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1、(10)申请公布号 CN 103798649 A (43)申请公布日 2014.05.21 CN 103798649 A (21)申请号 201410088992.8 (22)申请日 2014.03.11 A23L 1/20(2006.01) A23L 1/30(2006.01) (71)申请人 聊城大学 地址 252059 山东省聊城市东昌府区湖南路 1 号聊城大学生命科学学院 (72)发明人 张扬 杜秀菊 周秀玲 石海英 徐伟 王奎明 冯玮 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 吕利敏 (54) 发明名称 一种阿胶纳豆的制备方法 (57) 摘要 一种阿胶。
2、纳豆的制备方法， 包括以下步骤 ： 黄 豆和 / 或黑豆浸泡清洗、 蒸煮、 阿胶液及阿胶浆的 制备、 菌种发酵液的制备、 接种、 一次发酵、 二次发 酵、 三次冷藏发酵制得本发明的阿胶纳豆。 本发明 采用的三次发酵技术， 在不影响纳豆正常发酵的 同时， 利用纳豆所产生的蛋白酶、 淀粉酶、 脂酶等 多种功能因子对阿胶进行适当的水解， 酶解产物 不仅易被人体吸收利用， 而且还具有促进发酵后 熟的作用。 阿胶的加入可改善纳豆的培养成分， 有 效降低氨味的产生， 使国内消费者更容易接受。 本 发明工艺合理， 操作简单， 可实现工业化生产， 所 获得的阿胶纳豆不仅具有纳豆的溶栓、 降三高、 延 缓衰老、。
3、 提高记忆力、 护肝美容的功效， 还具有阿 胶的滋阴润燥的保健效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103798649 A CN 103798649 A 1/2 页 2 1. 一种阿胶纳豆的制备方法， 包括如下步骤 ： （1） 取黄豆和或黑豆， 经过除石、 除杂、 精选后， 清洗后加水浸泡， 浸泡后的原料蒸煮， 收集蒸煮后的原料和煮出液， （2） 阿胶浆、 阿胶液的制备 ： 取阿胶块粉碎， 加水搅拌溶解制得阿胶浆 ； 取制得的阿。
4、胶 浆与步骤 （1） 制得的煮出液按体积比 ： 0.2-1:1-2（V/V） 的比例混合， 制得阿胶液 ； 制得的 阿胶浆、 阿胶液杀菌后备用 ； （3） 菌种发酵液的制备 ： 取纳豆菌悬液接种到液态培养在液体培养基中， 于 30-35、 150-500r/min 条件下扩大培养 18-20 小时制得菌种发酵液， （4） 接种 ： 取步骤 （2） 杀菌后的阿胶液添加到步骤 （1） 蒸煮后的原料中， 再接种步骤 （3） 制得的菌种发酵液 ； 所述阿胶液添加量为蒸煮后原料质量的 1%-10%， 菌种发酵液的接种量为蒸煮后原料质 量的 0.1%-1% ； （5） 一次发酵 ： 将步骤 （4） 接种后。
5、的物料混合均匀， 于 35-42下保温发酵 12-24 小时 ； （6） 二次发酵 ： 一次发酵结束后加入步骤 （2） 制得的阿胶浆， 混合均匀后在 30-35温 度下二次发酵 24-36 小时， 阿胶浆的添加量为混合物料质量的 5-10% ； （7） 三次发酵 ： 经步骤 （6） 二次发酵后的物料置于 4-10冷藏发酵 6-10 小时， 即制得 阿胶纳豆。 2. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 的黄豆和黑豆按 任意质量配比混合。 3. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 的中蒸煮是浸泡 后的原料在 80-90下蒸。
6、煮 2-3 小时或在 20-100kPa 的压力下蒸煮 10-40 分钟。 4. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中阿胶浆的制 备， 是将粉碎后阿胶， 按料液比 ： 1:5-20 的比例加入 75-95的去离子水或高纯水中， 搅拌 溶解制得。 5. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中阿胶浆、 阿胶 液的杀菌是将制得的阿胶浆、 阿胶液经加热到 62 65， 保持 30 分钟进行巴氏杀菌。 6. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3）中， 所述的 液体培养基的原料质量百分比如下 ：。
