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1、10申请公布号CN104073567A43申请公布日20141001CN104073567A21申请号201410343467622申请日20140718C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12R1/0120060171申请人昆明滇龙生物医药科技有限公司地址650051云南省昆明市俯路296号昆明理工大学国家科技园创业大厦9320室72发明人邓先余林连兵夏雪山74专利代理机构昆明正原专利商标代理有限公司53100代理人金耀生54发明名称牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌基因诊断试剂盒及检测方法57摘要本发明提供一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌（PASTEURELLAMULTOCID。
2、A）的基因诊断试剂盒及检测方法，属于生物科学技术领域。该试剂盒及检测方法是以多杀性巴氏杆菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应（PCR）技术，对牛的病原菌多杀性巴氏杆菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于牛巴氏杆菌病的临床检测，也用于牛各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，还可以用于牛养殖环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104073567ACN104073567A1/1页21牛重。
3、大病原菌多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板；所述的A液为样品稀释液，内装无菌生理盐水，5管，每管5ML；所述的B液为PCR反应液，1管，内装192LPCR扩增反应液，包括168LDDH2O、144L含MG2的10BUFFERTRISHCL100MMOL/L、PH为90,KCL500MMOL/L,MGCL215MMOL/L,TRITONX1001、32L浓度为250MOL/L的DNTP、24L浓度为05MOL/L引物PMF、24L浓度为05MOL/L引物PMR和16L酶活单位为8U的TAQE；PMF为5ACGCTTTGCCTTGCAAGATAC3。
4、,PMR为5GATTCACGTAACAAACCAGGC3；所述的C液为阳性对照液，1管，内装50L多杀性巴氏杆菌阳性模板；所述泡沫板装于盒子中，其大小与盒子的底面相同；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。2一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行步骤（1），取被检标本的新鲜含DNA样品，加入样品稀释液，稀释1020倍，冰浴匀浆；步骤（2），将匀浆后的样品下离心，得到离心后样品的上层清液；步骤（3），将200L离心后样品的上层清液煮沸10MIN，然后立刻放于冰上510MIN冷却；步骤（4），将冷却后的样品离心。
5、，取上层清液作为PCR模板；步骤（5），分别取体积比为11的PCR模板和C液，各加入到PCR反应液中，PCR模板与PCR反应液的体积比为124，C液与PCR反应液的体积比为124，混匀后2000R/MIN离心5秒，置于PCR仪上；步骤（6），按下列条件扩增95预变性3MIN，94变性1MIN，55退火45SEC，72延伸1MIN，34个循环，72延伸10MIN，保存于4，得到扩增产物；步骤（7），反应结束后取510L扩增产物，加2L溴酚蓝混匀，经1琼脂糖凝胶电泳2030分钟后于紫外仪上观察，若在300BP处出现明亮的反应条带，则为多杀性巴氏杆菌阳性；若无反应条带显示则为阴性。3根据权利要求2所。
6、述的牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于所述的新鲜含DNA样品为新鲜鼻腔拭子液。4根据权利要求2所述的牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于所述的冰浴匀浆是在无菌匀浆器中。5根据权利要求2所述的牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于所述的步骤（2）匀浆后的样品离心的速度为30004000R/MIN，时间为510MIN。6根据权利要求2所述的牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于所述的步骤（4）冷却后的样品离心的速度为30004000R/MIN，时间为510MIN。权利要求书CN104073567A1/5页3牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌基因诊断试剂盒及检测。
