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1、10申请公布号CN104080958A43申请公布日20141001CN104080958A21申请号201280060825122申请日2012101961/549,16220111019USC40B50/0620060171申请人纽亘技术公司地址美国加利福尼亚州72发明人克里斯阿穆尔74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人王思琪郑霞54发明名称用于定向核酸扩增和测序的组合物和方法57摘要本发明提供了用于定向核酸扩增和测序的方法和组合物。本发明进一步提供了用于构建定向CDNA文库的方法和组合物。该方法可包括A逆转录RNA样品以产生第一链CDNA；B由第一链CDNA产生。
2、第二链CDNA，其中四种DNTP中的至少一种即DATP、DCTP、DGTP或DTTP在第二链合成过程中被修饰的DNTP替代，并掺入第二链中，从而产生双链CDNA；C对该双链CDNA进行末端修复；D将衔接子连接至该双链CDNA，其中仅有一种衔接子具有掺入该衔接子的连接链中的修饰的DNTP；E进行缺口修复；和F用合适的裂解剂选择性裂解该第二链和具有修饰的DNTP的该衔接子的连接链。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014061086PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0612182012101987PCT国际申请的公布数据WO2013/059746EN2013042551I。
3、NTCL权利要求书4页说明书25页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书25页附图3页10申请公布号CN104080958ACN104080958A1/4页21一种用于构建定向CDNA文库的方法，其包括A逆转录RNA样品以产生第一链CDNA；B由所述第一链CDNA产生第二链CDNA，其中四种DNTP中的至少一种即DATP、DCTP、DGTP或DTTP在第二链合成过程中被修饰的DNTP替代并掺入所述第二链中，从而产生双链CDNA；C对所述双链CDNA进行末端修复；D将衔接子连接至所述双链CDNA，其中所述衔接子中仅有一种具有掺入所述衔接子的连接链中的修饰的D。
4、NTP；E进行缺口修复；和F用合适的裂解剂选择性裂解所述第二链和所述具有修饰的DNTP的衔接子，从而产生包含所述第一链CDNA的定向CDNA文库。2如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的DNTP包含DUTP。3如权利要求1所述的方法，其中所述方法任选地进一步包括在步骤C之前断裂所述双链CDNA。4如权利要求1所述的方法，其中步骤F包括裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分，从而形成脱碱基位点。5如权利要求4所述的方法，进一步包括在所述脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架。6如权利要求4所述的方法，其中所述裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分包括酶的使用。7如权利要求5所述的方法，其中所述在脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨。
5、架包括酶、化学剂和/或热的使用。8如权利要求7所述的方法，其中所述酶是内切核酸酶。9如权利要求8所述的方法，其中所述内切核酸酶是脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶APE。10如权利要求6所述的方法，其中所述酶包含糖基化酶。11如权利要求10所述的方法，其中所述糖基化酶为尿嘧啶N糖基化酶UNG或尿嘧啶DNA糖基化酶UDG。12如权利要求7所述的方法，其中所述化学剂包含伯胺。13如权利要求7所述的方法，其中所述化学剂包含多胺。14如权利要求13所述的方法，其中所述多胺包含N,N二甲基乙二胺DMED。15如权利要求1所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和多胺。16如权利要求1所述的方法，其中所述裂解剂包含糖。