7、 葡萄糖 1%， 大豆胨 0.5%， MgSO40.04%， ZnSO40.01%， KH2PO40.1%， 步骤 （2） 制得的阿胶液 10-50%， 其余为去离子水。 7. 根据权利要求 6 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 所述的液体培养基的制 备方法如下 ： 按配比取葡萄糖、 大豆胨、 MgSO4、 ZnSO4、 KH2PO4、 阿胶液和去离子水混合， pH 值 自然， 在 121条件下灭菌 20 分钟， 灭菌后的培养基冷却至 40以下备用。 8. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 纳豆菌悬液 中纳豆菌的含量在 108-109个 /。
8、ml。 9. 根据权利要求 8 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 纳豆菌悬液 采用下述方法制得， 将纳豆菌菌种接种于固体培养基上置于 30条件下培养 1.5-3 天进行 活化菌， 使用时用生理盐水或水将纳豆菌从固体培养基的斜面洗脱下来， 制得纳豆菌悬液， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量在为 108个 /ml。 10. 根据权利要求 1 所述的阿胶纳豆的制备方法， 其特征在于， 步骤 （5） 中， 一次发酵， 权 利 要 求 书 CN 103798649 A 2 2/2 页 3 将步骤 （4） 接种后的物料混合均匀平铺在发酵盘上， 平铺厚度 5cm， 于 38-40下保温。
9、发 酵 12-24 小时发酵期间控制发酵盘湿度在 75-95wt%。 权 利 要 求 书 CN 103798649 A 3 1/9 页 4 一种阿胶纳豆的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种阿胶纳豆的制备方法， 属于保健食品制造领域。 背景技术 0002 纳豆作为一种发酵食品， 是纳豆菌利用大豆等原料发酵获得的， 纳豆已经有上千 年的历史。因其含有纳豆激酶、 氧化物歧化酶、 过氧化氢酶、 蛋白酶、 淀粉酶、 脂酶及纳豆异 黄酮、 皂青素等多种功能因子， 所以纳豆具有降低血脂、 降低胆固醇、 软化血管、 预防高血压 和动脉硬化 ； 改善便秘、 清除体内致癌物质、 预防大肠癌 ； 延缓衰老。
10、、 提高记忆力、 护肝美容 等保健功能。日本人相信 “ 多吃纳豆头脑聪明骨头硬 “， 因此纳豆也成为日本中小学生重 要配餐食材之一。 不光是中小学校， 在日本的老年人福利院中， 纳豆作为一种延年益寿的食 品， 也有很多老人一直在食用。特别是在 1987 年日本生理学教授须见洋行博士从纳豆中发 现纳豆激酶， 并证实纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用后， 纳豆更是名声大噪。 纳豆激酶是 纳豆菌在发酵的过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶， 研究表明， 纳豆激酶能够有效的清除人 体血液内的血栓， 而且对高血压、 衰老、 中风、 肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效， 并 且无毒副作用， 因此纳豆激酶被众多的公司。
