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1、(10)授权公告号 CN 101946623 B (45)授权公告日 2012.01.04 CN 101946623 B *CN101946623B* (21)申请号 201010270559.8 (22)申请日 2010.09.01 A01G 1/00(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市徐东二路 2 号 (72)发明人 单志慧 沙爱华 陈海峰 陈李淼 郝青南 孙佃臣 田星星 周新安 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 大豆非组织培养植株再生方法及其应用 (5。
2、7) 摘要 本发明公开了一种大豆非组织培养植株再生 方法及其应用。本发明提供的培养再生植株的方 法， 包括如下步骤 ： 将植物苗的顶芽和根去除， 再 沿子叶接缝处平分纵切下胚轴， 将 1 个植物苗一 分为二， 分别作为外植体， 每个外植体在子叶节处 均具有 1 片子叶和 1 个腋芽 ； 将外植体进行培养， 得到植物再生植株 ； 所述植物苗具有如下结构 ： 在子叶节处具有2片子叶及2个腋芽， 子叶节之上 部分为顶芽和连接子叶节和顶芽的上胚轴， 子叶 节之下部分为根和连接子叶节和根下胚轴。本发 明的实验证明， 本发明的方法制备再生植株制作 简单、 成本低、 工作效率高， 而且绿色环保。 (51)I。
3、nt.Cl. 审查员 王霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 CN 101946623 B1/1 页 2 1. 一种获得植物再生植株的方法， 包括如下步骤 ： 将植物苗的顶芽去除， 再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴， 将 1 个植物苗一分为二， 分别 作为外植体， 每个外植体在子叶节处均具有 1 片子叶和 1 个腋芽 ； 将外植体进行培养， 得到 植物再生植株 ； 所述植物苗为具有如下结构的苗 ： 在子叶节处具有2片子叶及2个腋芽， 子叶节之上部 分为顶芽和上胚轴， 子叶节之下部分为根和下胚轴 ； 所述将外植体进行培养的方法包。
4、括如下步骤 ： 将外植体的子叶节以下部分均埋入基质 中， 再进行培养， 得到再生植株幼苗 ； 所述基质为无菌蛭石 ； 所述培养的条件包括温度为 24 -26， 光照条件为每天 14 小时 -18 小时光照 /10 小 时 -6 小时黑暗， 光照强度为 100mol/m2/s-140mol/m2/s， 湿度为 60 -90 ； 所述植物为大豆。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述将顶芽去除的位置是从所述子叶节处除去 ； 在所述培养植物再生植株的方法中， 所述将植物苗的顶芽去除和所述再沿子叶接缝处 平分纵切下胚轴的步骤间还包括将所述植物苗的根去除的步骤， 所述植物苗的根去除。
5、位置 是自所述子叶节处下数 2cm-3cm 处。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物苗的根去除位置为自所述子叶 节处下数 2cm、 2.5cm 或 3cm 处。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述温度为 24、 25或 26， 所述光照条件为每天 14 小时光照 /10 小时黑暗、 16 小时光照 /8 小时黑暗或 18 小时光照 /6 小时黑暗， 所述光照强度为 100mol/m2/s、 120mol/m2/s 或 140mol/m2/s， 所述湿度 为 60、 80或 90。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ：。
6、 所述培养的时间为 20 天 -30 天。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述培养的时间为 20 天、 25 天或 30 天。 7. 权利要求 1-6 中任一所述的方法在植物的遗传育种中的应用 ； 所述植物为大豆。 权 利 要 求 书 CN 101946623 B1/7 页 3 大豆非组织培养植株再生方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆非组织培养植株再生方法及其应用。 背景技术 0002 在大豆抗病、 虫育种时， 需要对收集的品种资源、 杂交后代、 转基因后代进行病、 虫 接种鉴定， 切取植株某部分组织或器官进行生理、 生化分析， 同时又要求被检测的植株。