6、基化酶和APE。17如权利要求1所述的方法，进一步包括扩增所述定向CDNA文库，从而产生扩增的产物。18如权利要求17所述的方法，其中所述定向CDNA文库的扩增包括聚合酶链式反应PCR、链置换扩增SDA、多重置换扩增MDA、滚环扩增RCA、单引物等温扩增SPIA或连接酶链式反应LCR。19如权利要求18所述的方法，其中所述扩增包括PCR。20如权利要求18所述的方法，其中所述扩增包括SPIA。权利要求书CN104080958A2/4页321如权利要求17所述的方法，进一步包括对扩增产物进行测序的附加步骤。22如权利要求21所述的方法，其中所述测序包括新一代测序。23如权利要求1所述的方法，进一。
7、步包括在逆转录后裂解所述RNA样品。24如权利要求23所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括在逆转录后使所述RNA样品暴露于RNASE。25如权利要求24所述的方法，其中所述RNASE为RNASEH。26如权利要求23所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括使所述RNA样品暴露于热或化学处理或其组合。27如权利要求1所述的方法，进一步包括从所述定向CDNA文库中减少或耗尽非期望的核酸序列。28如权利要求27所述的方法，其中所述非期望的核酸为核糖体RNARRNA。29一种用于全转录组定向测序的方法，其包括A逆转录RNA样品以产生第一链CDNA；B由所述第一链CDNA产生第二链CDNA，其中四种DN。
8、TP中的至少一种即DATP、DCTP、DGTP或DTTP在第二链合成过程中被修饰的DNTP替代并掺入所述第二链中，从而产生双链CDNA；C对所述双链CDNA进行末端修复；D将衔接子连接至所述双链CDNA，其中所述衔接子中仅有一种具有掺入所述衔接子的连接链中的修饰的DNTP；E进行缺口修复；F用合适的裂解剂选择性裂解所述第二链和具有所述修饰的DNTP的衔接子，从而产生包含所述第一链CDNA的定向CDNA文库；和G对所述定向CDNA文库进行扩增和/或测序。30如权利要求29所述的方法，其中所述修饰的DNTP包含DUTP。31如权利要求29所述的方法，其中所述方法任选地进一步包括在步骤C之前断裂所述。
9、双链CDNA。32如权利要求29所述的方法，其中步骤F包括裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分，从而形成脱碱基位点。33如权利要求32所述的方法，进一步包括在所述脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架。34如权利要求32所述的方法，其中所述裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分包括酶的使用。35如权利要求33所述的方法，其中所述在脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架包括酶、化学剂和/或热的使用。36如权利要求35所述的方法，其中所述酶是内切核酸酶。37如权利要求36所述的方法，其中所述内切核酸酶为脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶APE。38如权利要求34所述的方法，其中所述酶包含糖基化酶。39如权利要求38所述的方法，其中所述糖基化。
10、酶是尿嘧啶N糖基化酶UNG或尿嘧啶DNA糖基化酶UDG。权利要求书CN104080958A3/4页440如权利要求35所述的方法，其中所述化学剂包含伯胺。41如权利要求35所述的方法，其中所述化学剂包含多胺。42如权利要求41所述的方法，其中所述多胺包含N,N二甲基乙二胺DMED。43如权利要求29所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和多胺。44如权利要求29所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和APE。45如权利要求29所述的方法，其中对剩余的CDNA链的扩增包括聚合酶链式反应PCR、链置换扩增SDA、多重置换扩增MDA、滚环扩增RCA、单引物等温扩增SPIA或连接酶链式反应LCR。46。
11、如权利要求45所述的方法，其中所述扩增包括PCR。47如权利要求45所述的方法，其中所述扩增包括单引物等温扩增SPIA。48如权利要求29所述的方法，其中所述测序包括新一代测序。49如权利要求29所述的方法，进一步包括在逆转录后裂解所述RNA样品。50如权利要求49所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括在逆转录后使所述RNA样品暴露于RNASE。51如权利要求50所述的方法，其中所述RNASE为RNASEH。52如权利要求49所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括使所述RNA样品暴露于热或化学处理或其组合。53如权利要求49所述的方法，进一步包括从所述定向CDNA文库中减少或耗尽非期望的核酸序。