11、开发成中老年人的保健食品。 此外， 纳豆菌本身 作为一种益生菌对调理人体肠道也有很好的作用。因此， 纳豆成为了世界上公认的药食同 源的产品。 由于日本生产的纳豆产品具有特殊的氨味， 中国消费者不习惯这种口味， 所以使 得这种价廉物美的发酵大豆制品无法进入正常人的饮食和餐桌。 国内很多学者通过改变培 养条件、 调整原料配方等进行了一些探索， 开着加入其它配料进行发酵的技术研究， 如改变 培养条件、 调整原料配方等进行了探索也取得一定的研究效果。 0003 阿胶始载于 神农本草经 ， 是马科动物驴的皮去毛后熬制而成的胶块， 为滋阴润 燥、 补血止血的良药， 在我国已有 2000 多年的生产和要用历。
12、史。阿胶的主要成分为胶原蛋 白及其水解产物并含铁、 锌、 钙等 20 多种益于人体的微量元素。临床上阿胶常用于治疗血 虚萎黄、 眩晕心悸、 心烦不眠、 肺燥咳嗽等方面， 是人们常用的治病养生、 滋补保健的中药之 一， 被誉为 “ 补血圣药 “、 “ 滋补国宝 “， 与人参、 鹿茸一起被誉为 “ 中药三宝 “。现今， 随着 中西医结合的逐步加强， 中药现代化研究的不断深入， 阿胶的临床应用范围也不断拓宽， 己 成为治疗多种疾病， 特别是一些疑难病症和滋补保健的重要中药。 传统的阿胶为胶块制剂， 服用时需要加水烊化， 服用起来非常的不方便， 目前利用现代药物制剂技术， 开发的有口服 液， 泡腾片，。
13、 冲剂等多种剂型， 大大方便了服用。 发明内容 0004 针对现有技术的不足， 本发明提供一种阿胶纳豆的制备方法， 本发明通过三次发 酵技术， 在先接种纳豆菌菌种发酵后， 向培养体系中添加阿胶浆进行二次发酵， 最后低温后 进行熟发酵， 发酵结束后所产生的阿胶纳豆可直接食用也可添加调味剂进行调味后食用， 也可在进行冷冻干燥等深加工后食用。 0005 一种阿胶纳豆的制备方法， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 103798649 A 4 2/9 页 5 0006 （1） 取黄豆和或黑豆， 经过除石、 除杂、 精选后， 清洗后加水浸泡， 浸泡后的原料 蒸煮， 收集蒸煮后的原料和煮出液， 0007 。
14、（2） 阿胶浆、 阿胶液的制备 ： 取阿胶块粉碎， 加水搅拌溶解制得阿胶浆 ； 取制得的 阿胶浆与步骤 （1） 制得的煮出液按体积比 ： 0.2-1:1-2（V/V） 的比例混合， 制得阿胶液 ； 制 得的阿胶浆、 阿胶液杀菌后备用 ； 0008 （3）菌种发酵液的制备 ： 取纳豆菌悬液接种到液态培养在液体培养基中， 于 30-35、 150-500r/min 条件下扩大培养 18-20 小时制得菌种发酵液， 0009 （4） 接种 ： 取步骤 （2） 杀菌后的阿胶液添加到步骤 （1） 蒸煮后的原料中， 再接种步 骤 （3） 制得的菌种发酵液 ； 0010 所述阿胶液添加量为蒸煮后原料质量的 。
15、1%-10%， 菌种发酵液的接种量为蒸煮后原 料质量的 0.1%-1% ； 0011 （5） 一次发酵 ： 将步骤 （4） 接种后的物料混合均匀， 于 35-42下保温发酵 12-24 小时 ； 0012 （6）二次发酵 ： 一次发酵结束后加入步骤 （2）制得的阿胶浆， 混合均匀后在 30-35温度下二次发酵 24-36 小时， 阿胶浆的添加量为混合物料质量的 5-10% ； 0013 （7） 三次发酵 ： 经步骤 （6） 二次发酵后的物料置于 4-10冷藏发酵 6-10 小时， 即 制得阿胶纳豆。 0014 本发明的黄豆和黑豆按任意质量配比混合。 0015 本发明制得的阿胶纳豆为具有拉丝的颗。
16、粒分散状， 可直接食用也可添加调味剂进 行调味后食用， 也可在进行冷冻干燥等深加工后食用。 0016 本发明优选的， 步骤 （1） 的中蒸煮是浸泡后的原料在 80-90下蒸煮 2-3 小时或在 20-100kPa 的压力下蒸煮 10-40 分钟。 0017 本发明优选的， 步骤 （2） 中阿胶浆的制备， 是将粉碎后阿胶， 按料液比 ： 1:5-20 的 比例加入 75-95的去离子水或高纯水中， 搅拌溶解制得。 0018 本发明优选的， 步骤 （2） 中阿胶浆、 阿胶液的杀菌是将制得的阿胶浆、 阿胶液经加 热到 62 65， 保持 30 分钟进行巴氏杀菌。 0019 本发明优选的， 步骤 （3。
