技术领域
本发明属于保健食品的加工生产领域，具体涉及一种大豆内源酶生物转化与酸解偶联制备降血脂醋豆的方法。
背景技术
大豆中含有蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂、异黄酮等多种活性成分，其中异黄酮因其具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗肿瘤等多种生理活性功能而得到社会的广泛关注，也得到国内外学术界的高度重视与研究。大豆异黄酮分为结合型糖苷和游离型苷元两种，游离型苷元包括大豆苷元、染料木素、大豆黄素，结合型糖苷包括β-葡萄糖苷（黄豆苷元、大豆黄素、染料木素）、丙二酰基葡萄糖苷（丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、丙二酰基染料木苷）和乙酰基葡萄糖苷（乙酰基黄豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷）。研究结果表明，大豆苷元比大豆糖苷具有更高的生理功能，但苷元含量仅占2%~3%，使得其生理功能受限。
大豆内源性β-葡萄糖苷酶(BG，β-glucosidase，E.C. 3.2.1.21)，属于配糖物水解家族，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。作为大豆内源酶，BG广泛存在于大豆等豆科植物中，在工农业中有着广泛的应用，其在工业上的一个重要应用是在微生物体内进行生物转化，目前BG的研究集中在：一是产BG菌株发酵条件研究；二是BG对动植物体内糖苷类物质的生物转化研究。
为制备降血脂醋豆，主要通过提高大豆苷元含量的方法实现，目前制备大豆苷元的方法主要有化学合成法、酸碱水解法和酶水解法。化学合成法无法除去与大豆苷元相似相溶的物质；酸碱水解法所得产品纯度太低，稳定性太差；酶水解法成本太高，无法实现工业化生产。目前所见涉及大豆苷元制备的方法均为单一方法，偶联或双相体系制备的相关专利报道较少，中国发明专利申请（公开号101701232A）公开了一种高纯度大豆异黄酮苷元的制备方法，该专利所公开的异黄酮苷元制备方法中是通过有机溶剂萃取和双相体系（微生物酶法提取结合有机溶剂萃取技术）实现。但该法存在以下缺点：一是微生物酶易受杂质污染；二是微生物酶与有机溶剂接触时间长，容易导致酶失活。本专利涉及一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆的方法，利用大豆中丰富的糖苷类物质和内源性BG，具体通过第一步的内源酶生物转化和第二步的内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆。第一步的内源酶生物转化克服了微生物酶法易受杂质污染和固定化酶技术带来的高生产成本等缺点；第二步的内源酶生物转化和酸解偶联，由于醋酸属于弱酸，对BG破坏作用较小，利于BG的催化，使得偶联作用长时间充分进行。
与此同时，随着人们饮食结构的调整，高血压、高血脂人群逐渐趋于年轻化，若不采取有效的调控手段，有发展为心脑血管疾病的趋势，严重的危及生命。目前相关醋豆辅助降血脂保健品的研发还处在起步阶段，但已有动物试验证明相关产品安全有效，具有明显的降血脂作用。
发明内容
本发明提供一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆的方法。本发明制备得到的醋豆口感好，其中丙二酰基异黄酮糖苷转化率最高，为80~90%；异黄酮苷元增加倍数为40~50倍；还原糖增加倍数为5~10倍。大豆内源酶中的BG活性与异黄酮苷元含量呈现一定的正相关，相关系数为0.8000~0.8500、与还原糖含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7500~0.8000。而且动物实验结果表明，其具备显著的抗氧化和辅助降血脂功能。
本发明通过缓冲液浸泡大豆预处理，大豆自身的吸水作用可激活大豆内源酶的活性并提供内源酶进行生化反应的特殊微环境，从而提升其生物转化效率，同时节省外加酶而大大降低成本；通过大豆内源酶生物转化与发酵食醋酸解协同作用将大豆中的异黄酮糖苷类物质水解成生物活性更高的异黄酮苷元、多糖类物质水解成还原糖、寡糖等活性糖类。
为了实现本发明目的，采用如下技术方案：
一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆的方法，其步骤如下：
1) 首先，选用优质东北大豆，采用提前预热的缓冲液进行低速恒温振荡浸泡，激活大豆内源糖苷酶并进行生物转化；
2) 其次，将经缓冲液浸泡后的大豆捞出，置于烘箱中烘干处理，控制温度为25~45 ℃，时间为30~60 min，捞出大豆后剩余的缓冲液用于下一批大豆的初次浸泡，循环利用；
