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1、10申请公布号CN104096381A43申请公布日20141015CN104096381A21申请号201410325624022申请日20140709B01D11/02200601B01D36/00200601B01D36/04200601B01D61/5820060171申请人郑州大学地址450001河南省郑州市科学大道100号申请人河南雍龙药食科技有限公司72发明人秦广雍王丽庞会利74专利代理机构北京康盛知识产权代理有限公司11331代理人李贵兰54发明名称一种乙醇和亚临界流体混合萃取天然产物有效成分的方法57摘要本发明公开了一种天然产物有效成分的提取方法，具体涉及同时提取天然产物中水。
2、溶性和脂溶性有效成分的方法，特别是涉及以一种乙醇和亚临界流体混合萃取天然产物有效成分的方法，属于天然产物有效成分萃取领域。本发明利用乙醇和亚临界流体混合作为萃取溶剂，在密闭、无氧、低压的萃取罐内，通过萃取、脱溶、膜分离大孔吸附树脂联用分离三个步骤对各组分分别进行分离纯化，最终得到天然产物高纯度的水溶性成分与脂溶性成分提取物的一种新型萃取与分离技术，在工业中具有广阔的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104096381ACN104096381A1/1页21一种乙醇和亚临界流体混。
3、合萃取天然产物有效成分的方法，其特征包括如下步骤1萃取将经过预处理的物料放入密闭萃取罐中，抽真空，向罐内注入一定比例一定体积分数的乙醇溶液和适量的亚临界流体作为混合萃取溶剂，至将物料完全浸没，在萃取过程中可以辅助搅拌以提高效率，根据物料的不同特性，在一定萃取条件下进行多次萃取；2脱溶萃取结束后，缓慢将液体溶剂完全放进分离罐，对萃取罐和分离罐分别进行蒸发脱溶处理，脱溶完成即得到同时包含脂溶性成分与水溶性成分的混合提取物；从萃取罐和分离罐中蒸发出的亚临界溶剂气体，经过隔膜压缩机压缩液化，流回溶剂储存罐，脱溶后的亚临界溶剂可循环利用；3膜分离混合溶剂提取物，通过10008000RPM离心，预处理去除。
4、部分固性杂质，之后通过微滤膜截留去除提取液中不溶性固体颗粒、菌体及少量大分子物质；再用超滤膜截留去除500020000DA蛋白质、鞣质及胶体物质等杂质，最后过反渗透膜浓缩超滤液，以去除少量小分子物质，膜分离操作整个过程的温度维持在2040；4树脂分离膜分离纯化液经过不同类型的大孔吸附树脂吸附后，选择合适体积分数的乙醇溶液进行洗脱，最终分离得到高纯度的脂溶性物质和水溶性物质。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中的物料可以是新鲜或经干燥处理的天然植物、微生物或动物，以及传统方法提取分离不彻底的或杂质含量高的提取物等。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中乙醇溶液的体积分数。
5、为5095。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中亚临界溶剂为易挥发、易于固液彻底分离的有机溶剂，包括丙烷、丁烷、二甲醚、四氟乙烷中的一种或几种的混合。5根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中物料、亚临界流体及乙醇溶液添加量的质量体积比为1150150。6根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中萃取条件为萃取时间为10120MIN，温度为050，搅拌速率为501000RPM，压力为相应萃取温度下对应的混合溶剂的饱和蒸气压，萃取14次。7根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3中粗分离中所用膜为微滤MF00510M、超滤UF1100NM、纳滤NF110NM和反。