17、） 中， 所述的液体培养基的原料质量百分比如下 ： 葡萄糖 1%， 大豆胨 0.5%， MgSO40.04%， ZnSO40.01%， KH2PO40.1%， 步骤 （2） 制得的阿胶液 10-50%， 其余 为去离子水。 0020 进一步优选的， 所述的液体培养基的制备方法如下 ： 按配比取葡萄糖、 大豆胨、 MgSO4、 ZnSO4、 KH2PO4、 阿胶液和去离子水混合， pH 值自然， 在 121条件下灭菌 20 分钟， 灭菌 后的培养基冷却至 40以下备用。 0021 本发明优选的， 步骤 （3） 中， 纳豆菌悬液中纳豆菌的含量在 108-109个 /ml。 0022 本发明优选的，。
18、 步骤 （3） 中， 纳豆菌悬液采用下述方法制得， 将纳豆菌菌种接种于 固体培养基上置于 30条件下培养 1.5-3 天进行活化菌， 使用时用生理盐水或水将纳豆菌 从固体培养基的斜面洗脱下来， 制得纳豆菌悬液， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量在为 108个 /ml。 0023 本发明优选的， 步骤 （5） 中， 一次发酵， 将步骤 （4） 接种后的物料混合均匀平铺在 发酵盘上， 平铺厚度 5cm， 于 38-40下保温发酵 12-24 小时发酵期间控制发酵盘湿度在 说 明 书 CN 103798649 A 5 3/9 页 6 75-95wt%。 0024 本发明所述的阿胶纳豆的制备方法， 其中， 。
19、所述的纳豆菌菌种可以通过市场购买 获得， 也可以通过本领域现有技术从含有纳豆菌的食品中分离获得， 本领域技术人员可以 根据实际需要进行选择。 0025 本发明的有益效果 ： 0026 1、 本发明的阿胶纳豆的制备方法采用了三次发酵技术， 在不影响纳豆正常发酵的 同时， 利用纳豆所产生的蛋白酶、 淀粉酶、 脂酶等多种功能因子对阿胶进行适当的水解， 酶 解产物不仅易被人体吸收利用， 而且还具有促进发酵后熟的作用。 0027 2、 本发明所获得的阿胶纳豆不仅具有纳豆的溶栓、 降三高、 延缓衰老、 提高记忆 力、 护肝美容的功效， 还具有阿胶的滋阴润燥的保健效果。 0028 3、 本发明阿胶的加入可改。
20、善纳豆的培养成分， 有效降低氨味的产生， 使国内消费 者更容易接受 ； 而纳豆中所含的多种酶又能很好的酶解阿胶使其更容易被人体吸收利用。 因此， 本发明不是单纯的将阿胶与纳豆混合在一起， 而是真正的将两者有机结合起来， 在获 得纳豆的医疗保健作用的同时， 进补阿胶以达到更好的健康效果。 0029 4、 本发明的制备工艺步骤中将蒸煮液配制成阿胶液， 不仅提高了原料的利用率， 降低了生产成本， 而且阿胶液中丰富的蛋白质、 氨基酸以及微量元素对菌种的生长具有促 进作用， 从而提高了产品的品质。 附图说明 0030 图 1 为胰岛素标准样品的凝胶排阻色谱分析图谱 ； 0031 图 2 为市售阿胶的凝胶。
21、排阻色谱分析图谱 ； 阿胶块购自山东东阿阿胶股份有限公 司， 产品规格为 250g/ 盒 ； 0032 图 3 为实施例 1 样品的凝胶排阻色谱分析图谱 ； 0033 图 4 为实施例 2 样品的凝胶排阻色谱分析图谱 ； 0034 图 5 为实施例 3 样品的凝胶排阻色谱分析图谱 ； 0035 图 6 为市售纳豆的凝胶排阻色谱分析图谱 ； 具体实施方式 0036 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 以下实施例旨在说明本发明但不限 于此。 0037 实施例中的阿胶块购自山东东阿阿胶股份有限公司， 产品规格为 250g/ 盒。 0038 实施例 1 的纳豆菌购自北京川秀科技有限公司， 产品规。
