播种M1代种子，按常规育苗、移栽和种植，培育成M1代植株，成熟后收获得到M2 代种子，即为所述的水稻种子。
其中，所述的诱变处理可以采用物理诱变剂或化学诱变剂其中的一种或组合进行。所述的物理诱变剂为γ射线、高能离子等；γ射线处理方法：在专业辐照单位利用60Co γ射线为诱变源，以300 Gy处理剂量处理干种子。 所述的化学诱变剂为叠氮化钠(NaN3)、甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基磺酸乙酯(EMS) 等；EMS处理方法：用蒸馏水浸泡种子5 h，换1%的EMS溶液浸泡过夜（约12 h），清水冲洗4 h。
采用杂交育种时，所述的水稻种子通过如下方法培育：将咪唑乙烟酸抗性的水稻品种与咪唑乙烟酸不抗的水稻杂交，收获得到F1代种子；播种F1 代种子，按常规方法育苗、移栽和种植，培育成F1植株，成熟后收获得到F2代种子，单株种植F2代且按株收获F3代种子，获得到所述的水稻种子。
本发明所述的纸袋指的是硫酸纸袋（又名牛皮纸袋），所述的平皿直径为9cm，30ml/皿。
优选配制琼脂糖的浓度为0.5%(w/w)。
本发明可以快速高效准确的筛选或鉴定出抗除草剂咪唑乙烟酸的水稻。为抗除草剂咪唑乙烟酸水稻育种及纯度鉴定提供很好的技术手段。
本发明在实验室的培养皿中利用含有一定浓度的咪唑乙烟酸琼脂糖培养基进行筛选或鉴定，而现有技术是将水稻播种到田间进行喷药处理来筛选或鉴定的。
本发明典型的公开了除草剂咪唑乙烟酸，其他的具有相同性质（内吸传导型）的除草剂都可以用此方法进行。如草甘膦、扑草净、盖草能和稳杀醚等。
本发明的发明关键点在于：将除草剂加入琼脂糖中在培养皿中进行水稻培养，培养的结果显示：
（1）本方法能很好的分辨抗与不抗的水稻品种及品系，或抗性单株。
（2）本方法技术体系完善，尤其加入正负对照后结果非常准确。
（3）本方法省时省力，实验条件要求低，适于大规模筛选或鉴定。
附图说明：
图1为水稻种子抗性鉴定结果；其中图1A-C为单株收获种子抗性鉴定结果；说明该方法能准确的鉴定出上一代单株的除草剂抗性情况；图1D为诱变后抗性株的筛选结果；说明该方法能有效的筛选出抗性单株；
图2为不同培养环境中的培育情况图；其中图2A为光照培养箱培养情况，图2B为实验室培养情况；说明该方法既能在光照培养箱又能在具有一定恒温条件的实验室进行培养，并且所需空间很少，一个光照培养箱可以一次筛选1千份以上材料；
图3为除草剂咪唑乙烟酸浓度梯度跨在0 – 4 ml/L进行筛选鉴定实验图；图3说明除草剂浓度在0.01 - 0.5 ml/L范围都可进行筛选或鉴定。说明该方法对除草剂浓度的要求不高，而0.1ml/L的优选浓度能保证实验的准确进行。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中试验用到的种子歼1与津稻263、金粳28以及除草剂普施特均有市售。
实施例1
采用琼脂糖基质鉴定培育抗除草剂水稻的方法：
（1）待测水稻种子获得
将咪唑乙烟酸敏感水稻歼1和咪唑乙烟酸不敏感的水稻津稻263播于田间，盛花期时对津稻263去雄，并用歼1的花粉进行杂交，收获F1代种子。对F1代种子进行种植，混收F2代种子；单株种植F2代植株，单株收获F3代种子。
（2）浸种催芽
将上述100粒F3代收获的种子装在硫酸纸袋中，对不同的单株做好标记，浸泡在32℃的温水中，连同盛放容器置于光照培养箱中32℃保温，每天早中晚换水三次，待3天露白后播种。
（3）培养基准备
1）配制除草剂母液：将除草剂普施特稀释十倍，即2ml的普施特加水18ml。
2）配制0.5%(w/w)的琼脂糖平板：将2L水倒入电磁锅中，加入10g琼脂糖，搅拌均匀，煮沸直至琼脂完全溶解，待温度降低到70℃后分装到三角瓶中，每瓶500ml，加入500ul稀释10倍的除草剂咪唑乙烟酸母液，最终浓度为0.1ml/L，摇匀后倒平皿，直径为9cm，30ml/皿，培养基凝固后即可使用。
（4）播种
在培养皿上标记所播单株编号，选取露白的种子55粒，均匀的播种在培养基上，同时播种抗和不抗的品种各两粒作为正负对照，并划线分隔做好标记，为防止水分散失，将10-12个的培养皿叠到一起并用保鲜膜包裹，最后放到32℃连续光照的培养箱中。
（5）观察统计
待3-4天后进行观察统计，与抗和不抗的正负对照品种进行比较，统计出抗除草剂的种子数与不抗除草剂的种子数。
结果：
本实例要对单株进行纯合和杂合的鉴定，符合孟德尔遗传定律，即纯合株的种子全部是抗性或不抗的种子（图1A和1B），而杂合株的种子符合抗与不抗的种子数比约为3:1（图1C）。
实施例2
采用琼脂糖基质筛选培育抗除草剂水稻的方法：
（1）待测水稻种子获得
将1kg金粳28的种子用蒸馏水浸泡5 h，换1%的EMS溶液浸泡过夜（约12 h）,清水冲洗4 h，然后浸泡在32 ℃的水中培养过夜，第2天播种在秧田，待长出4-5个叶片后移栽至大田，成熟后得到M1代种子。将所有M1代种子进行播种、单株移栽，收获单株（为减少工作量可以多株混收）上的M2 代种子。
（2）浸种催芽
将上述100粒单株（或多株混收）M2代种子装在硫酸纸袋中，做好标记，浸泡在32℃左右的温水中，连同盛放容器置于光照培养箱中32℃保温，每天早中晚换水三次。待4天露白后方可播种。
（3）培养基准备
1）配制除草剂母液：将除草剂普施特稀释十倍，即2ml的普施特加水18ml；
2）配制0.5%(w/w)的琼脂糖平板：将2L水倒入电磁锅中，加入10g琼脂糖，搅拌均匀，煮沸直至琼脂完全溶解，待温度降低到70℃后分装到三角瓶中，每瓶500ml，加入500ul稀释10倍的除草剂咪唑乙烟酸母液，最终浓度为0.1ml/L，摇匀后倒平皿，直径为9cm，30ml/皿，培养基凝固后即可使用。
（4）播种
在培养皿上标记所播单株编号，选取露白的种子55粒，均匀的播种在培养基上，同时播种抗和不抗的品种各两粒作为正负对照，并划线分隔做好标记，为防止水分散失，将10-12个的培养皿叠到一起并用保鲜膜包裹，最后放到32℃连续光照的培养箱中。
（5）结果观察统计
待3-4天后进行观察统计，与抗和不抗的正负对照品种进行比较，筛选出抗性单株。
注意事项：
（1） 浸种时注意浸泡足够量的正负对照品种。
（2） 琼脂糖的批次不同硬度也不同，注意调整，一般在0.4%-0.6%之间进行调整。
Marker笔标记玻璃器皿培养过程中容易掉色，因此最好用塑料器皿；纸袋上的笔迹也容易被水浸泡模糊掉。
5、结果
如图1D，该方法能有效的筛选出抗性单株。
该方法与常规方法的比较：