7、能够 正常的繁衍后代。 这类材料的共同特点是个体数量少， 每个个体遗传背景均不相同， 而且在 现实中难以重复获得。由于病、 虫接种以及切取植株部分组织或器官对植株造成的多为不 可恢复的破坏性损伤， 被检测的植株无法繁衍后代。通常对这类材料的鉴定或生理生化指 标检测需要等到它们的后代遗传稳定后才能进行， 但这往往需要 3-5 代的繁殖时间， 而且 必保留每个后代的衍生株系， 如果按每个植株每代结籽 10 粒来计算的话， 那么经过 3 代以 后， 最初的 1 粒种子会有 1000 个后代植株， 如果在此时进行病、 虫接种鉴定或生理生化分 析， 无疑大大增加实验规模， 同时耗费巨大的人力、 物力， 。
8、而大规模接种病、 虫也是非常不现 实的行为。植物的另一种繁殖途径是通过无性繁殖即组织培养的方法， 但组织培养需要严 格的无菌条件和培养条件， 不同品种的再生都具有很强的基因型依赖性， 而且培养周期长 于植物正常的生长周期。 因此， 开发一种能在早世代进行病、 虫害接种鉴定且不影响植株正 常繁殖的方法已成为提高育种效率的迫切需要。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种大豆非组织培养植株再生方法及其应用。 0004 本发明提供的方法， 包括如下步骤 ： 0005 将植物苗的顶芽去除， 再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴， 将 1 个植物苗一分为二， 分别作为外植体， 每个外植体在子叶节处均具有 1。
9、 片子叶和 1 个腋芽 ； 将外植体进行培养， 得到植物再生植株 ； 0006 所述植物苗具有如下结构 ： 在子叶节处具有2片子叶及2个腋芽， 子叶节之上部分 为顶芽和上胚轴， 子叶节之下部分为根和下胚轴。 0007 所述上胚轴连接所述顶芽和所述子叶节， 所述下胚轴连接所述根和所述子叶节。 0008 所述将顶芽去除的位置是从所述子叶节处除去 ； 0009 在所述培养植物再生植株的方法中， 所述将植物苗的顶芽去除和所述再沿子叶接 缝处平分纵切下胚轴的步骤间还包括如下步骤 ： 将所述植物苗的根去除的步骤， 所述植物 苗的根去除位置是自所述子叶节处下数 2cm-3cm 处 ； 所述将根去除的位置具体。
10、为自子叶节 处下数 2cm、 2.5cm 或 3cm 处。 0010 所述将外植体进行培养的方法包括将外植体的子叶节以下部分均埋入基质中， 再 进行培养， 得到再生植株幼苗 ； 0011 所述基质为无菌蛭石 ； 0012 所述培养的条件包括温度为 24 -26， 光照条件为每天 14 小时 -18 小时光照 说 明 书 CN 101946623 B2/7 页 4 /10小时-6小时黑暗， 光照强度为100mol/m2/s-140mol/m2/s， 相对湿度为60-90， 所述温度具体为 24、 25或 26， 所述光照条件具体为每天 14 小时光照 /10 小时黑暗、 16 小时光照 /8 小。
11、时黑暗或 18 小时光照 /6 小时黑暗， 所述光照强度具体为 100mol/m2/ s、 120mol/m2/s 或 140mol/m2/s， 所述相对湿度具体为 60、 80或 90。所述培养的 时间为 20 天 -30 天， 所述培养的时间具体为 20 天、 25 天或 30 天。 0013 所述植物为双子叶植物， 所述双子叶植物优选为豆科植物， 尤其优选为大豆。 0014 所述的方法在植物的遗传育种鉴定中的应用也是本发明保护的范围。 0015 所述应用中， 所述遗传育种鉴定为抗病性鉴定。 0016 所述病为大豆花叶病毒病或者大豆锈病。 0017 所述大豆花叶病毒病为的病原菌为马铃薯 Y。
12、 病毒科 (Potyviridae)、 马铃薯 Y 病毒属 (potyvirus)、 大豆花叶病毒种 soybean mosaic virus。所述大豆锈病的病原菌 为担子菌纲 (basidomycetes)、 锈菌目 (Urediales)、 栅锈科 (Malampsoraceae)、 层锈属 (Phakopsora)、 大豆锈菌种 (Phakopsora pachyrhizi Sydow)。 0018 本发明的实验证明， 本发明的方法具有如下优点 ： 0019 1) 条件简单 ： 培养过程中无需无菌条件， 一般实验室均可进行 ； 0020 2) 培养过程不需任何培养基 ： 反应过程中仅需提。