6、渗透RO1NM中一种或几种。8根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于所述反渗透膜可以是醋酸纤维素膜或中空纤维反渗透膜。9根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4中大孔树脂可为D101型、DA201型、SIP系列、X5型、AB8型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD40型、DM130型、RA型、CHA111型、WLD型、H107型、NKA9型等中的一种或几种。10根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4中大孔吸附树脂洗脱溶剂乙醇溶液的体积分数范围为2595。权利要求书CN104096381A1/5页3一种乙醇和亚临界流体混合萃取天然产物有效成分的方法技术领域0001。
7、本发明公开了一种天然产物有效成分的提取方法，具体涉及同时提取天然产物中水溶性和脂溶性有效成分的方法，特别是涉及以一种乙醇和亚临界流体混合萃取天然产物有效成分的方法，属于天然产物有效成分萃取领域。背景技术0002动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许多内源性的化学成分统称作天然产物，其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、甾体化合物、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分，依据其溶解性可分为水溶性和脂溶性两。
8、大类。目前在天然产物有效成分萃取领域内，常用的方法主要有溶剂法、压榨法、蒸馏法和升华法等。0003溶剂提取法主要包括水煎煮、有机溶剂提取等。利用水作为溶剂时，对脂溶性成分的提取效果就相对欠佳；甲醇等亲水性有机溶剂对人体以及环境的危害和影响不容忽视。且这几种方法虽然普遍应用，但通常会造成有效成分损失，尤其是脂溶性成分；提取液中除有效成分外，往往杂质较多，给精制带来不利；高温操作会引起热敏性有效成分的大量分解。如中国专利2009102015585公布的“一种同时提取天然产物丹参中水溶性和脂溶性有效成分的方法”，其工艺中利用红外辐射放热同时提取出丹参中的水溶性和脂溶性有效成分，所用的提取溶剂是水与有。
9、机溶剂甲醇、乙醇等醇类组成的混合溶剂，将水作为提取水溶性成分的溶剂，有机溶剂提取脂溶性成分，但其混合溶剂的实质仍为一定浓度的醇溶液。0004亚临界水和亚临界乙醇萃取过程中，虽然可以通过控制萃取压力和温度，使水或乙醇的极性在较大范围内变化，以实现天然产物的有效成分从水溶性和脂溶性成分的连续提取，及选择性提取。2010105005003公开了亚临界水作为介质同时提取山药中多种生物活性成分的方法，虽然利用亚临界水提取法将水溶性山药多糖、尿囊素和脂溶性薯蓣皂苷同时提取出来，实现连续提取，但其提取过程经过三步升温过程完成，步骤繁琐，且提取温度高于100，会破坏部分多糖的结构，从而影响得率。亚临界水提取的。
10、专利、文献报道，大多是利用亚临界水的选择性提取，实现水溶性成分如专利号为2011100022191一种亚临界水提取米糠多糖的方法或者脂溶性成分如2013103011249亚临界水萃取茴香精油的制备方法的提取与分离。亚临界乙醇提取法中，专利号为2010101363095一种利用亚临界醇类从微藻湿藻泥中提取油脂的方法，其提取温度高于784，会破坏天然产物中热敏性物质的活性。目前，单一的亚临界流体丙烷、丁烷、二甲醚、四氟乙烷萃取，特别适于天然产物中脂溶性成分的萃取，而不能实现水溶性成分的充分提取。0005以上不同萃取方法各有利弊，很难做到水溶性和脂溶性有效成分兼顾萃取，因此寻找一种低温、高效、环保，。
11、同时兼顾脂溶性成分和水溶性成分的提取方法显得尤为重要。说明书CN104096381A2/5页4发明内容0006本发明所要解决的技术问题，以乙醇和亚临界流体混合作为萃取溶剂同时提取天然产物中水、脂组分，有效改进传统提取、分离、纯化和浓缩过程方法的不足之处，在较短周期内得到纯度相对更高的产品，且环保、能够较大程度保留热敏性物质的活性、提取成本相对低廉、可进行工业化规模生产。下面具体说明实现本发明的方法步骤和实现方式00071萃取将经过预处理的物料放入密闭萃取罐中，抽真空，向罐内注入一定比例一定体积分数的乙醇溶液和适量的亚临界流体作为混合溶剂，将物料完全浸没，在萃取过程中可以辅助搅拌以提高效率。根据。
