《一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104152522A43申请公布日20141119CN104152522A21申请号201410186555X22申请日20140505C12P39/00200601C12P21/06200601C07K1/36200601C07K1/34200601C07K1/16200601C12R1/125200601C12R1/2320060171申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市石桥路198号72发明人汤江武孙宏吴逸飞姚晓红王新柳永74专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司33100代理人向庆宁54发明名称一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法57摘要本发明。
2、公开了一种以市售谷朊粉为原料制备小麦活性肽的方法，该方法采用枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的复配发酵剂，进行混合固态发酵；再经加水提取、离心分离、膜精制后，将得到的滤液经喷雾干燥而成。本发明克服了现有技术的不足，制备方法操作简单，活性肽得率高，成本低，反应温和，有利于环境友好保护，并充分发挥微生物去除肽类苦味的作用，是一种适合工业化生产小麦活性肽的方法。51INTCL权利要求书1页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN104152522ACN104152522A1/1页21一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法，其特征在于该方法包括以。
3、市售谷朊粉为原料，直接加入含有枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的复配发酵剂，进行固态发酵；再经提取分离、精制、干燥而成，其中，枯草芽孢杆菌为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO14255的菌株，嗜酸乳杆菌为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO13342的菌株。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于制备所述的枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌复配发酵剂的方法包括1、配制发酵培养液，成分为葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70；2、将从斜面经过活化、扩大培养后的枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种分别用上述发酵培养的菌。
4、体液稀释为15108个/ML的悬浊液，并按照等比例混合即得复配发酵剂。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固态发酵的步骤包括按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比1121加入发酵剂，发酵温度调节为2842，发酵时间为2472小时。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取步骤包括按谷朊粉与蒸馏水的比110120加入蒸馏水，每次提取的时间为1030分钟，提取次数为13次。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在经过水提取过程后，还包括分离步骤，其中分离步骤包括离心转速为30006000转/分钟以去除残渣。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在经过分离步骤后，采用超滤膜过滤分离小麦。
5、活性肽粗提液并分离成不同分子量的小麦活性肽。7根据权利要求2所述的方法，其特征在于，悬浊液中枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的菌体浓度为1108个/ML。权利要求书CN104152522A1/7页3一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法技术领域0001本发明涉及一种植物蛋白肽的制备方法，具体涉及一种采用两种微生物混合培养，固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的生产方法。背景技术0002肽是蛋白质的一种特殊存在形式，一般为蛋白质降解过程中的中间产物。现代营养研究成果表明，蛋白质被动物所摄入后，主要以肽的形式被吸收利用，并可在体内发挥提高免疫、抗疲劳、降血压和降血脂等多种生物功能。美国、日本等国家以活性肽为研。
