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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510424543.0 (22)申请日 2015.07.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104957041 A (43)申请公布日 2015.10.07 (73)专利权人 中国科学院合肥物质科学研究院 地址 230031 安徽省合肥市蜀山湖路350号 (72)发明人 吴丽芳 侯金艳 毛颖基 刘文博 赵薇薇 穆燕 (74)专利代理机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 代理人 方荣肖 (51)Int.Cl. A01H 4/00(200。
2、6.01) 审查员 陈仕高 (54)发明名称 一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用叶柄为外植体诱导 乌桕植株再生的方法， 属于植物生物技术领域， 对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、 培养， 获得乌桕无菌苗； 切取无菌苗的叶柄作为 外植体， 并接种于诱导培养基中诱导不定芽或愈 伤组织； 将产生不定芽或产生愈伤组织的外植 体， 转接于增殖培养基中分别进行增殖培养； 将 增殖后的愈伤组织转入分化培养基中进行愈伤 组织分化； 将增殖后的不定芽丛或分化成不定芽 点的愈伤组织转接于不定芽伸长培养基中； 待丛 生芽伸长后将其转到生根培养基中进行生根培 养获。
3、得健壮的乌桕再生植株。 本发明不仅为后期 的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径， 而 且为通过基因工程的方法对乌桕进行遗传改良 提供了支撑。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 104957041 B 2017.02.22 CN 104957041 B 1.一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、 培养， 获得乌桕无菌苗； (2)切取步骤(1)中所获得的无菌苗的叶柄作为外植体， 并接种于诱导培养基中诱导不 定芽或愈伤组织； 其中， 无菌苗的叶柄在接种于诱导培养基前切成0.30.6cm大小的切段； 愈伤。
4、组织的诱导培养基为： MS+0.22.0mg/L NAA+0.21.0mg/L 6-BA+0.010.1mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； (3)将步骤(2)中产生不定芽或产生愈伤组织的外植体， 转接于增殖培养基中分别进行 不定芽和愈伤组织的增殖培养； 其中， 不定芽的增殖培养基为： MS+0.22.0mg/L 6-BA+ 3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 愈伤组织的增殖培养基为： MS+1.03.0mg/L NAA+0.2 1.0mg/L 6-BA+0.010.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； (4)将。
5、步骤(3)中增殖后的愈伤组织转入分化培养基中进行愈伤组织分化； 其中， 愈伤 组织的分化培养基为： MS+0.52.0mg/L 6-BA+0.010.2mg/L IBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼 脂， pH5.8； (5)将步骤(3)中增殖后的不定芽丛或步骤(4)中分化成不定芽点的愈伤组织转接于不 定芽的伸长培养基中， 进行不定芽的伸长； 其中， 不定芽的伸长培养基为： MS+0.21.0mg/L 6-BA+0.00.1mg/L IAA+0.010.1mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； (6)待不定芽伸长后将其转到生根培养基中进行生根培养； 23周后，。
6、 待苗长至3 4cm,并伴有24个真叶时进行驯化、 移栽， 获得健壮的乌桕再生植株； 其中， 所述步骤(2)中的不定芽的诱导培养基为： MS+2.04.0mg/L 6-BA+0.01 0.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 在乌桕叶柄再生的整个过程中除了叶柄 诱导愈伤组织的培养条件为232、 黑暗培养， 其它再生过程的培养条件均为232、 光 照培养， 光照强度20002200lx,光照时间为1216h。 2.根据权利要求1所述的利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法， 其特征在于， 所 述步骤(4)中的愈伤组织转入分化培养基前切成(0.30.5)(0.30。
7、.5)cm2大小的切块。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104957041 B 2 一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法 技术领域 0001 本发明属于植物生物技术领域， 具体涉及一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再 生的方法。 背景技术 0002 随着全球经济和社会的发展， 对能源的需求日益增长， 而化石燃料的储存量有限， 可再生能源的发展受到越来越多的关注。 乌桕(Sapium sebiferium Roxb)是我国的四大木 本油料之一， 属于大戟科乌桕属多功能树种。 其适应性强， 不仅耐干早、 瘠薄和耐短期积水， 且是抗盐性强的乔木树种之一； 它的籽实含油率高， 最高可达。