12、物料的不同特性，物料、亚临界流体及乙醇溶液添加量的质量体积比W/V/V为1150150，乙醇溶液的体积分数为5095，萃取时间为10120MIN，温度为050，搅拌速率为501000RPM，萃取14次，压力为相应萃取温度下对应的混合溶剂的饱和蒸气压。00082脱溶萃取结束后，缓慢将液体溶剂完全放进分离罐，对萃取罐和分离罐分别进行蒸发脱溶处理，脱溶完成即得到同时包含脂溶性成分与水溶性成分的混合提取物；然后从萃取罐和分离罐中蒸发出的亚临界溶剂气体，经过隔膜压缩机压缩液化，流回溶剂储存罐，循环使用。00093膜分离混合溶剂提取物，通过离心10008000RPM预处理去除部分固性杂质，之后通过005M。
13、02M微滤膜，截留去除提取液中不溶性固体颗粒、菌体及少量大分子物质；再用500020000DA超滤膜截留去除蛋白质、鞣质及胶体物质等杂质，通过反渗透膜醋酸纤维素膜、中空纤维反渗透膜浓缩超滤液，以去除少量小分子物质，膜分离操作整个过程，在型号为HCDGM252X多功能膜实验系统成都和诚过滤技术有限公司上完成。00104树脂分离膜分离纯化液经过最佳类型的大孔吸附树脂如D101、DA201、AB8、D301等吸附，选择合适体积分数的乙醇溶液2595，从天然产物提取液中，最终分离得到高纯度的脂溶性物质和水溶性物质。0011所述物料可以是新鲜或经干燥处理的天然植物、微生物或动物，以及传统方法提取分离不彻。
14、底的或杂质含量高的提取物等。0012所述亚临界溶剂为易挥发性有机溶剂，易于固液彻底分离，包括丙烷、丁烷、二甲醚、四氟乙烷中的一种或几种的混合。0013所述物料、亚临界流体及乙醇溶液添加量的质量体积比W/V/V为1150150。0014所述乙醇溶液的体积分数为5095。0015所述混合提取条件温度为050，压力为相应温度下对应的饱和蒸气压，时间为10120MIN，搅拌速率为501000RPM。0016所述脱溶后的亚临界溶剂可循环利用。0017所述分离得到的脂溶性物质与水溶性物质可分别进行后续的加工处理。0018所述提取液预处理离心转速为10008000RPM。0019所述的膜分离温度2040。0。
15、020所述膜为微滤MF00510M、超滤UF1100NM、纳滤NF110NM和反渗透RO1NM中一种或几种。说明书CN104096381A3/5页50021所述大孔树脂可为D101型、DA201型、SIP系列、X5型、AB8型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD40型、DM130型、RA型、CHA111型、WLD型混合型、H107型、NKA9型等中的一种或几种。0022所述大孔吸附树脂洗脱溶剂乙醇溶液的体积分数范围为2595对于不同材料的不同成分所用洗脱浓度不同，所列只为总的乙醇体积范围，具体情况具体分析。0023本发明利用乙醇和亚临界流体混合作为萃取溶剂，在密闭、无氧、低压的。
16、萃取罐内，依据有机物相似相溶的原理，通过物料与萃取溶剂在浸泡过程中的分子扩散过程，使物料中的脂溶性成分和水溶性成分转移到萃取溶剂中，最后通过减压蒸发过程将混合提取物中的亚临界流体脱除，结合膜分离大孔吸附树脂联用技术对各组分分别进行分离纯化，最终得到天然产物的高纯度水溶性成分与脂溶性成分提取物的一种新型萃取与分离技术。0024本发明的优越性在于00251提取过程工艺简单、设备投入低，适合大规模生产；萃取温度较低通常情况下为室温，不会破坏热敏性物质的天然活性；产品提取程度高，周期短，效率高；混合溶剂的使用，增加了天然产物中脂溶性成分和水溶性成分提取的选择性和效率；溶剂可循环利用，不会对环境造成污染。
17、，分离得到的脂溶性成分与水溶性成分中亚临界溶剂残留均低于1PPM。00262分离、纯化和浓缩过程膜分离大孔吸附树脂联用机制的选择，避免杂质对树脂柱的污染，增加了树脂柱的使用寿命，且分离出产品纯度要高于只用一种方法分离浓缩的纯度。0027以乙醇和亚临界流体混合萃取技术获得天然产物中的有效成分，结合膜分离大孔树脂吸附对所萃取的样品进行分离纯化，克服了传统萃取法如水煎煮、溶剂提取等和分离法如溶剂萃取分离、沉淀分离等周期长、效率低、除杂效果不理想、有效成分损失等缺点，是可以得到高纯度的天然产物水溶性成分与脂溶性成分提取物的一种新型萃取与分离技术。附图说明0028图1提取流程图具体实施方式0029实施例。