22、格为 2.5g/ 粒。 0039 实施例 2、 3 的纳豆菌为聊城大学生物工程实验室使用大连美屋食品有限公司生 产的纳豆中分离获得。 0040 葡萄糖， 大豆胨， MgSO4， ZnSO4， KH2PO4均购自国药集团化学试剂有限公司 0041 实验例中的美屋纳豆购自大连美屋食品有限公司， 燕京纳豆购自北京燕京中发生 物技术有限公司， 西尾纳豆购自珠海保税区西尾食品有限公司。 0042 实施例 1 0043 一种阿胶纳豆的制备方法， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 103798649 A 6 4/9 页 7 0044 （1） 取黄豆经除石、 除杂、 精选后， 清洗后加水浸泡， 春冬季节最少。
23、浸泡 12 小时， 夏 秋季节最少浸泡 8 小时， 以保证黄豆吸水饱满， 浸泡期间换 3 次水， 将浸泡好的黄豆沥干在 常压下于 90蒸煮 2 小时， 收集蒸煮后的原料和煮出液， 。 0045 （2） 取阿胶块粉碎后， 按照阿胶粉与去离子水质量体积比 ： 1:10（W/V） 的比例放 入 85的去离子水中， 搅拌溶解制成阿胶浆 ； 将制得的阿胶浆与步骤 （1） 制得的煮出液按 体积比 ： 0.5:1（V/V） 的比例混合， 制得阿胶液， 阿胶浆、 阿胶液加热到 62， 保持 30 分钟进 行巴氏杀菌后备用 ； 0046 （3） 菌种发酵液的制备 ： 用接种环取保藏纳豆菌菌种一环以划线法接种于固。
24、体培 养基上固体培养基组分如下 ： 牛肉浸膏 3.0g， 蛋白胨 5.0g， 葡萄糖 10g， 酵母浸膏 1.0g， 琼 脂 15g， 水 1000ml， pH7.0， 接种量按常规进行接种， 接种后置于培养箱中在 30条件下培养 1.5-3天以活化菌种。 使用时用生理盐水或水将纳豆菌从培养斜面洗脱下来， 制得纳豆菌悬 液， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量在为 108个 /ml。 0047 按质量百分比取， 葡萄糖 1%， 大豆胨 0.5%， MgSO40.04%， ZnSO40.01%， KH2PO40.1%， 阿 胶液 10%， 去离子水 88.35% 混合， pH 值自然， 形成液态培养基，。
25、 将液态培养基分装到 500ml 三角瓶中， 装量为100ml， 在121条件下灭菌20分钟。 灭好的液态培养基冷却到40以下 后， 将液态培养基接种纳豆菌悬液 10ml， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量为 108个 /ml， 接种 后在 32， 200rpm 的条件下扩大培养 18 小时后， 制得菌种发酵液， 0048 （4） 接种 ： 取步骤 （2） 制得的阿胶液添加到步骤 （1） 蒸煮后的原料中， 再接种步骤 （3） 制得的菌种发酵液充分混合均匀 ； 阿胶液添加量为蒸煮后原料质量的 2%， 菌种发酵液 的接种量为蒸煮后原料质量的 0.2% ； 0049 （5） 一次发酵 ： 将步骤 （4） 。
26、接种后的物料平铺在发酵盘上， 平铺厚度为 4cm， 于 36 保温发酵 18 小时， 直至产生丝状粘液为止， 发酵期间控制发酵盘湿度在 85wt%。 0050 （6） 二次发酵 ： 一次发酵结束后加入步骤 （2） 制得的阿胶浆， 混合均匀后在 32温 度下二次发酵 26 小时， 阿胶浆的添加量为混合物料质量的 5% ； 0051 （7） 三次发酵 ： 经步骤 （6） 二次发酵后的物料置于 4冷藏发酵 8 小时， 即制得本 发明的阿胶纳豆。 0052 实施例 2 0053 一种阿胶纳豆的制备方法， 包括如下步骤 ： 0054 （1） 取黑豆经除石、 除杂、 精选后， 清洗后加水浸泡， 春冬季节最。
27、少浸泡 16 小时， 夏 秋季节最少浸泡12小时， 以保证黄豆吸水饱满， 浸泡期间换3次水， 将浸泡好的黑豆沥干置 于高压蒸煮锅中在 80kPa 的条件下蒸煮 30 分钟。收集蒸煮后的原料和煮出液， 蒸煮好的黑 豆在粉碎机中进行粉碎， 粉碎过 5 目筛为适， 备用。 0055 （2） 取阿胶块粉碎后， 按照阿胶粉与去离子水质量体积比 ： 1:8（W/V） 的比例放入 90的去离子水中， 搅拌溶解制成阿胶浆 ； 将制得的阿胶浆与步骤 （1） 制得的煮出液按体 积比 ： 1:1（V/V） 的比例混合， 制得阿胶液， 阿胶浆、 阿胶液加热到 63， 保持 30 分钟进行巴 氏杀菌后备用 ； 0056。