13、供足够的水和光源， 大豆子叶具 有足够的营养满足腋芽发育成一个新的植株， 省去了研制培养基配方的过程 ； 0021 3) 外植体制备工艺简单， 便于掌握 ： 外植体制备时对幼苗要求不是特别严格， 7-10 天的幼苗均可采用， 外植体制备时， 仅需要去掉顶芽， 纵切子叶节即可， 一个普通工人 稍加培训即可掌握 ； 0022 4) 周期短 ： 非组织培养再生从种子萌发到再生植株形成仅需要 1 个月时间， 而大 豆组织培养再生从种子萌发到获得再生植株需 3-4 个月的时间 ； 0023 5) 遗传背景不发生任何改变 ： 由于培养过程没有使用任何激素， 因此再生植株没 有发生任何个体变异。而大豆组织培。
14、养中由于需要添加激素诱导再生苗， 组培苗会有不同 程度的个体变异， 影响后期鉴定结果 ； 0024 6) 没有基因型依赖性 ： 大豆所有品种均在子叶节处含有两个腋芽， 当顶芽受到破 坏时， 腋芽均能发育成完整植株。 而组织培养的再生植株则受基因型的限制， 并非每个基因 型都能诱导出再生植株 ； 0025 7) 成苗率高 ： 大豆非组织培养再生全过程没有使用任何植物激素， 生根正常， 由 于未经无菌培养， 无需炼苗过程， 成苗率均在90以上。 而组织培养获得的再生苗由于经过 细胞分裂素处理， 容易发生生根困难的现象， 从无菌苗到室外培养需要炼苗阶段， 成苗率会 有所降低 ； 0026 8) 降低。
15、成本 ： 大豆非组织培养再生全过程不需要特殊的设备和培养基， 省去了组 织培养过程中种子消毒、 无菌操作、 培养基配制、 激素调整等工序， 植株再生时间由组织培 养再生所需的 3-4 个月缩短到 1 个月， 不仅节省了时间， 也节省了大量设备投资、 运行费用 以及人工费用。适于大规模实验 ； 0027 9) 提高工作效率 ： 大豆非组织培养再生成苗率在 90以上， 特别适用于杂交早世 代、 转基因早世代、 收集的种质资源等个体数量少、 个体重复获得性差、 遗传背景高度不稳 定的材料进行抗病、 虫鉴定和生理生化检测， 及时获得遗传数据， 进行遗传分析， 同时通过 说 明 书 CN 1019466。
16、23 B3/7 页 5 早世代鉴定， 及时淘汰抗性、 生理生化不符合育种目标的后代， 能有效减小后代规模， 提高 育种效率 ； 0028 10) 绿色环保 ： 大豆非组织培养再生全过程仅需要光照和清水， 无需任何化学物 质， 有很强的环保概念， 可以解决常规繁种和组织培养方法难以解决的问题。 0029 综上所述， 本发明方法得到的再生植株能够正常开花结实， 并可进行抗病、 虫鉴 定， 生理生化指标鉴定。 本发明工艺简单， 植株成活率高， 可适于种苗扩繁、 特别适用于收集 的种质资源、 杂交低世代后代材料、 转基因后代材料等个体数量少的群体进行抗性鉴定以 及其他破坏性生理生化指标测定。它既可满足。
17、早世代育种材料进行各种破坏性鉴定的需 要， 也保证了种子繁殖的需要， 主要用于早世代育种材料抗病、 虫接种鉴定、 具有破坏性的 生理生化指标鉴定以及种质资源中优异单株的鉴定和分离。 附图说明 0030 图 1 为大豆非组织培养植株再生过程 具体实施方式 0031 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0032 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0033 实施例 1、 非组织培养再生大豆植株 0034 方法一 ： 0035 1) 种子萌发 ： 0036 选取饱满无病斑的大豆种子 (Glycine max L.)( 购自武汉中油天隆种业。
18、科技有 限公司 )， 清水浸泡 10 小时， 种子和用水量为 1g 10ml， 待种子彻底吸胀后， 将种子铺在 1540CM的纸带上， 纸带上铺一层吸水纸， 种子沿纸带的长边铺成1行， 距纸带约2CM左右， 种子间距离 2CM， 每个纸带铺置种子 15-20 粒， 然后将纸带卷起， 将纸卷放入 403015CM 的塑料盒中， 每盒放置 40-50 卷， 盒中加水约 2CM 高， 于 26， 16 小时光照 /8 小时黑暗， 光 强 100mol/m2/s 条件下培养， 每 2 天换 1 次水， 培养 7 天， 得到幼苗。 0037 幼苗具有如下结构 ： 在子叶节处具有2片子叶及2个腋芽， 子叶。