6、究对象已开发出低抗原食品、婴儿食品、运动食品、促钙吸收食品、降压食品、醒酒食品等一系列产品，取得了良好的社会和经济效益。我国拥有相对丰富的蛋白质资源，因此利用不同蛋白资源开发活性肽是目前食品和饲料工业研究的重点。0003谷朊粉是一类从小麦中提取的优质的植物蛋白原料，其蛋白质含量高7585且含有丰富的必需氨基酸，在食品和饲料工业中具有广泛应用。研究表明，谷朊粉经过水解后可产生具有抗氧化、调节血糖、镇痛等多种功能活性的小麦肽，并大大提高其蛋白体外消化率；体内试验表明，小麦活性肽可显著提高饲喂实验小鼠的免疫功能。因此，谷朊粉水解成小麦肽后，具备更优的生物活性和广阔的市场开发应用前景。0004目前，由。
7、谷朊粉出发制备活性肽的主要方法为酶解法。如中国发明专利CN102326664B公开了“一种谷朊粉肽的提取方法”，主要包括将蒸煮过的谷朊粉加水混合后，分别加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶并调控PH稳定进行酶解反应，再经过分离、浓缩和干燥制成小麦肽产品。但由于液体酶解法生产小麦活性肽的苦味明显，口感较差，因而严重影响了产品品质。同时，由于酶解反应使用的酶量大，且多为进口酶，加大了制备小麦肽的成本，减少了企业的经济效益。此外，为了保证酶解反应的效果，往往需要实时调节PH、温度等反应条件，进一步加深了酶解工艺的复杂性，不利于小麦活性肽产业化的推广。因此，目前急需要一种新的生产工艺来实现有效消除小麦活性肽苦味。
8、的同时，降低其生产成本。发明内容0005本发明目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种工艺简单、无需酸碱调节，成本低的小麦活性肽制备方法，该制备方法所获得的小麦活性肽苦味可达到有效去除。0006本发明的上述目的通过以下技术方案实现0007一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法，其特征在于该方法包括以市售谷朊粉为原料，直接加入含有枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的复配发酵剂，进行固态发酵；再经提取分离、精制、干燥而成，其中，枯草芽孢杆菌为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNO14255的菌株，嗜酸乳杆菌为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CG。
9、MCCNO13342的菌株。0008优选的，制备所述的枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌复配发酵剂的方法包括1、配制发酵培养液，成分为葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70；2、将从说明书CN104152522A2/7页4斜面经过活化、扩大培养后的枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种分别用上述发酵培养的菌体液稀释为15108个/ML的悬浊液，并按照等比例混合即得复配发酵剂。较优选的，悬浊液中枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的菌体浓度为1108个/ML。0009优选的，所述的固态发酵的步骤包括按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比1121加入发酵剂，发酵温度调节为2842，发酵时间为2472小。
10、时。0010优选的，所述的提取步骤包括按谷朊粉与蒸馏水的比110120加入蒸馏水，每次提取的时间为1030分钟，提取次数为13次。0011较优选的，在经过水提取过程后，还包括分离步骤，其中分离步骤包括离心转速为30006000转/分钟以去除残渣。0012优选的，在经过分离步骤后，采用超滤膜过滤分离小麦活性肽粗提液并分离成不同分子量的小麦活性肽。0013一种混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法，其特征在于以市售谷朊粉为原料，直接加入含有芽孢杆菌与乳酸菌的复配发酵剂，进行固态发酵；再经提取分离、精制、干燥而成。0014优选的，混菌固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的方法，其特征在于其工艺步骤包括1、制。