8、55， 是具有很好应用前景的 生物能源树种； 除了用于制取生物柴油外， 乌桕种子还可提制 “皮油” 和 “清油” ， 前者供制高 级香皂、 蜡纸、 蜡烛等， 后者供油漆、 油墨等用， 具有极高的经济价值； 此外， 乌桕还是集观 果、 观叶、 观型与一身的优良的园林景观树种， 具有重要的观赏价值， 在我国已有1400年的 栽培历史。 0003 优良品种的培育对于提高乌桕产量、 改善油脂品质具有重要意义。 采用传统的育 种方式对乌桕进行品种改良， 不仅育种过程繁琐而且育种周期长； 以基因工程、 组织培养等 生物技术对乌桕进行品种改良可大大缩短育种周期， 提高育种效率。 而利用基因工程手段 对植物进。
9、行品种改良， 需建立在高效、 稳定的植株组培再生体系的基础上。 0004 目前有关乌桕组培再生的研究已有报道， 主要集中在利用种子实生苗和幼胚为外 植体对乌桕植株进行快繁， 这种再生体系的建立对于多年生乌桕优良种质的保存和扩繁意 义不大。 另外， 有关利用带腋芽的茎段对乌桕优良株系进行快繁的研究， 普遍存在污染率 高、 褐化严重、 再生效率低等问题。 0005 专利(乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法， 公开号101057556， 公开日2007- 10-24)公开了以下技术方案:取乌桕种子去除种皮,双氧水表面消毒后接种到种子发芽培 养基中,长出完整的乌桕种子苗植株； 将乌桕种子苗的纵向一分为。
10、二的子叶块、 含未展开真 叶的顶芽以及下胚轴和根切段,分别接种在适合顶芽、 下胚轴和根等不定芽诱导培养基上, 通过直接诱导不定芽或经过愈伤组织诱导获得嫩绿色不定芽丛； 然后移入不定芽伸长培养 基,获得伸长不定芽幼苗； 再转入幼苗扩繁培养基进行扩大繁殖,将经扩繁的幼苗转接于生 根培养基上,长成真叶展开且根系发达的健壮乌桕试管植株,最后移栽到室外在自然条件 生长成活,得到乌桕的健壮苗,此种方法直接诱导丛生芽， 以种子实生苗为材料来源很难保 持母本植株优良性状， 诱导率为70-90。 0006 专利(一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法 ， 公开号 103004594A， 公开日2013。
11、-04-03)公开了以下技术方案： 首先取乌桕未成熟种子， 剥去果壳 后， 在无菌操作台内进行表面消毒； 然后剪开种壳取出未成熟合子胚， 用镊子进行部分损伤 后， 接种于胚状体诱导培养基中， 经过2个月左右黑暗培养， 获得2种经不同发育途径产生的 胚状体； 将两种胚状体接种在相应的诱导培养基中进行继代和增殖培养； 然后转至成苗培 养基上诱导成苗； 培养20-30d左右， 待幼苗长成2-4片叶子时， 进行炼苗移栽， 获得健壮的乌 说 明 书 1/7 页 3 CN 104957041 B 3 桕再生苗， 此种方法直接形成胚状体， 幼胚为杂合体， 作为材料来源很难保持母本植株优良 性状， 不利于后期。
12、的快繁研究， 诱导率为90。 0007 专利(一种乌桕叶盘高效再生的方法， 公开号104012416A， 公开日2014-09-03)用 优良乌桕株系离体无菌苗叶片为外植体， 通过直接诱导丛生芽发生来获得乌桕再生植株， 在此基础上一方面可以对乌桕优良株系进行快繁， 另一方面也可利用分子生物学手段对相 对优良的乌桕株系进行遗传改良； 但由于叶片较薄， 较嫩， 在进行基因工程操作(农杆菌浸 染或基因枪轰击)过程中容易受到机械损伤， 影响转化效果。 0008 叶柄相对于叶片而言耐受机械损伤能力较强， 适于进行遗传转化研究， 而目前尚 无有关以乌桕叶柄为外植体建立乌桕再生体系的研究， 上述报道和建立的。
13、乌桕再生体系并 不适于叶柄的组培再生。 本发明公开一种以野外优良单株为材料来源的叶柄直接和间接再 生体系， 为乌桕优良株系的快繁和遗传改良奠定基础。 发明内容 0009 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 运用植物组织培养技术， 提供一种利用 叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法。 该方法利用野外乌桕优良株系组培苗的叶柄为外 植体， 通过直接诱导不定芽和间接诱导愈伤组织两条途径建立乌桕高效再生体系， 不仅为 后期的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径， 而且为通过基因工程的方法对乌桕进行 遗传改良提供了支撑。 0010 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 0011 一种利用叶柄为外植体。
14、诱导乌桕植株再生的方法， 包括以下步骤： 0012 (1)对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、 培养， 获得乌桕无菌苗； 0013 (2)切取步骤(1)中所获得的无菌苗的叶柄作为外植体， 并接种于诱导培养基中诱 导不定芽或愈伤组织； 其中， 无菌苗的叶柄在接种于诱导培养基前切成0.30.6cm大小的 切段； 愈伤组织的诱导培养基为： MS+0.22.0mg/L NAA+0.21.0mg/L 6-BA+0.01 0.1mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 0014 (3)将步骤(2)中产生不定芽或产生愈伤组织的外植体， 转接于增殖培养基中分别 进行不定芽和愈。