12、列。54如权利要求53所述的方法，其中所述非期望的核酸是核糖体RNARRNA。55一种试剂盒，其包含A一种或多种引物；B逆转录酶；C糖基化酶；D一种或多种衔接子，其中所述衔接子之一在所述衔接子的连接链中包含至少一种修饰的核苷酸。56如权利要求55所述的试剂盒，进一步包含所述试剂盒的书面使用说明书。57如权利要求55所述的试剂盒，进一步包含至少一种修饰的核苷酸或DNTP。58如权利要求55所述的试剂盒，进一步包含用于扩增的试剂。59如权利要求55所述的试剂盒，进一步包含用于测序的试剂。60如权利要求55所述的试剂盒，进一步包含多胺、APE或其组合。61如权利要求55所述的试剂盒，其中所述修饰的核。
13、苷酸包含DUTP，并且其中所述糖基化酶包含UNG。62如权利要求57所述的试剂盒，其中所述修饰的核苷酸包含DUTP。63一种用于构建定向CDNA文库的方法，其包括A由模板RNA合成第一和第二链CDNA，其中第一链CDNA或第二链CDNA的合成包括掺入修饰的DNTP，以产生双链CDNA；B对所述双链CDNA进行末端修复；C将衔接子连接至所述双链CDNA，其中所述衔接子中仅有一种具有掺入所述衔接子权利要求书CN104080958A4/4页5的连接链中的修饰的DNTP；D进行缺口修复；和E用合适的裂解剂选择性裂解所述第一或第二链CDNA和具有所述修饰的DNTP的衔接子，从而产生包含所述第一或第二链C。
14、DNA的定向CDNA文库。权利要求书CN104080958A1/25页6用于定向核酸扩增和测序的组合物和方法交叉引用0001本申请要求2011年10月9日提交的美国临时申请号61/549,162的权益，该临时申请通过引用并入本文。发明背景0002高通量、新一代测序技术的最新进展已经使得全基因组测序和功能基因组学的新方法成为可能，包括对任意转录组的全面分析。这些新一代测序方法之一涉及对由信使和结构RNA产生的互补DNACDNA的直接测序RNASEQ。RNASEQ提供了超越传统测序方法的几个关键优势。首先，其允许对所有表达的转录物进行高分辨率研究，从而注释出各转录物的5和3末端以及剪接点。其次，R。
15、NASEQ允许对每个细胞中的转录物的相对数进行定量。第三，RNASEQ提供了一种通过测量每种剪接变体的水平来测量和表征RNA剪接的途径。总之，这些进展已经提供了对个别细胞功能的新的了解。0003进行标准RNASEQ的一个缺点是缺乏有关转录方向的信息。为了RNASEQ而构建的标准CDNA文库由随机引物双链CDNA组成。在测序之前含有通用引发位点的衔接子的非定向连接导致有关哪条链存在于原始RNA模板中的信息丢失。虽然在一些情况下可以通过后续分析，例如通过使用编码蛋白质的转录物中的开放阅读框ORF信息，或者通过评估真核基因组中的剪接位点信息来推测链信息，但是关于起源链的直接信息是非常符合期望的。例如。
16、，为了将有义链指定至非编码RNA，以及在解析重叠的转录物时，就需要有关在原始RNA样品中存在哪条链的直接信息。0004最近已经针对链特异性RNASEQ开发了几种方法。这些方法可分成两大类。第一类利用相对于RNA转录物的5和3末端处于已知方向的不同衔接子。最终结果是CDNA文库，其中原始RNA的5和3末端的侧翼为两个不同的衔接子。该方法的缺点是只有克隆分子的末端保留了方向信息。对于长克隆的链特异性操作而言，这可能会存在问题，并且当存在断裂FRAGMENTATION时可能导致方向信息的丢失。0005第二类链特异性RNASEQ方法标记原始RNA例如，通过亚硫酸氢盐处理或转录的CDNA例如，通过修饰的。
17、核苷酸的掺入的一条链，随后使未标记的链降解。通过亚硫酸氢盐处理对RNA的链标记是劳动密集的，并且需要将测序读取值READS与参照基因组进行比对，所述参照基因组的两条链之一上的所有胞嘧啶碱基已经转换为胸腺嘧啶。由于亚硫酸氢盐处理过程中的碱基转换效率是不完美的，即小于100，使得该分析更加复杂。0006通过对CDNA的第二链进行修饰的链标记已经成为定向CDNA克隆和测序的优选方法LEVIN等人,2010。然而，CDNA第二链标记方法，如在WO2011/003630中所述的方法，当使用采用双链体衔接子的常规平端连接和CDNA文库构建策略其中由两个单独的衔接子引入两个通用测序位点时，不足以保留方向性信。
