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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510894222.7 (22)申请日 2015.12.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105494092 A (43)申请公布日 2016.04.20 (73)专利权人 杭州市农业科学研究院 地址 310024 浙江省杭州市西湖区转塘街 道杭新路东1号 (72)发明人 钱丽华 马华升 姜慧燕 张乐 王贤波 刘洋 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限 公司 33246 代理人 周希良 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01。
2、) (56)对比文件 CN 103299907 A,2013.09.18, CN 101103700 A,2008.01.16, 钱丽华.三叶青的离体快速繁殖. 植物生理 学通讯 .2008,第44卷(第1期),第121-122页. 钱丽华.三叶青不定根组培快繁体系的建立 与应用研究. 浙江大学硕士学位论文 .2015, 钱丽华.三叶青不定根组培快繁体系的建立 与应用研究. 浙江大学硕士学位论文 .2015, 彭昕等.培养条件对三叶青愈伤组织生长及 总黄酮含量的影响. 药物生物技术 .2012,第19 卷(第2期),第138-141页. 审查员 方晓云 (54)发明名称 三叶青不定根的诱导及繁。
3、殖方法 (57)摘要 本发明公开了三叶青不定根的诱导及繁殖 方法， 按如下步骤进行：（1） 愈伤组织的诱导： 将 从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净， 在超净工 作台上用乙醇消毒后转入升汞消毒， 然后用无菌 水冲洗， 后切割， 正面朝上平放于诱导培养基上， 271黑暗培养。（2） 愈伤组织的增殖： 将步骤 （1） 获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小 块， 接种于增殖培养基上， 271黑暗培养。（3） 愈伤组织分化不定根的诱导： 将步骤 （2） 获得的 愈伤组织在超净工作台上切割成小块， 接种于不 定根诱导培养基上， 271黑暗培养。（4） 不定 根的繁殖： 将步骤 （3） 获得的不定根在超净工。
4、作 台上切割成设定的长度， 接种于不定根增殖的液 体培养基中， 黑暗培养后转入光照培养。 权利要求书1页 说明书3页 CN 105494092 B 2018.04.20 CN 105494092 B 1.三叶青不定根的诱导及繁殖方法， 其特征是按如下步骤进行： (1)愈伤组织的诱导： 将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净， 在超净工作台上用乙醇 消毒后转入升汞消毒， 然后用无菌水冲洗， 后切割， 正面朝上平放于诱导培养基上， 271 黑暗培养； 诱导培养基配方为MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-16-BA+0.2mgL-1NAA+6.5gL-1 琼脂； (2)愈伤组织的增殖： 将步骤(1)获。
5、得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块， 接种于 增殖培养基上， 271黑暗培养； 愈伤组织增殖培养基为MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-16- BA+0.2mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂； (3)愈伤组织分化不定根的诱导： 将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小 块， 接种于不定根诱导培养基上， 271黑暗培养； 不定根诱导培养基为3/4MS+20gL-1蔗 糖+1.0mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂； 所述步骤(3)中， 作为诱导不定根的愈伤组织材料以在 步骤(2)的增殖培养上继代增殖5次为宜， 培养周期30d， 培养温度271黑暗培养； (4)不定根的繁殖： 将步骤。
6、(3)获得的不定根在超净工作台上切割成设定的长度， 接种 于不定根增殖的液体培养基中， 黑暗培养后转入光照培养； 不定根增殖培养基为1/2MS+ 30gL-1蔗糖+2.0mgL-1IBA+0.8mgL-1NAA+0.5mgL-16-BA+苯丙氨酸60mgL-1+6.5g L-1琼脂， 培养方式为黑暗培养30d后转入全光照培养15d， 一个培养周期内不定根鲜重增长 倍数达到9.351.05倍， 总黄酮含量经亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定达到69.031.39mg g-1DW-1。 2.如权利要求1所述三叶青不定根的诱导及繁殖方法， 其特征是： 步骤(1)中， 乙醇浓度 为75， 浸泡叶片30s， 转。