3) 然后，将步骤2）经内源酶生物转化后的大豆，用已预热至25~45 ℃的、陈酿期为3年以上的发酵食醋浸泡进行酸解，通过大豆内源酶生物转化与酸解偶联制备具有降血脂作用的醋豆；
4) 最后，将步骤3）中得到的大豆进行低温冷冻干燥，真空包装，得到成品；
步骤1）中的缓冲液浸泡，具体通过吸水作用可激活大豆内源酶的活性，使其进行生物转化，提升其生物转化效率并降低成本；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，优选柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液，尤其优选柠檬酸盐缓冲液，相应pH为4~6，优选5~6，尤其优选5；所述大豆内源糖苷酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶；所述恒温振荡器转速为100~500 r/min，优选300~500 r/min，尤其优选500 r/min，恒温振荡器温度为25-50℃；所述浸泡时间为12~24 h，优选18~24 h，尤其优选24 h；
步骤3）中所述食醋为山西老陈醋、镇江香醋、福建红曲醋或天津独流老醋，优选山西老陈醋和福建红曲醋，尤其优选福建红曲醋；食醋总酸含量为6~12 g/100mL；所述大豆内源糖苷酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶；所述偶联表现为通过大豆内源酶生物转化和食醋酸解协同作用将大豆中的异黄酮糖苷类物质水解成生物活性更高的异黄酮苷元、多糖类物质水解成还原糖、寡糖等活性组分。所述浸泡时间为20~30 d。
一种如上所述大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备的降血脂醋豆，其特征在于：多种异黄酮糖苷发生了转化，其中丙二酰基异黄酮糖苷转化率最高，为80~90%；异黄酮苷元增加倍数为40~50倍；还原糖增加倍数为5~10倍，β-葡萄糖苷酶活性为1~10 U/g。大豆内源酶中的β-葡萄糖苷酶活性与异黄酮苷元含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7500~0.8000、与还原糖含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7000~0.7500。
所述醋豆，经动物功能试验证明，在高剂量的处理情况下，与对照组进行比较，该产品能够至少降低血清总胆固醇含量和甘油三脂水平分别为19.3%和19.0%，高密度脂蛋白水平至少升高23.7%，具有显著降血脂的功能。
本发明的优点及有益效果：
1）本发明采用大豆内源酶生物转化的方法，减轻了酶的污染，降低了固定化酶技术带来的高生产成本，提升了BG活性。
2）本发明采用大豆内源酶生物转化与酸解偶联的方法，避免强酸导致BG失活，使其能最大限度地发挥偶联作用。
3）本发明制备得到的醋豆，异黄酮苷元增加倍数为40~50倍；还原糖增加倍数为5~10倍。此外，与对照组进行比较，能够至少降低血清总胆固醇含量和甘油三脂水平分别为19.3%和19.0%，高密度脂蛋白水平至少升高23.7%，具有显著的降血脂功能。
具体实施例
下面用具体实施例，并参照数据进一步详细地描述并说明本发明的方法，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆方法，包括以下步骤：
1）选用优质东北大豆，采用提前预热的缓冲液进行低速恒温振荡浸泡，激活大豆内源糖苷酶并进行生物转化；
2）将经缓冲液浸泡后的大豆捞出，置于烘箱中低温烘干处理，控制温度为45 ℃，时间为30 min，捞出大豆后剩余的缓冲液用于下一批大豆的初次浸泡，循环利用；
3）选择经内源酶生物转化后的大豆，用已预热至45 ℃的、陈酿期为5年的发酵食醋进行酸解，通过大豆内源酶生物转化与酸解偶联制备具有降血脂作用的醋豆；
4）将步骤3）中得到的大豆进行低温冷冻干燥，真空包装，得到成品；
步骤1）中所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液， pH为5；步骤1）和3）中所述大豆内源糖苷酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步骤1）中所述恒温振荡器转速为500 r/min，温度为40℃（请补充）。
步骤1）中浸泡时间为24 h；步骤3）中浸泡时间为30 d。
步骤3）中所述食醋为福建红曲醋，其总酸含量为10 g/100mL。
对所得成品进行成分检测，结果为：