18、息。WO2011/000360中所述的标记方法采用由以下步骤组成的四步过程1可裂解核苷酸向CDNA插入物的一条链中的掺入，2CDNA插入物的末端修复，3含有通用测序位点的衔接子的非定向连接，和4具有非期望的衔接子方向的文库片段的选择性水解。为了保留方向性信息，该方法需要对选择进行扩增说明书CN104080958A2/25页7的链的5和3末端进行区别标记，例如，这可以通过定向即极性特异性的衔接子的连接或通过使用特化的叉状衔接子来实现，在该叉状衔接子中，双链多核苷酸的每一条链共价连接至两个不同的通用测序位点，在该链的每一端具有一个测序位点。当使用常规双链体衔接子时，WO2011/000360所述方。
19、法的应用不产生定向测序文库，因为标记的链，即已掺入可裂解核苷酸的链，在其5和3末端没有被区别标记。0007对于从利用常规双链体衔接子构建的CDNA文库进行定向CDNA测序的改进方法存在需求。本文所述的发明满足了这一需求。发明内容0008本发明提供了用于构建定向CDNA文库和进行定向CDNA测序的新方法、组合物和试剂盒。具体而言，本发明的一个重要方面是允许使用双链体衔接子和平端连接进行定向CDNA克隆和链保留，从而产生具有两个衔接子方向的连接产物的方法和组合物。在一个方面，本发明提供了一种克隆CDNA同时保留原始RNA样品的方向性和链信息的方法。在一些实施方案中，该方法包括A逆转录RNA样品以产。
20、生第一链CDNA；B由第一链CDNA产生第二链CDNA，其中四种DNTP中的至少一种即DATP、DCTP、DGTP或DTTP在第二链合成过程中被修饰的DNTP替代并掺入第二链中，从而产生双链CDNA；C对该双链CDNA进行末端修复；D将衔接子连接至该双链CDNA，其中仅有一种衔接子具有掺入该衔接子的连接链中的修饰的DNTP；E进行缺口修复；和F用合适的裂解剂选择性裂解第二链和具有修饰的DNTP的衔接子的连接链，从而产生包含第一链CDNA的定向CDNA文库。在另一方面，该方法任选地包括在对双链CDNA进行末端修复之前断裂该双链CDNA。在一个特定的实施方案中，该方法进一步包括扩增剩余的CDNA链。
21、或不包含修饰的核苷酸的CDNA链，从而产生扩增的产物。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包括对剩余的CDNA链或扩增产物进行测序。0009在另一方面，本发明提供了一种用于选择性去除处于非期望的方向的CDNA构建体的方法。0010在又一方面，本发明提供了一种用于全转录组定向测序的方法，其包括A逆转录RNA样品以产生第一链CDNA；B由第一链CDNA产生第二链CDNA，其中四种DNTP中的至少一种即DATP、DCTP、DGTP或DTTP在第二链合成过程中被修饰的DNTP替代并掺入第二链中，从而产生双链CDNA；C对该双链CDNA进行末端修复；D将衔接子连接至该双链CDNA，其中仅有一种衔接子具。
22、有掺入该衔接子的连接链中的修饰的DNTP；E进行缺口修复；F用合适的裂解剂选择性裂解第二链和具有修饰的DNTP的衔接子的连接链，从而产生包含第一链CDNA的定向CDNA文库；和H对该定向CDNA文库进行扩增和/或测序。在另一个方面，该方法任选地包括在对双链CDNA进行末端修复之前断裂该双链CDNA。0011在任一前述方面的一个方面中，本发明提供了裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分从而形成脱碱基位点。在一个优选的实施方案中，该修饰的核苷酸包含DUTP。在一些情况下，所述裂解剂包含糖基化酶。在一个优选的实施方案中，该糖基化酶包含UNG。在一些情况下，该裂解剂包含糖基化酶和内切核酸酶。在一些情况下，该内。
23、切核酸酶包含脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶APE。在一些情况下，该裂解剂包含糖基化酶和APE。在一些情况下，该裂解剂包含UNG和APE。在一些情况下，该裂解剂包含糖基化酶和多胺。在一个优选的实施方案中，该多胺为N,N二甲基乙二胺DMED。在一些情况下，该裂解剂包含糖基化酶和说明书CN104080958A3/25页8DMED。在一些情况下，该裂解剂包含UNG和DMED。0012在任一前述方面的另一个方面中，该方法进一步包括在去除修饰的核苷酸的碱基部分后，利用酶、化学剂和/或热在脱碱基位点处在磷酸二酯骨架中产生切口。在一些情况下，在去除修饰的核苷酸的碱基部分后在脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架包括使用酶。在。
24、一个优选的实施方案中，该酶是内切核酸酶。在一些情况下，该内切核酸酶包含脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶APE。在一些情况下，在去除修饰的核苷酸的碱基部分后在脱碱基位点处产生切口包括使用化学剂。在一些情况下，该化学剂包含伯胺或多胺。在一个优选的实施方案中，该多胺为N,N二甲基乙二胺DMED。0013在任一前述方面的另一个方面中，该方法进一步包括在RNA样品逆转录之后裂解该RNA样品。在一些情况下，裂解RNA样品包括使RNA样品暴露于RNASE。在一个优选的实施方案中，该RNASE为RNASEH。在一些情况下，裂解RNA样品包括使RNA样品暴露于热或化学处理或其组合。0014在任一前述方面的另一个方面中，。