15、伤组织的增殖培养； 其中， 不定芽的增殖培养基为： MS+0.22.0mg/L 6-BA +3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 愈伤组织的增殖培养基为： MS+1.03.0mg/L NAA+0.2 1.0mg/L 6-BA+0.010.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 0015 (4)将步骤(3)中增殖后的愈伤组织转入分化培养基中进行愈伤组织分化； 其中， 愈伤组织的分化培养基为： MS+0.52.0mg/L 6-BA+0.010.2mg/L IBA+3.0g/L蔗糖+ 0.7g/L琼脂， pH5.8； 0016 (5)将步骤(3)中增殖后。
16、的不定芽丛或步骤(4)中分化成不定芽点的愈伤组织转接 于不定芽的伸长培养基中， 进行不定芽的伸长； 其中， 不定芽的伸长培养基为： MS+0.2 1.0mg/L 6-BA+0.00.1mg/L IAA+0.010.1mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH 5.8； 0017 (6)待不定芽伸长后将其转到生根培养基中进行生根培养； 23周后， 待苗长至3 4cm,并伴有24个真叶时进行驯化、 移栽， 获得健壮的乌桕再生植株； 0018 其中， 所述步骤(2)中的不定芽的诱导培养基为： MS+2.04.0mg/L 6-BA+0.01 说 明 书 2/7 页 4 CN 1049。
17、57041 B 4 0.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 在乌桕叶柄再生的整个过程中除了叶柄 诱导愈伤组织的培养条件为232、 黑暗培养， 其它再生过程的培养条件均为232、 光 照培养， 光照强度20002200lx,光照时间为1216h。 0019 优选地， 所述步骤(4)中的愈伤组织转入分化培养基前切成(0.30.5)(0.3 0.5)cm2大小的切块。 0020 与现有技术相比， 本发明存在以下有益效果： 0021 本发明具有以下突出优点： 其一， 叶柄取材于野外乌桕优良株系再生的无菌苗， 一 方面能保持母本植株的种质特性； 另一方面可以避免野外直。
18、接取材污染率高的问题， 取材 方便、 无污染， 可以实现对野外乌桕优良单株的快繁； 其二， 再生过程简单、 高效， 通过简单 的激素配比调节， 可以同时建立两条不同的乌桕再生途径； 其三， 本发明中所用的叶柄外植 体较本发明人前期建立的叶片再生体系中所采用的叶片外植体健壮， 有较强的耐受基因工 程操作过程中机械损伤的能力， 适于农杆菌或基因枪介导的遗传改良。 因此， 本发明所提供 的一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法， 不仅为后期的乌桕优良株系的快繁提 供了新的技术途径， 而且为以后通过基因工程的方法对乌桕进行品种改良提供了技术支 持。 附图说明 0022 附图1为诱导前的乌桕叶柄切段。
19、。 0023 附图2为叶柄丛生芽的诱导。 0024 附图3为叶柄丛生芽的增殖。 0025 附图4为叶柄愈伤组织的诱导。 0026 附图5为叶柄愈伤组织的增殖。 0027 附图6为叶柄愈伤组织的分化。 0028 附图7为两种不同再生途径所获得的不定芽的伸长。 0029 附图8为乌桕无菌苗的生根。 0030 附图9为乌桕再生植株的移栽。 具体实施方式 0031 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。 0032 实施例1 0033 一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法， 具体操作如下： 0034 1、 对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、 培养， 获得乌桕无菌苗； 0035 2、 切取。
20、第1步骤所获得的无菌苗的叶柄作为外植体， 将叶柄切成0.5cm左右的切 段,接种于不定芽诱导培养基中， 于温度为25， 光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的 条件下进行不定芽的诱导(图1)， 其中所述的不定芽诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.1mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 0036 3、 光照培养23周后， 叶柄两端诱导出不定芽(图2)， 然后将产生不定芽的叶柄横 切一分为二， 转接于增殖培养中进行不定芽的增殖培养， 其中所述的不定芽增殖培养基为： MS+0.75mg/L 6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5。
21、.8； 说 明 书 3/7 页 5 CN 104957041 B 5 0037 4、 3周后， 将步骤3中增殖的不定芽丛(平均每个不定芽丛上有36.7个不定芽)(图 3)转接于不定芽伸长培养基中， 进行不定芽的伸长， 其中所述的不定芽的伸长培养基为： MS +0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 0038 5、 待丛生芽伸长到23cm(图7)， 进行生根培养， 待苗长至34cm,并伴有24个 真叶(图8)时， 移至土中进行驯化、 移栽， 获得健壮的乌桕再生植株(图9)。 0039 实施例2： 0040 一种利用叶柄为外植体诱导乌。