19、节之上部分为顶芽 和连接子叶节及顶芽的上胚轴， 子叶节之下部分为根和连接子叶节及根的下胚轴 ； 顶芽的 高度约与子叶齐平。 0038 2) 外植体的制备 ： 0039 在子叶节处去除幼苗的顶芽， 自子叶节处下数 2cm 处将幼苗的下胚轴和根去除， 再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴， 保留腋芽， 将1个幼苗一分为二， 成为2个外植体， 每个外 植体在子叶节处均具有 1 片子叶和 1 个腋芽。 0040 3) 再生植株幼苗的获得 ： 0041 将步骤 2) 得到的外植体分别种入无菌蛭石中， 子叶节以下部分均埋入蛭石中， 浇 透水， 于 26， 16 小时光照 /8 小时黑暗， 光强 100mol/m2。
20、/s 条件下， 期间经常喷水保湿 ( 湿度保持在 RH60。)， 培养 20 天后， 得到再生植株幼苗。 0042 4) 移栽 0043 将再生植株幼苗移入较大花盆 ( 培养基质为土壤蛭石为 3 1kg/kg) 中， 在室 说 明 书 CN 101946623 B4/7 页 6 外培养， 每周浇 1 次 1/10MS 培养液， 自然条件生长 (5 月初 -10 月底为合适的季节 ) 直至开 花结实， 每个外植体可获得 2 个再生植株。 0044 表 1.MS 培养基配方 (mg/L) ： 0045 0046 大豆非组织培养植株再生过程为图 1 所示。图 1 中， A 为大豆种子在纸卷中萌发 一。
21、周， B 为纸卷中萌发的幼苗下胚轴很直， 没有卷曲现象， 便于操作， C 为外植体制备， 从子 叶节处去掉上胚轴， 下胚轴自子叶节处保留 2-3CM 的图片， D 为外植体培养 2-4 天时， 可见 长大的腋芽， E 为外植体长成的植株， 已结实。 0047 实验设 3 次重复， 结果取平均数。 0048 成苗率计算方法 ： ( 获得再生植株的数量 使用外植体的数量 )*100 0049 统计结果如表 2 所示 ： 0050 表 2. 大豆非组织培养再生效率 0051 外植体数 再生植株数 成苗率 ( ) 第一次重复 49 48 97.9 第二次重复 45 43 95.5 第三次重复 46 4。
22、4 95.6 平均 140 135 96.3 说 明 书 CN 101946623 B5/7 页 7 0052 方法二 ： 0053 1) 种子萌发 ： 与方法一相同。 0054 2) 外植体的制备 ： 与方法一基本相同， 不同的是自子叶节处下数 2.5cm 处将幼苗 的下胚轴和根去除。 0055 3) 再生植株幼苗的获得 ： 与方法一基本相同， 不同的是 ： 将步骤 2) 得到的外植体 分别种入无菌蛭石中， 子叶节以下部分均埋入蛭石中， 浇透水， 于 24， 14 小时光照 /10 小 时黑暗， 光强 120mol/m2/s 条件下， 期间经常喷水保湿 ( 湿度保持在 RH80。)， 培养 。
23、25 天后， 得到再生植株幼苗。 0056 4) 移栽 ： 与方法一相同。 0057 成苗率计算方法与方法一相同， 结果与方法一无显著差异。 0058 方法三 ： 0059 1) 种子萌发 ： 与方法一相同。 0060 2) 外植体的制备 ： 与方法一基本相同， 不同的是自子叶节处下数 3cm 处将幼苗的 下胚轴和根去除。 0061 3) 再生植株幼苗的获得 ： 与方法一基本相同， 不同的是 ： 将步骤 2) 得到的外植体 分别种入无菌蛭石中， 子叶节以下部分均埋入蛭石中， 浇透水， 于25， 18小时光照/6小时 黑暗， 光强 120mol/m2/s 条件下， 期间经常喷水保湿 ( 湿度保持。
24、在 RH90。)， 培养 30 天 后， 得到再生植株幼苗。 0062 4) 移栽 ： 与方法一相同。 0063 成苗率计算方法与方法一相同， 结果与方法一无显著差异。 0064 实施例 2、 用非组织培养再生大豆植株进行检测实验 0065 取大豆种子中豆29(购自武汉中油天隆种业科技有限公司)， 采用实施例1的方法 一培养中豆 29 得到外植体。 0066 1、 非组织培养再生大豆植株大豆花叶病毒接种 0067 1) 外植体长出第一片复叶 0068 将上述得到的外植体在无菌蛭石中培养 14 天， 经常喷水保湿， 直到外植体长出 第一片复叶 ； 培养条件为 26， 16 小时光照 /8 小时黑。