25、该方法进一步包括减少或耗尽非期望的核酸序列。在一些情况下，非期望的核酸为核糖体RNARRNA。0015在任一前述方面的另一个方面中，对剩余CDNA链的扩增包括聚合酶链式反应PCR、链置换扩增SDA、多重置换扩增MDA、滚环扩增RCA、单引物等温扩增SPIA或连接酶链式反应LCR。在一些情况下，该扩增包括PCR。在一些情况下，该扩增包括SPIA。0016在任一前述方面的另一个方面中，对剩余CDNA链或从剩余CDNA链扩增的产物的测序包括新一代测序。0017用于执行本文所述的任意方法的试剂盒是本发明的另一特征。此类试剂盒可包括用于对核酸进行扩增、克隆和测序的试剂、酶和平台。在一个实施方案中，提供一。
26、种试剂盒，其包含A一种或多种引物；B逆转录酶；C糖基化酶；和D一种衔接子或几种衔接子，其中该衔接子中的一种在所述衔接子的连接链中包含至少一种修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，该试剂盒进一步包含用于扩增的试剂。在另一个实施方案中，该试剂盒进一步包含多胺、APE或其组合。在另一个实施方案中，该试剂盒进一步包含至少一种修饰的核苷酸或DNTP。在一些情况下，该修饰的核苷酸包含DUTP。在一些情况下，该糖基化酶包含UNG。在又一个实施方案中，该试剂盒进一步包含用于测序的试剂。试剂盒将优选地包括关于应用试剂盒组分以及使用不包括在该试剂盒中的任何其他试剂的说明。援引并入0018本说明书中所述的所有出版物、专。
27、利和专利申请均通过引用以相同的程度并入本文，犹如特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。附图说明0019本发明的新颖特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中0020图1显示了使用常规双链体衔接子即，其中连接产物具有两个衔接子方向和链标记构建非定向CDNA文库。0021图2显示了使用本发明的方法利用常规双链体衔接子构建定向链特异性CDNA说明书CN104080958A4/25页9文库。0022图3显示了总结使用本发明的方法的链保留效率数据的表格。0023图4显。
28、示了阐明使用本发明的方法产生定向CDNA文库的步骤的流程图。具体实施方式概述0024现将详细参考本发明的示例性实施方案。虽然将结合这些示例性实施方案来描述这些公开的方法和组合物，但应当理解，这些示例性实施方案并非意在限制本发明。相反，本发明意在涵盖可包括在本发明精神和范围内的备选方案、修改方案和等效方案。0025在一个实施方案中，本发明提供了用于构建定向CDNA文库的方法和组合物。本文所述的方法使用常规双链体衔接子和平端连接实现了定向CDNA克隆和链保留。该方法进一步能够产生可使用多种扩增方法进一步扩增的链特异性CDNA。在另一个实施方案中，本发明提供了用于全转录组定向测序的方法。在又一个实施。
29、方案中，本发明提供了用于产生定向的、RRNA耗尽的CDNA文库的方法和组合物。0026一个方面涉及一种用于产生定向CDNA文库的方法。该方法的第一步需要使用RNA样品或RNA模板，通过逆转录可由该RNA样品或RNA模板产生第一链CDNA。该RNA样品可来自于众多的本领域已知的来源，包括但不限于纯化或未纯化形式的信使RNAMRNA或核糖体RNARRNA，并且可以使用众多本领域已知的RNA依赖性DNA聚合酶进行逆转录。在一个实施方案中，该RNA模板可来自于DNA，包括但不限于基因组DNA，其中使用本领域已知的方法包括但不限于转录将DNA转化为RNA。在一个优选的实施方案中，如图4中所例示的，该RN。
30、A可以是POLYARNA。RNA样品的逆转录可使用包含与已知序列互补的序列或包含随机序列的引物进行。在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用的引物可以是包含DNA和RNA两者的复合引物。在一个优选的实施方案中，可使用随机六聚体引物对RNA样品进行逆转录。0027本文所述的用于产生定向CDNA文库的方法的第二步需要由第一链CDNA产生第二链CDNA，以形成双链CDNA。第二链合成可在修饰的DNTP的存在下进行。在一个优选的实施方案中，第二链合成可在DATP、DCTP、DGTP和代替DTTP的DUTP的存在下进行。在DUTP的存在下的第二链合成导致在第二链CDNA的链中掺入至少一个DUTP。第二链。