22、桕植株再生的方法， 具体操作如下： 0041 1、 对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、 培养， 获得乌桕无菌苗； 0042 2、 切取第1步骤所获得的无菌苗的叶柄作为外植体， 将叶柄切成0.5cm左右的切 段,接种于愈伤组织诱导培养基中， 于温度为25， 黑暗条件下诱导愈伤组织(图1)， 其中所 述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.0mg/L NAA+0.4mg/L 6-BA+0.05mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+ 0.7g/L琼脂， pH5.8； 0043 3、 黑暗培养23周后， 将产生愈伤组织的外植体(图4)转接于增殖培养中， 于温度 为25， 光照强度为2000lx,光照周。
23、期为12/12h的条件下进行愈伤组织增殖培养， 其中所述 的愈伤组织增殖培养基为： MS+2.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+0.01mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+ 0.7g/L琼脂， pH5.8； 0044 4、 培光照养2周后， 将增殖后的愈伤组织(图5)切成0.30.5cm2大小， 转接于分化 培养基上， 于温度为25， 光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下进行愈伤组织分 化研究， 所述的愈伤组织分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+3.0g/L蔗糖+ 0.7g/L琼脂， pH5.8； 0045 5、 培养34周后将步。
24、骤4中的愈伤组织分化所获得的不定芽丛(图6)， 转接于不定 芽伸长培养基中， 于温度为25， 光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下， 进行不 定芽的伸长， 其中所述的不定芽的伸长培养基为： MS+0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L GA3+ 0.01mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂， pH5.8； 0046 6、 待丛生芽伸长到23cm(图7)， 进行生根培养， 待苗长至34cm,并伴有24个 真叶(图8)时， 移至土中进行驯化、 移栽， 获得健壮的乌桕再生植株(图9)。 0047 对比试验 0048 表1中列出了已报道的以乌桕不同材料为外植体对乌。
25、桕株系进行再生的研究与本 发明所述的方法效果对比。 可以看出， 本发明具有无污染、 无褐化、 再生率高、 能保持母本株 系优良性状和有利于后期基因工程操作研究等优点， 具有明显的有益效果。 0049 表1： 相关研究与本发明效果对比 0050 说 明 书 4/7 页 6 CN 104957041 B 6 0051 说 明 书 5/7 页 7 CN 104957041 B 7 0052 0053 文献1： 韩珊， 石大兴等.红叶乌桕茎段离体培养的研究J .四川农业大学学报， 2006年9月第24卷第3期。 0054 文献2： 郄亚微， 徐有明等.能源林树种乌桕茎段离体培养与快速繁殖J .东北林 。
26、说 明 书 6/7 页 8 CN 104957041 B 8 业大学学报， 2009年12月第37卷第12期。 0055 文献3： 陈建勇， 李宝银等.乌桕茎段诱导组培快繁技术研究J .福建林业科技， 2009年6月第36卷第2期。 0056 文献4： 蒋祥娥， 欧阳绍湘等。 乌桕的组织培养及植株再生研究J.湖北林业科技， 2010.1,20-22。 0057 文献5： 蒋泽平， 倪竞德等.乌桕优选单株的离体快速繁殖技术研究J .江苏林业 科， 技2011年10月第38卷第5期。 0058 文献6： 陈佳， 陈凌艳等.乌桕离体快繁再生技术研究J.西南林业大学学报， 2013 年第33卷第6期。。
27、 0059 文献7： 毕君， 张往祥等.红叶乌桕组织培养技术研究J .中国农学通报， 2013,29 (28)： 60-65。 0060 文献8： 李建科等.野生乌桕的组培和再生J.北方园艺， 2010(13):164-166. 0061 文献9： 陈颖等.乌桕不同外植体高效再生探索J .西北植物学报， 2010,30(12)： 2542-2549。 0062 文献10： 田良涛.乌桕胚乳三倍体植株再生与转基因研究M .湖北大学硕士学位 论文,2011。 0063 专利1： 李霞， 何小兰 .乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法。 专利号： CN 100581352C。 0064 专利2： 吴丽。
28、芳， 侯金艳等.一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方 法。 专利号： CN 103004594A。 0065 专利3 ： 吴丽芳 ， 侯金艳等 .一种乌桕叶 盘高效再生的 方法。 公开号 ： CN 104012416A。 0066 以上所述的仅为本发明较佳的实例， 并不用以限制本发明。 本领域技术人员可以 根据本发明所述的内容进行显而易见的等同变换， 如不脱离本发明实质的基础上， 对个步 骤中的培养基成分在一定范围内作出一些调整， 仍然没有超出本发明的范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 104957041 B 9 图1 图2 图3 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 1/2 页 10 CN 104957041 B 10 图7 图8 图9 说 明 书 附 图 2/2 页 11 CN 104957041 B 11 。