7、方法0001技术领域0002本发明属于生物科学技术领域，具体涉及牛重大病原菌的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对多杀性巴氏杆菌（PASTEURELLAMULTOCIDA）基因诊断的试剂盒及检测方法。背景技术0003牛巴氏杆菌病又称为牛出血性败血症，是牛的一种急性、热性传染病，以发生高热、肺炎和内脏器官广泛出血为特征。病原为多杀性巴氏杆菌,菌体为细小、两端钝圆的球杆状或短杆状菌，大小为115M0306M，多散在、无运动性、不形成芽胞，革兰氏染色阴性。多杀性巴氏杆菌对各种畜禽和野生动物都有致病性，不分年龄均可发生。牛群以黄牛、奶牛易感，其中青、壮年奶牛最易感，牦牛发病较少见。根据临床症状可分为败血型。
8、、浮肿型和肺炎型。但败血型以猝死为特征，而水肿型和肺炎型是在败血型的基础上发展而来的，因此在临床上以肺炎型为主的混合型最为常见。0004败血型病牛常突然发病而死亡。表现体温升高，达4142，心跳加快，精神沉郁，食欲减退或废绝，随后开始腹泻，呈粥样或水样，粪中混有粘液或血液，并有腹痛，不久体温下降而迅速死亡。病程很短，为1224H。常来不及查清病因和治疗，牛就死亡。0005水肿型常发热，精神沉郁，反刍停止，流涎，流泪，流粘液样鼻汁，下颌和颈部发生炎性水肿，水肿还可蔓延到前胸、舌及周围组织。常伴有咳嗽，呼吸困难。后期倒地，体温下降，最后窒息死亡。病程为数小时至2D。0006肺炎型主要是纤维素性胸膜。
9、肺炎症状。表现体温升高，呼吸促迫，继而呼吸困难，严重的头颈前伸，张口呼吸，黏膜发绀；流泡沫样鼻汁，有时带血，后变粘液脓性；咳嗽，胸部听诊有啰音，有时听到摩擦音，叩诊有浊音区，触诊有痛感。病初便秘，后期腹泻，粪中有血，有恶臭味。病程为37D左右。病死率高达80以上。0007可以说多杀性巴氏杆菌是细菌中对牛健康安全危害最大的种类之一，给牛养殖业带来较大的危害。多杀性巴氏杆菌引起的牛出血性败血症具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此对多杀性巴氏杆菌病应以预防为主，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对多杀性巴氏杆菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生。
10、理生化鉴定法、免疫学方法（主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法（ELISA）、免疫电镜技术、分子生物学方法（主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态（RELP）等。但是这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大兽医和牛养殖业主掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。0008早期快速诊断牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌是目前预防牛出血性败血症暴发流行的主要措施和牛养殖业减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的说明书CN104073567A2/5页4诊断试剂盒及其检测方法是广大兽医工作者和牛养殖。
11、者急切盼望的。0009多聚酶链式反应（POLYMERASECHAINREACTION，简称PCR技术），是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。发明内容0010本发明的目的是利用多杀性巴氏杆菌毒素基因（TOXA）保守序列设计的一对引物，建立多杀性巴氏杆菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于牛出血性败血症的临床检测，也可用牛养殖过程中的细菌跟踪检测，也还可以用于养殖环境监测，。
12、避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。0011本发明采用的技术方案如下牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒，该试剂盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板；所述的A液为样品稀释液，内装无菌生理盐水，5管，每管5ML；所述的B液为PCR反应液，1管，内装192LPCR扩增反应液，包括168LDDH2O、144L含MG2的10BUFFERTRISHCL100MMOL/L、PH为90,KCL500MMOL/L,MGCL215MMOL/L,TRITONX1001、32L浓度为250MOL/L的DNTP、24L浓度为05MOL/L引物PMF、24L浓度为05MOL/L引物PMR和16L酶活单位为8U的。