31、CDNA中的DUTP用来标记该第二链，因为在这种背景下DUTP是修饰的或非规范的DNTP。第二链合成可使用众多本领域已知的第二链合成方案来进行，包括但不限于利用RNASEH介导的切口平移结合DNA依赖性DNA聚合酶如DNA聚合酶I非KLENOW片段的那些方案。第二链合成还可使用可购买到的试剂盒如NEWENGLANDBIOLABSNEBNEXT第二链合成模块SECONDSTRANDSYNTHESISMODULE来进行。在第二链合成过程中产生的第二链CDNA产物也可被称为有义链产物，因为第二链CDNA的序列包含在模板RNA中发现的序列，而第一链CDNA也可被称为反义链产物。在另一个实施方案中，可在。
32、第一链合成后去除RNA模板之后进行第二链合成。RNA模板的去除可使用酶、热变性或化学变性来实现。酶介导的RNA模板的去除可利用RNASE，优选RNASEH，或酶的组合如RNASEH和RNASE1来进行。作为该实施方案的另一方面，可以使用包含与第一链产物中存在的序列互补的序列的引物，结合使用DNA依赖性DNA聚合酶来进行第二链合成。说明书CN104080958A5/25页100028在一个实施方案中，可在第二链合成后对第二链合成后产生的双链CDNA进行末端修复。末端修复可包括平端、非平端即黏性或粘性末端或单碱基突出端的产生，例如通过缺乏3外切核酸酶活性的聚合酶向双链DNA产物的3末端添加一个DA。
33、核苷酸。在一个优选的实施方案中，可对双链CDNA进行末端修复以产生平端，其中该双链CDNA包含5磷酸和3羟基。末端修复可使用众多本领域已知的酶和/或方法来进行，包括但不限于可购买到的试剂盒，如ENCORETMULTRALOWINPUTNGSLIBRARYSYSTEMI。0029在一个实施方案中，可在双链CDNA已断裂后进行末端修复。双链产物的断裂可通过本领域已知的方法来实现。可通过物理断裂方法和/或酶断裂方法实现断裂。物理断裂方法可包括喷雾、超声处理和/或流体动力剪切。在一个优选的实施方案中，双链CDNA的断裂通过超声处理来进行。用于进行酶断裂反应的试剂是可购买到的例如，来自NEWENGLAN。
34、DBIOLABS。0030在双链CDNA的末端修复后，本文所述的用于产生定向CDNA文库的方法包括将衔接子连接至双链CDNA。该衔接子可以是本领域已知的任何类型的衔接子，包括但不限于常规的双链体或双链衔接子。在一个优选的实施方案中，该衔接子可以是双链DNA衔接子。在一个实施方案中，该衔接子可以是已知序列的寡核苷酸，因此允许产生和/或使用序列特异性引物来对附加或连接有该衔接子的任何多核苷酸进行扩增和/或测序。优选地，该衔接子可以是可通过本领域已知的方法进行标记和选择的任何衔接子。在一个优选的实施方案中，该衔接子可通过掺入至少一种修饰的DNTP来标记。在一个优选的实施方案中，一种且仅一种衔接子包含。
35、修饰的DNTP，而其他或任何其他衔接子不包含修饰的DNTP。在一个优选的实施方案中，一种且仅一种衔接子在所述衔接子的连接链中包含修饰的DNTP，而其他或任何其他衔接子在所述衔接子的连接链中不包含修饰的DNTP。在一个实施方案中，该修饰的DNTP为DUTP。在一个优选的实施方案中，衔接子可以多个方向附加至双链产物。在一个优选的实施方案中，本文所述的方法可涉及使用两种包含已知序列的双链DNA的常规双链体衔接子，这两种常规双链体衔接子为平端的并且能够以两个方向之一结合至双链产物，其中一种衔接子包含掺入连接链中的修饰的DNTP，而另一种衔接子在连接链中不包含修饰的DNTP。在一个优选的实施方案中，该修。
36、饰的DNTP为DUTP。0031根据本文所述的方法，可通过平端连接将衔接子以两个方向中的任一方向连接至双链CDNA。衔接子之一包含掺入连接链中的修饰的DNTP优选DUTP，而另一种衔接子不包含掺入连接链中的修饰的DNTP优选DUTP。在一个实施方案中，衔接子与双链CDNA的连接在任一种衔接子的非连接链与双链CDNA的链之间产生缺口，从而各自衔接子的非连接链不与双链CDNA的链结合。对此，可使用众多本领域已知的方法进行缺口修复或补平反应，这些方法包括但不限于具有弱或无链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶的使用。0032在衔接子连接以及任选的缺口修复后，产生双链CDNA/衔接子复合物。该复合物随后。