25、暗， 光强 100mol/m2/s， 湿度 RH 为 60。 0069 2) 大豆花叶病毒接种鉴定 ： 0070 将具有大豆花叶病毒病的大豆病叶(病原菌为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)， 马 铃薯 Y 病毒属 (potyvirus) 大豆花叶病毒种 soybean mosaic virus.， 记载在 Gardner MW， Kendrick H(1921)Soybean mosaic.J Agric Res 22 ： 111-114， 公众可从中国农业科学院油 料作物研究所获得。 )液氮磨碎， 加入0.01M磷酸钠(pH7.0)缓冲液， 混合后制成接种液， 病 叶和缓冲液的比例为 。
26、1g 10ml。 0071 先在外植体长出第一片复叶上表面洒上很薄的一层金刚砂， 再用毛笔沾上述接种 液对第一片复叶的上表面进行涂抹接种， 接种后约 10 分钟， 再用清水冲洗掉叶表面上的接 种液， 对接种后的外植体苗浇透水， 之后每周浇一次水， 培养 4 周后， 调查发病情况。以未接 种接种液的外植体苗作为阴性对照， 阳性对照 ： 中豆29直接萌发约25-30天， 第一片复叶完 全展开， 在复叶表面洒上很薄的一层金刚砂， 再用毛笔沾上述接种液对真叶上表面进行涂 说 明 书 CN 101946623 B6/7 页 8 抹， 接种后约 10 分钟， 再用清水冲洗掉叶表面上的接种液， 对接种后的外。
27、植体苗浇透水， 之 后每周浇一次水， 培养 4 周后， 调查发病情况。 0072 每次每个处理接种 15 个植株， 实验重复三次， 结果无显著差异。 0073 大豆花叶病毒发病率 ( 出现系统症状的植株数 接种病毒的株数 )*100 0074 统计结果如下 ： 0075 表 3 为大豆花叶病毒发病率 0076 0077 可以看出， 用实施例1的方法一培养中豆29得到外植体大豆花叶病毒发病率和阳 性对照 ( 正常组培得到的 ) 发病率无显著差异， 阴性对照无发病率。因此本方法可用于制 备鉴定大豆花叶病毒的外植体。 0078 2、 非组织培养大豆再生植株大豆锈菌接种 0079 1) 外植体长出第 。
28、3 片复叶 0080 将上述得到的外植体在无菌蛭石中培养 30 天， 经常喷水保湿， 直到外植体长出第 3片复叶 ； 培养条件为26， 16小时光照/8小时黑暗， 光强100mol/m2/s， 湿度RH为60。 0081 2) 大豆锈菌接种鉴定 0082 大豆锈病的病原菌为担子菌纲 (basidomycetes) 锈菌目 (Urediales) 栅锈科 (Malampsoraceae) 层锈属 (Phakopsora) 大豆锈菌种 (Phakopsora pachyrhizi Sydow( 庄 剑云， 1992， 中国大豆锈病的病原寄主及分布， 中国油料， 3 ： 67-69， 公众可从中国农。
29、业科学 院油料作物研究所获得。) 0083 用 0.1吐温溶液将锈菌 (Phakopsora pachyrhizi Sydow) 孢子制成 105孢子 / ml 悬浮液， 用毛笔沾悬浮液涂抹接种在外植体第 3 片复叶的背面， 接种后用塑料薄膜将外 植体套好， 24 小时黑暗培养， 24 小时后恢复正常培养 (RH 为 100 )， 正常培养的条件为 ： 26， 16 小时光照 /8 小时黑暗， 光强 100mol/m2/s 培养， 保持环境湿度为 RH100， 2 周 后调查发病情况。以未接种接种液的外植体为阴性对照， 阳性对照 ： 中豆 29 直接萌发获得 30-40 日龄幼苗， 取第三片展。
30、开复叶， 将锈菌涂抹在叶片背面， 24 小时黑暗培养， 24 小时后 转至如下培养条件为 ： 26， 16 小时光照 /8 小时黑暗， 光强 100mol/m2/s 培养， 保持环境 湿度为 RH100， 2 周后调查发病情况。以未接种外植体为阴性对照。 0084 每次每个处理接种 10 个叶片， 实验重复三次， 结果无显著差异。 0085 大豆锈病发病率计算方法 ： 发病率 ( 发病叶片总数 接种叶片总数 )100 说 明 书 CN 101946623 B7/7 页 9 0086 表 4 为大豆锈病发病率 0087 再生植株发病率 阳性对照发病率 阴性对照发病率 第一次重复 100 100 0 第二次重复 100 100 0 第三次重复 100 100 0 平均 100 100 0 0088 可以看出， 用实施例1的方法一培养中豆29得到外植体大大豆锈病发病率和阳性 对照 ( 正常组培得到的 ) 发病率无显著差异， 阴性对照无发病率。因此本方法可用于制备 鉴定大豆锈病的外植体。 说 明 书 CN 101946623 B1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 。