11、备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂；2、固态发酵向谷朊粉中加入步骤1所述芽孢杆菌与乳酸菌的复配发酵剂，进行固态发酵；3、加水提取步骤2所述固态发酵后的培养基，离心去除残渣，超滤膜过滤分离得到小麦活性肽的粗提液；4精制将步骤3所述制得的小麦肽粗提液采用凝胶色谱方法进行脱盐、脱色处理；5将步骤4所述精制后的小麦肽组分喷雾干燥即得生物活性小麦肽。优选的，在步骤1中所述的制备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂的工序为1配制发酵培养液，成分为葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70；2将从斜面经过活化、扩大培养后的枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种分别用上述发酵培养液稀释为15108个/ML。
12、的悬浊液，并按照等比例混合即得复配发酵剂。0015优选的，在步骤2中所述的固态发酵步骤中，具体方法为按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比1121加入发酵剂，发酵温度调节为2842，发酵时间为2472小时。0016更优选的，在步骤3中所述的加水提取步骤中，按固液质量比110120加入蒸馏水，每次提取时间为1030分钟，提取次数为13次。更优选的，步骤3中所述的离心分离去除残渣的方法中，离心转速为30006000转/分钟。优选的，在步骤3中所述的超滤膜过滤分离是将小麦活性肽粗提液采用不同截留分子量的超滤膜3KDA，5KDA和10KDA进行分级分离，得到三种不同分子量大小的小麦活性肽滤液。0017优选的。
13、，在步骤4中，所述的凝胶层析精制过程采用的填料为葡聚糖凝胶G15或G25。0018优选的，在步骤5中，所述的喷雾干燥在以下条件下进行进口温度130180，干燥器内温度90110，出口温度6590。0019本发明的有益效果0020本发明与现有技术相比，具有以下显著优点00211本发明制备方法操作简单，直接以市售谷朊粉为原料直接进行固态发酵生产小麦肽，无需对原料进行蒸煮或酸碱处理，有效降低成本，因此适合工业化生产并有效避开了说明书CN104152522A3/7页5酸碱处理所带来的环境污染和安全隐患；00222利用芽孢杆菌和乳酸菌混合发酵产生的蛋白酶和多种代谢产物，大大简化了谷朊粉降解过程，节省了昂。
14、贵生物酶制剂的使用，有效降低了工业化生产成本；00233本发明采用不同截留量的超滤膜对小麦肽进行分级分离，可有针对性的根据实际需要获得不同品质的小麦活性肽产品，大大优化了产品分级过程；00244经感官苦味评定检测，本发明方法有效降低了所制备小麦活性肽的苦味，同时所制备的活性肽含量以干基计高达900以上，更利于动物吸收利用；同时还具有免疫调节、抗氧化和降压等功能。具体实施方式0025下面具体结合实施例来进一步说明本发明的方法及其产品性能。但以下实施例仅是范例性的，本发明并不受这些实施例的限制。0026实施例1固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的菌种的筛选0027本发明对所使用的芽孢杆菌与乳酸菌的复配发。
15、酵剂进行了菌种筛选，筛选对象包括从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市朝阳区中国科学院微生物研究所商业途径购买的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌保藏编号分别为枯草芽孢杆菌，CGMCCNO14255；地衣芽胞杆菌,CGMCCNO110314；短小芽孢杆菌,CGMCCNO18112；干酪乳杆菌,CGMCCNO13921；乳酸乳球菌,CGMCCNO124710；嗜酸乳杆菌，CGMCCNO13342，具体筛选方法是先制备发酵菌剂芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和短小芽孢杆菌和乳酸菌干酪乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌菌种接一环进入活化培养基，。
16、活化培养基配方为1枯草芽孢杆菌活化培养基牛肉膏5G，蛋白胨10G，NACL5G，琼脂20G，自来水1000ML，PH72；2乳酸菌的活化培养基酵母膏5G，蛋白胨10G，NACL5G，琼脂20G，自来水1000ML，PH72。进行活化培养后，分别用发酵培养液葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70稀释成菌体浓度达到1108个/ML；然后在固态发酵罐内按照固液质量比11的比例加入谷朊粉，发酵温度为30，发酵48小时后，按固液质量比120加入无菌蒸馏水，采用6000转/分钟离心去除杂质，得到小麦活性肽粗提液；通过比较不同菌种发酵后的1、谷朊粉蛋白的水解度、2、小麦肽得。