28、 （3） 菌种发酵液的制备 ： 用接种环取保藏纳豆菌菌种一环以划线法接种于固体培 养基上固体培养基组分如下 ： 牛肉浸膏 3.0g， 蛋白胨 5.0g， 葡萄糖 10g， 酵母浸膏 1.0g， 琼 脂 15g， 水 1000ml， pH7.0， 接种量按常规进行接种， 接种后置于培养箱中在 30条件下培养 说 明 书 CN 103798649 A 7 5/9 页 8 1.5-3天以活化菌种。 使用时用生理盐水或水将纳豆菌从培养斜面洗脱下来， 制得纳豆菌悬 液， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量在为 108个 /ml。 0057 按质量百分比取， 葡萄糖 1%， 大豆胨 0.5%， MgSO40.04。
29、%， ZnSO40.01%， KH2PO40.1%， 阿 胶液 8%， 去离子水 90.35% 混合， pH 值自然， 形成液态培养基， 将液态培养基分装到 500ml 三 角瓶中， 装量为 100ml， 在 121条件下灭菌 20 分钟。灭好的液态培养基冷却到 40以下 后， 将液态培养基接种从培养斜面洗脱下来的纳豆菌悬液 10ml， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的 含量为 108 个 /ml， 接种后在 32， 200rpm 的条件下扩大培养 18 小时后， 制得菌种发酵液， 0058 （4） 接种 ： 取步骤 （2） 制得的阿胶液添加到步骤 （1） 蒸煮后的原料中， 再接种步骤 （3） 制得的菌。
30、种发酵液充分混合均匀 ； 阿胶液添加量为蒸煮后原料质量的 3%， 菌种发酵液 的接种量为蒸煮后原料质量的 0.4% ； 0059 （5） 一次发酵 ： 将步骤 （4） 接种后的物料平铺在发酵盘上， 平铺厚度为 3cm， 于 36 保温发酵 18 小时， 直至产生丝状粘液为止， 发酵期间控制发酵盘湿度在 90wt%。 0060 （6） 二次发酵 ： 一次发酵结束后加入步骤 （2） 制得的阿胶浆， 混合均匀后在 30温 度下二次发酵 30 小时， 阿胶浆的添加量为混合物料质量的 8% ； 0061 （7） 三次发酵 ： 经步骤 （6） 二次发酵后的物料置于 4冷藏发酵 10 小时， 即制得本 发明。
31、的阿胶纳豆。 0062 （8） 将三次发酵后所得的产物置冷冻干燥真空瓶中 -35冷冻过夜后置于预热后 的冷冻干燥机上， 低温真空冷冻 32 小时后得到的干燥纳豆即为冻干的阿胶纳豆。 0063 实施例 3 0064 一种阿胶纳豆的制备方法， 包括如下步骤 ： 0065 （1） 取经除石、 除杂、 精选后的黑豆和黄豆按质量比 1:0.5 的比例混匀， 清洗后加 水浸泡， 春冬季节最少浸泡 14 小时， 夏秋季节最少浸泡 10 小时， 以保证黄豆和黑豆吸水饱 满， 浸泡期间换 3 次水， 将浸泡好的黑豆和黄豆沥干， 置于高压蒸煮锅中在 75kPa 的条件下 蒸煮 25 分钟。收集蒸煮后的原料和煮出液。
32、， 蒸煮好的黑豆和黄豆在粉碎机中进行粉碎， 粉 碎过 5 目筛为适， 备用。 0066 （2） 取阿胶块粉碎后， 按照阿胶粉与去离子水质量体积比 ： 1:12（W/V） 的比例放 入 90的去离子水中， 搅拌溶解制成阿胶浆 ； 将制得的阿胶浆与步骤 （1） 制得的煮出液按 体积比 ： 1:2（V/V） 的比例混合， 制得阿胶液， 阿胶浆、 阿胶液加热到 65， 保持 30 分钟进行 巴氏杀菌后备用 ； 0067 （3） 菌种发酵液的制备 ： 用接种环取保藏纳豆菌菌种一环以划线法接种于固体培 养基上固体培养基组分如下 ： 牛肉浸膏 3.0g， 蛋白胨 5.0g， 葡萄糖 10g， 酵母浸膏 1.。