经处理的大豆中多种异黄酮糖苷发生了生物转化，其中丙二酰基异黄酮糖苷转化率最高，为90%；异黄酮苷元增加倍数为50倍；还原糖增加倍数为10倍。大豆内源酶中的BG活性与异黄酮苷元含量呈现一定的正相关，相关系数为0.8000、与还原糖含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7500。
动物实验：
1.实验材料与方法
实验用Wistar大鼠，雄性，健康清洁级，体重150~200 g，共48只，均由福建医科大学实验动物中心提供。检测环境条件，温度范围20~25 ℃，相对湿度范围50~70%，大鼠在试验前在动物房适应一周。
经本实施例1处理后的醋豆样品经粉碎后进行喂养，动物供试样品为不同浓度的产品稀释液，实验时用生理盐水将样品配制成各剂量。
仪器及试剂：胆固醇、胆盐、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)测定试剂盒。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
高脂饲料配方：78.8％基础饲料、1％胆固醇、10％蛋黄粉、10％猪油、0.2％胆盐。
剂量分组及受试样品给予时间：实验设三个剂量组和一个高脂对照组，以人体推荐量的5、10、20倍分别为三个剂量组。预防性给受试样品时间和治疗性给受试样品时间均为30 d。
采用脂代谢紊乱模型法-治疗性给受试动物
实验步骤：大鼠在清洁级动物实验室内喂饲基础饲料观察7天，取血前一天晚间禁食16h，不禁水，次日上午，大鼠眼内眦取血测定血清TC，TG，HDL-C水平，观察指标正常值。取高脂饲料喂Wistar雄性大鼠两周，测定血清TC，TG，HDL-C水平，与喂饲高脂饲料前比以确定是否已形成高脂血症模型。然后根据血清TC水平和体重随机分为4组，每组12只。四个组实验前Wistar雄性大鼠体重和血清水平无显著性差异。设1.35、2.7、5.4g/kg•bw（分别相当于推荐量的5、10、20倍）3个剂量组，一个高脂模型对照组（高脂组）。正式开始实验后，各组均继续用高脂饲料喂饲。各实验组大鼠经口灌胃给予受试溶液，对照组灌胃给予生理盐水，灌胃量为1.0ml/100g•bw。每天一次，连续21天，每周称重一次，并依此调整灌胃量。实验至第14、21天时分别采血测定血清TC、TG、HDL-C含量，采血前各组大鼠禁食16h。血清TC、TG和HDL-C含量的测定均用试剂盒。
实验数据统计：采用spss19.0和sigmaplot11.0软件进行数据汇总与分析。
2实验结果
2.1 降血脂醋豆对大鼠体重的影响
表1 治疗模型中四组大鼠实验前后的体重值(n =12, g, x±s)
由表1可见，大鼠给受试物前（0 d），各组体重没有显著差异。给受试物一定时期(7 d、14 d、21 d)后，与高脂对照组相比，其余各组体重均未出现显著差异(p ＞0.05)。表明该降血脂醋豆对大鼠生长发育没有不良影响。
2.2 降血脂醋豆对大鼠血清总胆固醇(TC)含量的影响
表2 降血脂醋豆对大鼠血清总胆固醇(TC)含量的影响（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:与模型对照组比较差异的显著性为 * p<0.05和 ** p<0.01
由表2可见，大鼠给予受试物前(0 d)，各实验组血清总胆固醇(TC)含量与高脂对照组比较无显著性差异(p ＞0.05)。给受试物一定时期(7 d、14 d、21 d)后，各时期高脂对照组与给受试物之前比较，血清TC升高，差异有极显著性(p ＜ 0.01)，表明高TC模型建立成功。与高脂对照组比较，其余各剂量组均显著降低(p ＜0.05)，实验至第21 d时，低剂量组下降9.47%。中剂量组下降14.40%，高剂量组下降19.34%。表明该降血脂醋豆具有降低血清总胆固醇(TC)含量的作用。
2.3 降血脂醋豆对大鼠血清甘油三酯(TG)含量的影响
表3 降血脂醋豆对大鼠血清甘油三酯(TG)含量的影响（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:与高脂模型组比较差异的显著性为 * p<0.05
由表3可见，大鼠给予受试物前(0 d)，各实验组血清甘油三脂(TG)含量与高脂对照组比较无显著性差异(p ＞0.05)。给受试物一定时期(14 d、21 d)后，各时期高脂对照组与给受试物之前比较，血清TG升高，差异有极显著性(p ＜0.01)，表明高TG模型建立成功。与高脂对照组比较，其余各剂量组均显著降低(p ＜0.05)，实验至第21 d时，低剂量组下降8.50%，中剂量组下降14.38%，高剂量组下降19.00%。表明该降血脂醋豆具有降低血清甘油三脂(TG)含量的作用。
2.4 辅助降血脂醋豆对大鼠高密度脂蛋白(HDL-C)含量的影响
表4 辅助降血脂醋豆对大鼠高密度脂蛋白(HDL-C)含量的影响（ｘ±ｓ,mmol/L,ｎ=12）
注:与高脂模型比较差异的显著性为 * p<0.05