17、率和3、微生物蛋白酶活力产量及4、粗提液中小麦肽的分子量分布，得到枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的蛋白水解度和蛋白酶活较高，但地衣芽孢杆菌的肽得率较低，推测其发酵产蛋白酶可能为外切酶，产生的游离氨基酸较多，不能作为生产肽的出发菌种。因此枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的发酵效果较好见下表。0028表1不同微生物菌种对发酵后小麦活性肽品质的影响0029说明书CN104152522A4/7页60030实施例2固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的发酵条件的筛选0031本发明对固态发酵谷朊粉制备小麦活性肽的发酵条件进行了筛选，筛选对象包括不同的初始菌种浓度和固液原料与发酵液之间的质量比例比例。00321不同。
18、菌种的初始浓度0033具体筛选方法是先制备发酵菌剂枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种接一环进入活化培养基按常规培养方法进行培养后，分别用发酵培养液葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70稀释成菌体浓度达到1106、1107、1108、1109个/ML；然后在固态发酵罐内按照固液质量比11的比例加入谷朊粉，发酵温度为30，发酵48小时后，按固液质量比120加入无菌蒸馏水，采用6000转/分钟离心去除杂质，得到小麦活性肽粗提液；通过比较不同菌种发酵后的1、谷朊粉蛋白的水解度、2、小麦肽得率和3、微生物蛋白酶活力产量及4、粗提液中小麦肽的分子量分布，得到不同初始菌种浓度对小。
19、麦活性肽的品质影响很大，其中初始菌体浓度在1108至1109个/ML的浓度效果较好，最好的是10108个/ML。考虑到生产成本，选择了15108个/ML为发酵菌种的出发浓度见下表2。0034表2不同微生物出发菌体浓度对发酵后小麦活性肽品质的影响0035003600372不同菌种、物料固液比例筛选0038具体筛选方法是先制备发酵菌剂枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌菌种接一环进入活化培养基按常规培养方法进行培养后，分别用发酵培养液葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70稀释成菌体浓度达到1108个/ML；然后在固态发酵罐内按说明书CN104152522A5/7页7照固液质量。
20、比051、11、151、21和51的比例加入谷朊粉，发酵温度为30，发酵48小时后，按固液质量比120加入无菌蒸馏水，采用6000转/分钟离心去除杂质，得到小麦活性肽粗提液；通过比较不同菌种发酵后的1、谷朊粉蛋白的水解度、2、小麦肽得率和3、微生物蛋白酶活力产量及4、粗提液中小麦肽的分子量分布，得到不同谷朊粉和菌种的固液比对小麦活性肽的品质影响很大，其中浓度在11至21之间的效果较好见下表3。0039表3不同菌种与谷朊粉固液比对发酵后小麦活性肽品质的影响00400041实施例30042一种小麦活性肽的制备方法，其步骤如下00431制备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂挑取两环斜面保藏的枯草芽孢杆菌与实。
21、施例子1的菌种一样接种于活化培养基，成分为牛肉膏5G，蛋白胨10G，NACL5G，琼脂20G，自来水1000ML，PH72；于37摇床培养24小时后，用发酵培养液葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70稀释成菌体浓度达到1108个/ML。同样挑取两环斜面保藏的嗜酸乳杆菌与实施例子1的菌种一样接种于活化培养基，成分为酵母膏5G，蛋白胨10G，NACL5G，琼脂20G，自来水1000ML，PH72；于37静置培养24小时后，用发酵培养液葡萄糖50G，酵母粉15G，蛋白胨20G，无菌水1000ML，PH为70稀释成菌体浓度达到1108个/ML。将枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆。
22、菌稀释液按照11的比例混合即得复配发酵剂。00442固态发酵向市售谷朊粉原料采购自株洲智荟生物科技有限公司中按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比11直接加入发酵剂，发酵温度调节为28，发酵时间为24小时。00453加水提取发酵结束后按谷朊粉原料水为110的比例加入蒸馏水，每次提取时间为10分钟，3000转/分钟离心分离去除残渣，提取次数为1次。将提取液通过截留分子量为10KDA的超滤膜进行分级分离，得到小麦活性肽滤液。00464精制将上述活性肽滤液采用葡聚糖G15凝胶柱进行脱盐、脱色处理，柱尺寸为2680厘米，流速为05ML/分钟。00475将上述精制后的小麦肽组分喷雾干燥即得生物活性小麦肽，其中。