33、0g， 琼 脂 15g， 水 1000ml， pH7.0， 接种量按常规进行接种， 接种后置于培养箱中在 30条件下培养 1.5-3天以活化菌种。 使用时用生理盐水或水将纳豆菌从培养斜面洗脱下来， 制得纳豆菌悬 液， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的含量在为 108个 /ml。 0068 按质量百分比取， 葡萄糖 1%， 大豆胨 0.5%， MgSO40.04%， ZnSO40.01%， KH2PO40.1%， 阿 胶液 8%， 去离子水 90.35% 混合， pH 值自然， 形成液态培养基， 将液态培养基分装到 500ml 三 角瓶中， 装量为 100ml， 在 121条件下灭菌 20 分钟。灭好的液。
34、态培养基冷却到 40以下 后， 将液态培养基接种从培养斜面洗脱下来的纳豆菌悬液 10ml， 纳豆菌菌悬液中纳豆菌的 含量为 108个 /ml， 接种后在 32， 200rpm 的条件下扩大培养 18 小时后， 制得菌种发酵液， 说 明 书 CN 103798649 A 8 6/9 页 9 0069 （4） 接种 ： 取步骤 （2） 制得的阿胶液添加到步骤 （1） 蒸煮后的原料中， 再接种步骤 （3） 制得的菌种发酵液充分混合均匀 ； 阿胶液添加量为蒸煮后原料质量的 5%（V/M） ， 菌种发 酵液的接种量为蒸煮后原料质量的 0.5%（V/M） ； 0070 （5） 一次发酵 ： 将步骤 （4）。
35、 接种后的物料平铺在发酵盘上， 平铺厚度为 2cm， 于 36 保温发酵 20 小时， 直至产生丝状粘液为止， 发酵期间控制发酵盘湿度在 90wt%。 0071 （6） 二次发酵 ： 一次发酵结束后加入步骤 （2） 制得的阿胶浆， 混合均匀后在 30温 度下二次发酵 30 小时， 阿胶浆的添加量为混合物料质量的 10% ； 0072 （7） 三次发酵 ： 经步骤 （6） 二次发酵后的物料置于 4冷藏发酵 10 小时， 即制得本 发明的阿胶纳豆。 0073 （8） 将三次发酵后所得的产物置冷冻干燥真空瓶中 -35冷冻过夜后置于预热后 的冷冻干燥机上， 低温真空冷冻 32 小时后得到的干燥纳豆即为。
36、冻干的阿胶纳豆。 0074 实验例 0075 实验例 1 0076 阿胶纳豆的感官评价 0077 感官评定采用四个指标 ： 硬度与拉丝性、 气味、 口感、 色泽， 其中以气味作为最重要 的评定标准。纳豆评分标准 ： 满分 100 分， 0 分最差， 然后取平均值， 评定标准见表 1。 0078 表 1 感官评定标准 0079 0080 0081 将实施例 1、 2、 3 制得的阿胶纳豆与市售纳豆进行硬度与拉丝性、 气味、 口感的感 官评价， 评价结果如表 2 所示。结果表明本发明所得的阿胶纳豆与普通市售纳豆相比， 本发 明的阿胶纳豆香气浓郁， 氨味较淡， 不仅有效的减少了氨味的产生， 还改善了。
37、纳豆的硬度、 拉丝性以及口感。 0082 表 2 阿胶纳豆与市售纳豆感官评价结果 0083 说 明 书 CN 103798649 A 9 7/9 页 10 样品硬度、 拉丝性气味口感综合评分 本发明的阿胶纳豆17521887 市售纳豆11431670 0084 表 2 中本发明的阿胶纳豆为实施例 1、 2、 3 制得的成品纳豆 10 人次评价的平均值。 0085 市售纳豆为市售美屋纳豆、 燕京纳豆、 西尾纳豆 10 人次评价平均值。 0086 实验例 2 0087 阿胶纳豆的功效成分含量检测 0088 （1） 纳豆激酶活力检测 0089 纳豆激酶的检测参照如下方法 ： 0090 平板法 ： 取。
38、待测样品 l g 加入到 5ml 生理盐水 （0.9） 中， 4浸提 4h， 4000r/min 低温离心 15min， 取上清液测酶活。酶活检测采用平板法， 先将牛纤维蛋白原和牛凝血酶溶 液混合后制成人工血栓板， 然后在其上放置牛津杯在牛津杯中分别加入等量的样品提取上 清液及尿激酶标准品溶液。将操作完成后的平板置于 37下孵育 12 小时后检测形成透明 圈的大小。在等量加入量的情况下纳豆激酶活力越高， 溶栓圈越大。参照标准品尿激酶换 算纳豆激酶的活力。 0091 凝块酶解法 ： 取正常山羊静脉血 5ml， 置于试管中自然凝固， 将血凝块取出制成小 块后用滤纸吸干表面水分后称重， 放入干净的试。