37、可经历链选择。链选择可能需要对掺入双链CDNA的第二链中和一种且仅一种连接至该双链CDNA的衔接子的连接链中的修饰的DNTP进行碱基切除。对修饰的DNTP的碱基切除可使用酶、化学剂和/或热进行，并且在修饰的DNTP掺入核苷酸序列中的任何位置产生脱碱基位点。除碱基切除之外，本发明的方法可能还需要在脱碱基位点处裂解磷酸二酯键。磷酸二酯键也可被称为磷酸二酯骨架或DNA骨架。可使用众多的作用物AGENT包括酶、化学剂、热或其任意组合来进行DNA骨架的裂解。说明书CN104080958A106/25页110033碱基切除和/或DNA骨架的裂解导致包含修饰的DNTP的标记的第二链以及包含修饰的DNTP的一。
38、种衔接子的连接链被裂解或去除，而未标记的链和不含修饰的DNTP的衔接子的连接链保持完整。在这种情况下，碱基切除和/或DNA骨架裂解后双链CDNA的剩余链为第一链CDNA或反义链产物。此外，碱基切除和/或DNA骨架裂解还裂解或去除了包含修饰的DNTP的一种衔接子的连接链，无论所述连接链连接至双链CDNA的哪条链。可优先使用其序列与不包含修饰的DNTP的衔接子的连接链互补的引物来扩增剩余链。使用其序列与包含修饰的DNTP的衔接子的连接链互补的引物进行的扩增不产生产物，因为该连接链已经在碱基切除和/或修饰的DNTP裂解之后被裂解和/或去除。对剩余链的扩增可使用众多本领域已知的扩增技术进行，这些扩增技。
39、术包括但不限于聚合酶链式反应PCR。在剩余链扩增之后，可使用与不包含修饰DNTP的衔接子的连接链中存在的序列互补的引物，对扩增的产物进行测序，这确保了仅对未标记的第一链CDNA或链选择后保留的反义链产物进行测序。测序可直接对剩余的CDNA和/或对由剩余链的扩增产生的产物进行。可使用任何本领域已知的测序方法进行测序，这些方法包括但不限于新一代测序方法。如上所述的本发明的方法由于对有义链产物第二链CDNA的标记和裂解或去除，导致包含反义方向的CDNA或第一链CDNA的定向CDNA文库的产生。0034在另一个实施方案中，可在对剩余链进行扩增和/或测序之前去除裂解的或降解的标记链。在一个优选的实施方案。
40、中，可在对剩余的第一链CDNA或反义产物进行扩增和/或测序之前去除裂解的第二链和包含修饰DNTP的一种衔接子的裂解的连接链。在又一个优选的实施方案中，剩余的第一链CDNA反义产物可在扩增和/或测序之前进行纯化。对剩余链的纯化可使用本领域已知的用于纯化CDNA的方法进行，如可从QIAGEN和/或ROCHE购买到的试剂盒。0035在一个备选的实施方案中，本文所述的方法可用于产生包含有义方向的CDNA或第二链CDNA的定向CDNA文库。在该实施方案中，本文所述的方法可如上所述进行，不同之处在于，与如上所述的第二链合成相反，从RNA模板进行的第一链合成可在修饰的DNTP的存在下进行，而第二链合成是在未。
41、修饰的DNTP或经典DNTP的存在下进行的。在该实施方案的一个方面，可在第二链合成之前将包括在第一链合成过程中使用的任何和所有修饰DNTP在内的DNTP去除、洗掉或用未修饰的DNTP替代。作为该实施方案的另一方面，在第二链合成过程中可以使用未修饰的DNTP。在一个优选的实施方案中，该修饰的DNTP包含DUTP。可以选择性裂解或去除用修饰DNTP标记的并且连接至在所述衔接子的连接链中包含修饰DNTP的一种且仅一种衔接子上的反义链产物第一链CDNA。因此，可用于下游扩增和/或测序的剩余链和连接的衔接子包含有义链产物，该有义链产物连接至在所述衔接子的连接链中不包含修饰DNTP的衔接子。0036图2中。
42、示出了本文所述的用于产生定向链特异性CDNA文库并对其进行测序的方法的一个优选实施方案的示意图。总的来说，图2中所示的方法允许确定用来产生CDNA的模板RNA的链方向，相对于图1所示的常规方法具有提高的效率。在图1和图2中所示的方法均使用CDNA的链标记和常规双链体衔接子与由模板RNA产生的CDNA的平端连接作为确定链方向的手段。在图1和图2中，该方法包括将双链双链体衔接子图1和图2中的P1/P2平端连接至由RNA样品形成的双链CDNA复合物，其中第二链产物由于其互补于RNA模板并且与RNA模板具有相同的链方向而也被称为有义链产物，通过在第二链合成过程中说明书CN104080958A117/2。
43、5页12掺入DUTP进行标记。在图1和图2所示的优选的实施方案中，双链体衔接子不含游离的5磷酸基团。因此，两种衔接子P1/P2包含与双链CDNA上的游离5磷酸连接的链连接链和不与双链CDNA连接的链非连接链。可通过使用本领域已知的酶即T4DNA连接酶和方法来促进连接，包括但不限于可购买到的试剂盒，如ENCORETMULTRALOWINPUTNGSLIBRARYSYSTEM。在图2所示的本发明的一个优选实施方案中，一种且仅一种衔接子P2的连接链通过掺入DUTP进行标记。如图1和图2所示，双链体衔接子的连接可在两个方向之一上发生。在图1和图2左侧的示意图中，P2衔接子的连接链连接至标记的有义链第二。