13、TAQE；PMF为5ACGCTTTGCCTTGCAAGATAC3,PMR为5GATTCACGTAACAAACCAGGC3；所述的C液为阳性对照液，1管，内装50L多杀性巴氏杆菌阳性模板；所述泡沫板装于盒子中，其大小与盒子的底面相同；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。本发明还提供一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，使用上述试剂盒，按下列步骤进行步骤（1），取被检标本的新鲜含DNA样品，加入样品稀释液，稀释1020倍，冰浴匀浆；步骤（2），将匀浆后的样品下离心，得到离心后样品的上层清液；步骤（3），将200L离心后样品的上层清液煮沸10MIN，然后立刻放。
14、于冰上510MIN冷却；步骤（4），将冷却后的样品离心，取上层清液作为PCR模板；步骤（5），分别取体积比为11的PCR模板和C液，各加入到PCR反应液中，PCR模板与PCR反应液的体积比为124，C液与PCR反应液的体积比为124，混匀后2000R/MIN离心5秒，置于PCR仪上；步骤（6），按下列条件扩增95预变性3MIN，94变性1MIN，55退火45SEC，72延伸1MIN，34个循环，72延伸10MIN，保存于4，得到扩增产物；步骤（7），反应结束后取510L扩增产物，加2L溴酚蓝混匀，经1琼脂糖凝胶电泳2030分钟后于紫外仪上观察，若在300BP处出现明亮的反应条带，则为多杀性巴氏。
15、杆菌阳性；若无反应条带显示则为阴性。说明书CN104073567A3/5页50012本发明技术方案中所述的新鲜含DNA样品为新鲜鼻腔拭子液。0013本发明技术方案中所述的冰浴匀浆是在无菌匀浆器中。0014本发明技术方案中所述的步骤（2）匀浆后的样品离心的速度为30004000R/MIN，时间为510MIN。0015本发明技术方案中所述的步骤（4）冷却后的样品离心的速度为30004000R/MIN，时间为510MIN。0016本发明与现有技术相比，其有益效果为本发明的牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据多杀性巴氏杆菌毒素基因（TOXA）保守区序列设计的一对引物为主体而设。
16、计的。利用该对引物，可以特异性地扩增携带多杀性巴氏杆菌的待测样品的有关基因片断，所建立的优化的PCR体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异的地检测感染多杀性巴氏杆菌的患牛鼻腔拭子液，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于牛烈性传染病出血性败血症的临床检测，也可用于肉牛或奶牛各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，还可以用于牛养殖环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。附图说明0017图1是感染多杀性巴氏杆菌的病牛鼻腔拭子液样品的PCR扩增结果；其中MDNA分子量标准；1多杀性巴氏杆菌阳性对照；2多杀性巴氏杆菌阴性对照；3检测样。
17、品；图2是因出血性败血症死亡的西门塔尔牛肺部组织样品的PCR扩增结果；其中MDNA分子量标准；1多杀性巴氏杆菌阳性对照；2多杀性巴氏杆菌阴性对照；3检测样品；图3是急性病死牛的的血液组织样品的PCR扩增结果；其中MDNA分子量标准；1多杀性巴氏杆菌阳性对照；2多杀性巴氏杆菌阴性对照；3检测样品。具体实施方式0018下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。0019实施例1牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒，该试剂盒包括A液、B。
18、液、C液、盒子和泡沫板；所述的A液为样品稀释液，内装无菌生理盐水，5管，5ML/管；所述的B液为PCR反应液，1管，内装192LPCR扩增反应液，包括168LDDH2O、144L含MG2的10BUFFERTRISHCL100MMOL/L、PH为90,KCL500MMOL/L,MGCL215MMOL/L,TRITONX1001、32L浓度为250MOL/L的DNTP、24L浓度为05MOL/L引物PMF、24L浓度为05MOL/L引物PMR和16L酶活单位为8U的TAQE；PMF为5ACGCTTTGCCTTGCAAGATAC3,PMR为5GATTCACGTAACAAACCAGGC3；所述的C液为。