7、入0.1升汞浸泡消毒10min。 3.如权利要求1所述三 叶青不定根的诱导及繁殖方法， 其特征是： 步骤(3)中， 作为诱 导不定根的愈伤组织材料以在步骤(2)的增殖培养上继代增殖5次为宜， 培养周期30d， 培养 温度271黑暗培养， 不定根诱导率达到99.0， 平均单个愈伤块分化的不定根数量达到 13.77根， 平均单个愈伤块分化的不定根质量达到30.70mg。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105494092 B 2 三叶青不定根的诱导及繁殖方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种三叶青不定根的诱导及繁殖方法。 背景技术 0002 三叶崖爬藤(Tetr。
8、astlgma hemsleyanum Diels et Gilg)是中国特有的珍稀药用 植物， 主要以块根入药， 性凉、 无毒、 味甘微苦， 在小儿高热、 扁桃体炎、 支气管炎、 肺炎、 咽喉 炎、 肝炎、 病毒性脑膜炎等方面疗效显著， 还在类风湿性关节炎、 妇科疾病血崩、 白带、 血液 病、 心脑血管疾病、 毒蛇咬伤、 痈疽、 肛裂及抗艾滋病毒和抗肿瘤等临床治疗方面有很好的 疗效， 有 “植物青霉素” 之称。 已研究发现三叶青的黄酮提取物对H-22、 SMMC-7721和HepG2肝 癌细胞、 A549肺癌细胞、 SGC一7901人胃癌细胞、 结肠癌细胞系RKO细胞和HT-29细胞、 艾氏。
9、 瘤、 S180肉瘤瘤株、 白血病细胞株系HL60、 K562、 人恶性黑色素瘤A375细胞、 人宫颈癌 Hela229细胞、 人胃腺癌AGS细胞、 人膀胱癌5637细胞均有一定的抑制或促凋亡作用， 具有保 肝护肝、 抗病毒、 消炎镇痛解热等药理作用， 对关节炎、 痛经也有一定的治疗作用。 0003 三叶青因其药理研究发现和显著的临床疗效， 医学需求在持续增强， 但由于人为 过度采掘， 导致现有野生资源已处于濒危状态， 被列为浙江省濒危植物目录。 因此， 对三叶 青资源的保护和可持续利用刻不容缓。 0004 目前， 三叶青的驯化栽培、 离体扦插及组培快繁技术问题都已基本解决， 但其人工 栽培中。
10、药用部位葫芦块根块根生产技术存在严重的瓶颈制约。 因此， 为切实保护三叶青有 限的野生资源和人工栽培资源， 解决市场供需矛盾， 利用生物技术手段来生产三叶青药用 功能成分的研究显得尤为迫切。 而不定根培养技术作为新发展起来的技术具有次生代谢物 产量稳定、 快速而成为根用类药用植物生产次生代谢物的主要途径。 发明内容 0005 本发明公开了一种三叶青不定根的诱导及繁殖方法， 其能获得高生物量和黄酮含 量的不定根， 且可以周年生产， 不受季节和气候因素的限制。 0006 本发明通过对三叶青叶片诱导的愈伤组织进行不定根的诱导、 增殖、 高效培养生 产组培次生代谢物黄酮类化合物的关键技术研究， 形成三。
11、叶青组培不定根培养黄酮类化合 物的技术方案， 为今后工业化生产三叶青中抗肿瘤功能物质黄酮类化合物打好基础， 以期 为后续开发抗肿瘤药物生产解决原料需求问题。 0007 为达到上述目的， 本发明采取以下技术方案： 0008 三叶青不定根的诱导及繁殖方法， 其按如下步骤进行： 0009 (1)愈伤组织的诱导： 将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净， 在超净工作台上用 乙醇消毒后转入升汞消毒， 然后用无菌水冲洗数次(如56次)， 切割后正面朝上平放于诱 导培养基上， 271黑暗培养数天(如30d)； 0010 (2)愈伤组织的增殖： 将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块， 接 种于增殖培。
12、养基上， 271黑暗培养数天(如30d)； 说 明 书 1/3 页 3 CN 105494092 B 3 0011 (3)愈伤组织分化不定根的诱导： 将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割 成小块， 接种于不定根诱导培养基上， 271黑暗培养数天(如30d)； 0012 (4)不定根的繁殖： 将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成一定长度(如 1cm左右)， 接种于不定根增殖的液体培养基中， 黑暗培养后转入光照培养。 0013 优选的， 步骤(1)中， 乙醇浓度为75， 浸泡叶片30s， 转入0.1升汞浸泡消毒 10min， 诱导培养基配方为MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-1。