44、链产物。在图2右侧的示意图中，P2衔接子的连接链连接至未标记的反义链第一链产物。0037在图1和图2中所示的方法中，双链体衔接子为非磷酸化的并因此不含游离的5磷酸基团。因此，两种衔接子P1/P2含有将与双链CDNA上的游离5磷酸连接的链连接链和不与双链CDNA连接的链非连接链，并因此留下缺口。这样，在任一方向上，含有连接的衔接子的双链CDNA经历缺口修复或补平修复优选地利用DNA依赖性DNA聚合酶，如TAQDNA聚合酶，以便通过使用各自的连接链作为模板，对双链体衔接子的非连接链的序列进行DNA依赖性DNA聚合酶介导的合成，来补平该缺口。0038在图1和图2中，缺口修复后通过用裂解剂可以是酶处理。
45、进行碱基切除。在图1和图2所示的一个实施方案中，可利用诸如UNG的酶进行碱基切除。在一个优选的实施方案中，碱基切除后可使用酶、化学剂和/或热在碱基裂解位点处裂解磷酸二酯或DNA骨架。在图1中，碱基切除导致标记的有义链产物的裂解，而两种衔接子保持完整。在图2中，碱基切除导致标记的有义链产物和在所述衔接子的连接链中已掺入DUTP的一种衔接子被裂解，而在连接链中未掺入DUTP的衔接子保持完整。在图1和图2中，可将标记的有义链产物或第二链产物裂解，并因此仅有反义链产物或第一链产物在碱基切除后得以保留。0039与其中两个衔接子方向在碱基切除后均保持完整的图1相比，图2左侧的示意图显示，标记的有义链产物可。
46、与连接至有义链产物的P2衔接子的标记连接链一起裂解。这样，只有反义链产物和连接至反义链的衔接子图2中的P1的连接链保持完整并可用于下游处理。在一个优选的实施方案中，下游处理需要对剩余的CDNA链或反义链产物进行扩增。与其中可使用与P1衔接子P1AMP或P2衔接子P2AMP的任一连接链中包含的序列互补的引物扩增反义链产物的图1相比，图2显示反义链产物的扩增仅能够使用与P1衔接子P1AMP的连接链中包含的序列互补的引物进行。在一个优选的实施方案中，下游处理还可能需要对反义链产物第一链产物和/或扩增产物进行测序。在图1中，使用与P1衔接子的连接链中的序列互补的引物的下游测序将对相对于RNA模板的有义。
47、链或反义链进行测序。在图2中，使用与P1衔接子的连接链中的序列互补的引物的下游测序将仅对相对于RNA模板的反义链进行测序。0040图4显示了一张流程图，描绘了用于产生定向链特异性CDNA文库的方法的一个实施方案。该方法包括以下步骤通过对POLYARNA进行随机引物逆转录而产生第一链CDNA；使用DATP、DCTP、DGTP和代替DTTP的DUTP，利用DNA依赖性DNA聚合酶产生第二链CDNA；使用超声处理将双链CDNA断裂；对纯化的断裂的双链CDNA进行末端修复以产生平端；连接双链体衔接子，其中一种双链体衔接子的一条连接链通过掺入DUTP进行标记；对连接产物进行切口修复以产生含有连接的衔接子。
48、的双链CDNA；使用酶和/或化学剂对纯化的含有说明书CN104080958A128/25页13连接的衔接子的双链CDNA进行链选择；使用PCR扩增剩余的CDNA链。0041在任一上述实施方案的一个方面中，可耗尽通过本文所述的方法产生的定向CDNA文库中的非期望核酸序列。在一个实施方案中，非期望的核酸包含RNA。在一个优选的实施方案中，非期望的核酸包含核糖体或RRNA。从通过本发明的方法产生的定向CDNA文库中去除或耗尽RRNA可通过本领域已知的任何方法进行，这些方法包括但不限于，从起始群体中去除RRNA，使用OLIGODT引物的差别引发即，仅引发聚腺苷酸化的转录物，和/或其中在引物池中特异性消。
49、除与RRNA序列互补的引物的差别引发不太随机的或NSR引物方法。0042通常，本文所述的方法可用于产生核酸文库，该核酸文库优先群集相对于用来产生该文库的核酸模板处于特定链方向的核酸。通过本文所述的方法产生的核酸文库可用于确定核酸模板的方向性和链方向。在一个实施方案中，该核酸模板可以是RNA模板，并且该核酸文库可以是CDNA文库。在一个优选的实施方案中，该RNA模板可以是非RRNA。在又一个优选的实施方案中，该RNA模板可以是RRNA。在本文所述的方法的一个方面中，该CDNA文库可以是保留属于原始RNA模板或样品的方向性和链信息的定向CDNA文库，也就是说，本发明方法的定向文库代表了由第一链CDNA或模板RNA的逆转录或第二链CDNA第一链CDNA的拷贝产生的产物。本发明的方法提供了用于排他性地保留第一链CDNA产物或第二链CDNA产物的手段，因此能够指定从基因组DNA转录的方向性。转录的方向性由对在序列信息中呈现哪条CDNA链第一或第二链的了解来推断。RNA模板的方向性和链信息可指衍生出或转录出RNA模板的基因组DNA的链。作为本文所述的方法的另一方面，定向CDNA文库可用于通过将定向CDNA文库中CDNA的序列与RNA模板和/或基因组DNA进行比较来确定转录的方向性。比较核苷酸序列的方法是本领域已知的，并且可以包括公知的核苷酸序列比对程序或算。