19、阳性对照液，1管，内装50L多杀性巴氏杆菌阳性模板；说明书CN104073567A4/5页6所述的C液为阳性对照液，1管，内装50L多杀性巴氏杆菌阳性模板；所述的盒子为长方体盒子，855862CM3。0020所述泡沫板装于盒子中，其大小与盒子的底面相同，高22CM,有三排孔，第一排五个孔，孔径13CM，第二排五个孔，孔径10CM，第三排六个孔，孔径06CM。上述各小瓶和小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。0021该试剂盒中的一对引物的DNA序列如下PMF5ACGCTTTGCCTTGCAAGATAC3；PMR5GATTCACGTAACAAACCAGGC3PCR扩增反应液体系（25L体。
20、系）如下DDH2O21L10BUFFER18LDNTP04L引物PMF03L引物PMR03LTAQE02L实施例2一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，使用实施例1试剂盒，按下列步骤进行步骤（1），取005G被检标本的急性病死牛的的肺部组织，加入样品稀释液，稀释10倍，在无菌匀浆器中冰浴匀浆；步骤（2），将匀浆后的样品下离心，离心的速度为3000R/MIN，时间为5MIN，得到离心后样品的上层清液；步骤（3），将200L离心后样品的上层清液煮沸10MIN，然后立刻放于冰上5MIN冷却；步骤（4），将冷却后的样品离心，离心的速度为3000R/MIN，时间为5MIN，取上层清液作为PCR模板；。
21、步骤（5），分别取体积比为11的PCR模板和C液，各加入到PCR反应液中，PCR模板与PCR反应液的体积比为124，C液与PCR反应液的体积比为124，混匀后2000R/MIN离心5秒，置于PCR仪上；步骤（6），按下列条件扩增95预变性3MIN，94变性1MIN，55退火45SEC，72延伸1MIN，34个循环，72延伸10MIN，保存于4，得到扩增产物；步骤（7），反应结束后取5L扩增产物，加2L溴酚蓝混匀，经1琼脂糖凝胶电泳20分钟后于紫外仪上观察，在300BP处出现一明亮的反应条带，与阳性对照在同一位置，则为多杀性巴氏杆菌阳性，说明检测样品中携带多杀性巴氏杆菌；若无反应条带显示，则为阴。
22、性，表明检测样品中不含多杀性巴氏杆菌，如图1所示。0022实施例3一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，使用实施例1试剂盒，按下列步骤进行步骤（1），取005G被检标本的新鲜鼻腔拭子液，加入样品稀释液，稀释20倍，在无菌匀浆器中冰浴匀浆；说明书CN104073567A5/5页7步骤（2），将匀浆后的样品下离心，离心的速度为4000R/MIN，时间为10MIN，得到离心后样品的上层清液；步骤（3），将200L离心后样品的上层清液煮沸10MIN，然后立刻放于冰上10MIN冷却；步骤（4），将冷却后的样品离心，离心的速度为4000R/MIN，时间为10MIN，取上层清液作为PCR模板；步骤（5）。
23、，分别取体积比为11的PCR模板和C液，各加入到PCR反应液中，PCR模板与PCR反应液的体积比为124，C液与PCR反应液的体积比为124，混匀后2000R/MIN离心5秒，置于PCR仪上；步骤（6），按下列条件扩增95预变性3MIN，94变性1MIN，55退火45SEC，72延伸1MIN，34个循环，72延伸10MIN，保存于4，得到扩增产物；步骤（7），反应结束后取10L扩增产物，加2L溴酚蓝混匀，经1琼脂糖凝胶电泳30分钟后于紫外仪上观察，在300BP处出现一明亮的反应条带，与阳性对照在同一位置，则为多杀性巴氏杆菌阳性，说明检测样品中携带多杀性巴氏杆菌；若无反应条带显示，则为阴性，表明。
24、检测样品中不含多杀性巴氏杆菌，如图2所示。0023实施例4一种牛重大病原菌多杀性巴氏杆菌的检测方法，使用实施例1试剂盒，按下列步骤进行步骤（1），取01G被检标本的急性病死牛的的血液组织，加入样品稀释液，稀释15倍，在无菌匀浆器中冰浴匀浆；步骤（2），将匀浆后的样品下离心，离心的速度为3600R/MIN，时间为7MIN。得到离心后样品的上层清液；步骤（3），将200L离心后样品的上层清液煮沸10MIN，然后立刻放于冰上8MIN冷却；步骤（4），将冷却后的样品离心，离心的速度为3200R/MIN，时间为9MIN，取上层清液作为PCR模板；步骤（5），分别取体积比为11的PCR模板和C液，各加入到。
25、PCR反应液中，PCR模板与PCR反应液的体积比为124，C液与PCR反应液的体积比为124，混匀后2000R/MIN离心5秒，置于PCR仪上；步骤（6），按下列条件扩增95预变性3MIN，94变性1MIN，55退火45SEC，72延伸1MIN，34个循环，72延伸10MIN，保存于4，得到扩增产物；步骤（7），反应结束后取6L扩增产物，加2L溴酚蓝混匀，经1琼脂糖凝胶电泳25分钟后于紫外仪上观察，在300BP处出现一明亮的反应条带，与阳性对照在同一位置，则为多杀性巴氏杆菌阳性，说明检测样品中携带多杀性巴氏杆菌；若无反应条带显示，则为阴性，表明检测样品中不含多杀性巴氏杆菌，如图3所示。说明书CN104073567A1/1页8图1图2图3说明书附图CN104073567A。