23、进口温度130，干燥器内温度90，出口温度65。0048经检测，本发明方法所获得小麦活性肽的指标如下色泽为白色，蛋白质含量为901，其中分子量在1KDA以下的肽含量为512，感官苦味评价得分为08，评定为无苦味，获得的活性肽得率为501。说明书CN104152522A6/7页80049实施例40050一种小麦活性肽的制备方法，其步骤如下00511制备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的活化过程同实施例1的步骤1。其中枯草芽孢杆菌采用发酵培养液稀释成菌体浓度达到3108个/ML，嗜酸乳杆菌稀释成菌体浓度达到3108个/ML。将枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌稀释液按照11比例混合即得复配。
24、发酵剂。00522固态发酵向市售谷朊粉原料中按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比11加入发酵剂，发酵温度调节为35，发酵时间为48小时。00533加水提取发酵结束后按固液质量比110加入蒸馏水，每次提取时间为20分钟，4000转/分钟离心分离去除残渣，提取次数为2次。将提取液通过截留分子量为5KDA的超滤膜进行分级分离，得到小麦活性肽滤液。00544精制将上述活性肽滤液采用葡聚糖G15凝胶柱进行脱盐、脱色处理，柱尺寸为2680厘米，流速为05ML/分钟。00555将上述精制后的小麦肽组分喷雾干燥即得生物活性小麦肽，其中进口温度150，干燥器内温度100，出口温度75。0056经检测，本发明方法所获。
25、得小麦活性肽的指标如下色泽为白色，蛋白质含量为931，其中分子量在1KDA以下的肽含量为663，感官苦味评价得分为04，评定为无苦味，获得的活性肽得率为523。0057实施例50058一种小麦活性肽的制备方法，其步骤如下00591制备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的活化过程同实施例1的步骤1。其中枯草芽孢杆菌采用发酵培养液稀释成菌体浓度达到5108个/ML，嗜酸乳杆菌稀释成菌体浓度达到5108个/ML。将枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌稀释液按照等比例混合即得复配发酵剂。00602固态发酵向市售谷朊粉原料中按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比21加入发酵剂，发酵温度调节为42，发酵时间。
26、为72小时。00613加水提取发酵结束后按固液质量比120加入蒸馏水，每次提取时间为30分钟，6000转/分钟离心分离去除残渣，提取次数为3次。将提取液通过截留分子量为5KDA的超滤膜进行分级分离，得到小麦活性肽滤液。00624精制将上述活性肽滤液采用葡聚糖G25凝胶柱进行脱盐、脱色处理，柱尺寸为2680厘米，流速为05ML/分钟。00635将上述精制后的小麦肽组分喷雾干燥即得生物活性小麦肽，其中进口温度180，干燥器内温度110，出口温度90。0064经检测，本发明方法所获得小麦活性肽的指标如下色泽为白色，蛋白质含量为941，其中分子量在1KDA以下的肽含量为872，感官苦味评价得分为01，。
27、评定为无苦味，获得的活性肽得率为521。0065实施例60066一种小麦活性肽的制备方法，其步骤如下00671制备芽孢杆菌与乳酸菌复配发酵剂枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌的活化过程说明书CN104152522A7/7页9同实施例1的步骤1。其中枯草芽孢杆菌采用发酵培养液稀释成菌体浓度达到5108个/ML，嗜酸乳杆菌稀释成菌体浓度达到5108个/ML。将枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌稀释液按照11比例混合即得复配发酵剂。00682固态发酵向市售谷朊粉原料中按照谷朊粉与复配发酵剂固液质量比21加入发酵剂，发酵温度调节为42，发酵时间为72小时。00693加水提取发酵结束后按固液质量比120加入蒸馏水，每次提取时间为30分钟，6000转/分钟离心分离去除残渣，提取次数为3次。将提取液通过截留分子量为1KDA的超滤膜进行分级分离，得到小麦活性肽滤液。00704精制将上述活性肽滤液采用葡聚糖G25凝胶柱进行脱盐、脱色处理，柱尺寸为2680厘米，流速为05ML/分钟。00715将上述精制后的小麦肽组分喷雾干燥即得生物活性小麦肽，其中进口温度130，干燥器内温度90，出口温度65。0072经检测，本发明方法所获得小麦活性肽的指标如下色泽为白色，蛋白质含量为926，其中分子量在1KDA以下的肽含量为902，感官苦味评价得分为02，评定为无苦味，获得的活性肽得率为537。说明书CN104152522A。