由表4可见，给予受试物前(0 d)，各实验组高密度脂蛋白(HDL)含量与高脂对照组比较无显著性差异(p ＞0.05)。给受试物一定时期(14 d、21 d)后，各时期高脂对照组与给受试物之前比较，高密度脂蛋白(HDL)含量升高，差异有极显著性(p ＜0.01)，表明高HDL-C模型建立成功。与高脂对照组比较，其余各剂量组均显著降低(p ＜0.05)，实验至第21 d时，低剂量组升高11.86%，中剂量组升高18.64%，高剂量组升高23.72%。说明表明该降血脂醋豆具有增加高密度脂蛋白(HDL)含量的作用。
根据《保健食品功能学评价程序与检验方法》对辅助降血脂保健食品的判定标准（动物实验结果判定）对辅助降血脂功能结果判定：在血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇三项指标检测中血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该受试样品辅助降血脂功能动物实验结果阳性。
3. 结论
综上所述，采用制备实施例1所制得的降血脂醋豆具有降低血脂的作用。
实施例2
一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆的方法，主要包括以下步骤：
1）选用优质东北大豆，采用提前预热的缓冲液进行低速恒温振荡浸泡，激活大豆内源糖苷酶并进行生物转化；
2）将经缓冲液浸泡后的大豆捞出，置于烘箱中低温烘干处理，控制温度为35 ℃，时间为60 min，捞出大豆后剩余的缓冲液用于下一批大豆的初次浸泡，循环利用；
3）选择经内源酶生物转化后的大豆，用已预热至35 ℃的、陈酿期为3年的发酵食醋进行酸解，通过大豆内源酶生物转化与酸解偶联制备具有降血脂作用的醋豆；
4）将步骤3）中得到的大豆进行低温冷冻干燥，真空包装，得到成品；
步骤1）中所述缓冲液为醋酸盐缓冲液，相应pH为4；步骤1）和3）中所述大豆内源糖苷酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步骤1）中所述恒温振荡器转速为100 r/min，温度为30℃（请补充）。
步骤1）中浸泡时间为12 h；步骤3）中浸泡时间为20 d。
步骤3）中所述食醋为山西老陈醋，其总酸含量为6 g/100mL。
对所得成品进行成分检测，结果为：
多种异黄酮糖苷发生了转化，其中丙二酰基异黄酮糖苷转化率最高，为80%；异黄酮苷元增加倍数为40倍；还原糖增加倍数为6倍。大豆内源酶中的BG活性与异黄酮苷元含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7800、与还原糖含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7200。
实施例3
一种大豆内源酶生物转化和酸解偶联制备降血脂醋豆的方法，主要包括以下步骤：
1）选用优质东北大豆，采用提前预热的缓冲液进行低速恒温振荡浸泡，激活大豆内源糖苷酶并进行生物转化；
2）将经缓冲液浸泡后的大豆捞出，置于烘箱中低温烘干处理，控制温度为37℃，时间为60 min。捞出大豆后剩余的缓冲液用于下一批大豆的初次浸泡，循环利用；
3）选择经内源酶生物转化后的大豆，用已预热至40℃的、陈酿期为3年的发酵食醋进行酸解，通过大豆内源酶生物转化与酸解偶联制备具有降血脂作用的醋豆；
4）将步骤3）中得到的大豆进行低温冷冻干燥，真空包装，得到成品；
步骤1）中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，相应pH为6；步骤1）和3）中所述大豆内源糖苷酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶。
步骤1）中所述恒温振荡器转速为300 r/min，温度为45℃（请补充）。
步骤1）中浸泡时间为18 h；步骤3）中浸泡时间为25d。
步骤3）中所述食醋为镇江香醋，其总酸含量为12 g/100mL。
对所得成品进行成分检测，结果为：
多种异黄酮糖苷发生了转化，其中丙二酰基异黄酮糖苷转化率最高，为80%；异黄酮苷元增加倍数为60倍；还原糖增加倍数为9倍。大豆内源酶中的BG活性与异黄酮苷元含量呈现一定的正相关，相关系数为0.8000、与还原糖含量呈现一定的正相关，相关系数为0.7000。
动物实验方法参照实施例1，喂养时间延长至12周，实验结果表明：高剂量组血清总胆固醇（TC）水平至少降低23.9%，甘油三酯（TG）水平至少降低25.1%，同时高密度脂蛋白（HDL）水平至少升高15.6%，具有显著的抗氧化和辅助降血脂功能。
上述仅为本发明的较佳实施例，但本发明的设计与构思并不局限于此。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆属于侵犯本发明范畴的行为。