13、6-BA+0.2mgL-1NAA+6.5gL-1琼 脂。 0014 优选的， 步骤(2)中， 愈伤组织增殖培养基为MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-16-BA+ 0.2mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂。 0015 优选的， 步骤(3)中， 作为诱导不定根的愈伤组织材料以在步骤(2)的增殖培养上 继代增殖5次为宜， 不定根诱导培养基为3/4MS+20gL-1蔗糖+1.0mgL-1NAA+6.5gL-1琼 脂， 培养周期30d， 培养温度271黑暗培养。 0016 优选的， 步骤(4)中， 不定根增殖培养基为1/2MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-1IBA+ 0.8mgL-1NAA+0。
14、.5mgL-16-BA+苯丙氨酸60mgL-1+6.5gL-1琼脂， 培养方式为黑暗培养 30d后转入全光照培养15d。 0017 本发明采用三叶青叶片诱导出愈伤组织、 再利用愈伤组织诱导不定根然后进行扩 繁， 达到不定根的高生物量和黄酮含量。 0018 利用本发明技术方案不定根的诱导率达到99.0， 平均单个愈伤块分化的不定根 数量达到13.77根， 平均单个愈伤块分化的不定根质量达到30.70mg， 一个培养周期内不定 根鲜重增长倍数达到9.351.05倍， 总黄酮含量经亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定达到69.03 1.39mgg-1DW-1。 为今后工业化生产三叶青中抗肿瘤功能物质黄酮类化合。
15、物奠定了基 础， 同时可解决三叶青原料的供需矛盾问题。 具体实施方式 0019 下面对本发明优选实施例作详细说明。 0020 本实施例三叶青不定根诱导及繁殖方法， 其按如下步骤进行： 0021 (1)愈伤组织的诱导： 将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净， 在超净工作台上用 乙醇消毒后转入升汞消毒， 然后用无菌水冲洗56次， 切割成0.5cm0.5cm左右大小， 正面 朝上平放于诱导培养基上， 271黑暗培养30d。 本步骤中， 乙醇的浓度为75， 浸泡叶片 30s， 转入0.1升汞浸泡消毒10min， 诱导培养基配方为MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-16-BA+ 0.2mgL-1NAA+。
16、6.5gL-1琼脂。 0022 (2)愈伤组织的增殖： 将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块， 接 种于增殖培养基上， 271黑暗培养30d。 本步骤中， 愈伤组织增殖培养基为MS+30gL-1蔗 糖+2.0mgL-16-BA+0.2mgL-1NAA+6.5gL-1琼脂。 0023 (3)愈伤组织分化不定根的诱导： 将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割 成小块， 接种于不定根诱导培养基上， 271黑暗培养30d。 本步骤中， 作为诱导不定根的 愈伤组织材料以在步骤(2)的增殖培养上继代增殖5次为宜， 不定根诱导培养基为3/4MS+ 20gL-1蔗糖+1.0mgL-1NAA。
17、+6.5gL-1琼脂， 培养周期30d， 培养温度271黑暗培养。 0024 (4)不定根的繁殖： 将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成1cm左右长度， 说 明 书 2/3 页 4 CN 105494092 B 4 接种于不定根增殖的液体培养基中， 黑暗培养后转入光照培养。 本步骤中， 不定根增殖培养 基为1/2MS+30gL-1蔗糖+2.0mgL-1IBA+0.8mgL-1NAA+0.5mgL-16-BA+苯丙氨酸60mg L-1+6.5gL-1琼脂， 培养方式为黑暗培养30d后转入全光照培养15d。 0025 本发明以三叶青叶片为材料诱导出愈伤组织， 再通过愈伤组织诱导分化出不定 。
18、根， 以此不定根为材料进行扩繁并合成黄酮类化合物， 技术流程清晰， 通过该技术方法， 不 定根的诱导率达到99.0， 平均单个愈伤块分化的不定根数量达到13.77根， 平均单个愈伤 块分化的不定根质量达到30.70mg， 一个培养周期内不定根鲜重增长倍数达到9.351.05 倍， 总黄酮含量经亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定达到69.031.39mgg-1DW-1。 0026 本领域普通技术人员应当认识到， 以上实施例仅是用来说明本发明， 而并非作为 对本发明的限定， 只要在本发明的范围内， 对以上实施例的变化、 变型都将落入本发明的保 护范围。 说 明 书 3/3 页 5 CN 105494092 B 5 。