18、10030取200G刺槐含水量13，粉碎并过80目筛子后，置于密闭萃取罐中，加入体积分数为70乙醇1800ML，关闭进料通道后，抽至真空，向萃取罐中注入二甲醚溶剂，将物料完全浸没，物料、亚临界二甲醚及乙醇溶液添加量的质量体积比W/V/V为169。在温度为25压力为相应温度下对应的饱和蒸气压，搅拌速率为700RPM的条件下，萃取50MIN；萃取结束后，缓慢将混合溶剂完全放进分离罐，对萃取罐和分离罐分别进行蒸发脱溶处理，最终得到同时含有脂溶性成分与水溶性成分的提取物。从萃取罐和分离罐中脱除的亚临界溶剂，经过隔膜压缩机压缩液化，液态的溶剂流回溶剂储存罐，循环使用。刺槐提取物和乙醇混合体系，经过多功能。
19、膜实验系统7000RMP离心，去除肉眼可见固性杂质，经过01M微滤膜澄清过滤，然后经过10000DA的超滤膜除杂过滤，最后经过150DA的纳滤膜说明书CN104096381A4/5页6浓缩脱除提取物中的乙醇。脱除乙醇后，对刺槐提取物进行分离纯化，得到的刺槐浓缩液经D101型大孔吸附树脂吸附后，使用70乙醇解吸吸附树脂柱上的刺槐黄酮；然后再用NK11型大孔吸附树脂吸附后，用80乙醇解吸吸附树脂柱上的刺槐多酚。经福林酚比色法、高效液相色谱法检测，水溶性成分刺槐多酚的提取率为019，脂溶性成分刺槐黄酮的提取率为129，高于索氏提取法的106提取率杨兆艳，孙元琳，陈静刺槐叶中总黄酮提取工艺的研究J,试。
20、验研究,200986164，提取物中亚临界溶剂残留均低于1PPM。0031实施例20032取200G干燥的桑叶含水量13，粉碎并过80目筛子后，置于密闭萃取罐中，加入体积分数为70乙醇400ML，关闭进料通道后，抽至真空，向萃取罐中注入二甲醚溶剂，将物料完全浸没，物料、亚临界二甲醚及乙醇溶液添加量的质量体积比W/V/V为1132。在45温度压力为该温度对应的饱和蒸汽压，搅拌速率为600RPM的条件下萃取30MIN；萃取结束后，将混合溶剂放入分离罐中，对萃取罐和分离罐分别进行蒸发脱溶处理，再次向萃取罐中注入体积分数为70乙醇400ML，抽真空，注入二甲醚溶剂进行萃取。重复三次，最终得同时含有脂溶。
21、性成分与水溶性成分的提取物，其余步骤同上。0033D101型大孔吸附树脂吸附桑叶黄酮和桑叶多糖，NKA9型大孔吸附树脂吸附桑叶生物碱。经苯酚硫酸显色法、雷氏盐比色法和高效液相色谱法检测，水溶性成分桑叶多糖的提取率分别为298，而传统水提取法仅约等于251赵峻,高岚桑叶多糖的降糖降脂作用J天津中医药,2004,216505506；水溶性成分桑叶生物碱的提取率为095，而传统水提取法仅约等于050邓伟杰,孙智平,罗新根,吴新荣正交试验设计优化桑叶总生物碱提取工艺J中华中医药学刊,2012,303608609，醇提取法约等于040刘凡,黄勇,廖森泰,肖更生,邹宇晓,施英,穆利霞,刘军,沈维治应用响应。
22、面法优化桑叶多糖、黄酮和生物碱联合提取工艺条件J蚕业科学,2013,39305680575；脂溶性成分桑叶黄酮提取率为169，而传统水提取法仅约为114张亮亮,汪咏梅,徐曼,吴冬梅,陈笳鸿不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究J时珍国医国药,2013,24510641066，醇提取法约为072杨虎,马燮,陈虹,杨郭,蔡文秋,黄中林桑叶中黄酮类化合物的提取工艺研究J应用化工,2008,375520522，提取物中亚临界溶剂残留均低于1PPM。0034实施例30035取干燥的杜仲皮含水量131000KG，粉碎后过100目筛子，置于密闭萃取罐中，加入体积分数为70的乙醇溶液，抽真空，向罐内注入丁烷溶。
23、剂将物料完全浸没，物料、亚临界丁烷及乙醇溶液添加量的质量体积比W/V/V为155，萃取条件为时间30MIN，温度30压力为该温度下对应的饱和蒸汽压，搅拌速率为500RPM。萃取结束后，将混合溶剂放入分离罐中，对萃取罐和分离罐分别进行蒸发脱溶处理，脱溶完成即得同时含有脂溶性成分与水溶性成分的杜仲皮提取物，其余步骤同上。其中，200NM的无机陶瓷膜氧化铝膜，有效截留脂溶性成分白桦脂酸、谷甾醇、熊果酸等；D101、S8、AB8和LD605等型大孔吸附树脂吸附杜仲皮中水溶性有效成分生物碱、绿原酸、苷类、酚等。经高效液相色谱法、紫外可见分光光度法和硝酸铝亚硝酸钠比色法等方法的检测，所得水溶性成分与脂溶性成分提取率分别可达95和98，且亚临界溶剂残留均低于1PPM。说明书CN104096381A5/5页70036以上列举的仅是实现本发明的几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书CN104096381A1/1页8图1说明书附图CN104096381A。