39、管中分别加入样品提取上清液及尿激酶标 准品溶液， 37 50r/min 摇床孵育， 12 小时后再次称量凝血块的重量， 计算出溶解率。在等 量加入量的情况下纳豆激酶活力越高， 溶栓圈越大。参照标准品尿激酶换算纳豆激酶的活 力。 0092 实验结果如表 3 所示 ： 0093 表 3 本发明阿胶纳豆与市售纳豆对人工血栓板及山羊血凝血块的溶解作用 0094 0095 结果表明 ： 利用平板法检测， 市售纳豆的纳豆激酶效价 （以尿激酶计） 平均值为 186IU/g。而本发明的三种阿胶纳豆的纳豆激酶效价 （以尿激酶计） 分别为 286、 232、 346IU/ g ； 利用凝块法检测市售纳豆的纳豆激酶。
40、效价 （以尿激酶计） 平均值为 336。而本发明的三种 阿胶纳豆的纳豆激酶效价 （以尿激酶计） 分别为 498、 426、 602IU/g。因此阿胶纳豆的纳豆激 说 明 书 CN 103798649 A 10 8/9 页 11 酶活力高于市售普通纳豆。 0096 （2） 蛋白酶活力检测 0097 蛋白酶活力的方法按照 SB/T10317-1999 进行， 获得的酪氨酸标准曲线回归方程 为 y=0.121x-0.0032， R2=0.998， 用于蛋白酶活力的测定计算， 检测结果见表 4。结果表明实 施例 1、 2、 3 样品中蛋白酶活力分别为 136、 182、 156U/mL 均高于市售纳豆。
41、的蛋白酶活力。 0098 （3） 游离氨基酸总量检测 ： 检测方法参照 GB/T5009.124-2003 进行， 不同之处是样 品的处理方法采用， 取样品 250mg, 置于 25mL 量瓶中 , 加水约 20mL, 超声处理 ( 功率 300W, 频率 50kHz)30min, 放冷 , 加水定容至刻度摇匀 , 用 0.45um 微孔滤膜过滤后进行检测， 检 测结果见表4。 结果表明实施例1、 2、 3样品中游离氨基酸总量分别为66、 82、 78mg/g均高于 市售纳豆的游离氨基酸总量。 0099 表 4 阿胶纳豆与市售纳豆中蛋白酶活力和游离氨基酸总量比较 0100 样品蛋白酶活力 （U。
42、/mL）游离氨基酸总量 （mg/g） 燕京纳豆12010583 美屋纳豆897405 西尾纳豆11512433 实施例 1 样品 13612665 实施例 2 样品 1828824 实施例 3 样品 15615786 0101 （4） 蛋白质及多肽相对分子质量分布规律检测 ： 0102 测 定 方 法 参 照 汪 冰 等 的 方 法 药 物 分 析 杂 志， 第 29 卷 第 11 期， 2009 年， 第 1886-1891 页 ，采 用 水 溶 性 成 分 凝 胶 排 阻 色 谱 分 析 方 法 （gel exclusion chromatography） ， 不经水解直接分析样品中可溶性。
43、蛋白质及多肽的相对分子质量分布 规律。Agilent1100 高效液相色谱仪， 色谱柱 ： TSK 公司凝胶渗透色谱柱， 型号 TSK-GEL G3000PWxl。色谱条件 ： 流速 0.5mL/min， 柱温 30， 进样体积 50L, 流动相为 0.3mol/L 硫 酸钠缓冲液 (pH=4.0)， 流速为 0.5mL/min， 进样量为 50l， 检测波长为 280nm。样品处理 ： 取样品 250mg, 置于 25mL 量瓶中 , 加水约 20mL, 超声处理 ( 功率 300W, 频率 50kHz)30min, 放冷 , 加水定容至刻度摇匀 , 用 0.45m 微孔滤膜过滤后分别对胰岛。
44、素标准样品、 市售阿 胶、 实施例 1 样品、 实施例 2 样品、 实施例 3 样品以及市售纳豆分别别进行检测， 检测结果如 图 1- 图 6 所示。 0103 采用水溶性成分凝胶排阻色谱分析方法对样品进行分析时， 样品中物质的相对分 子量越小出峰时间越晚， 峰面积越大对应的物质含量越高。胰岛素标准品的相对分子量约 为 5700， 为更好的对各样品进行相对分子量的确认， 在每个样品中均加入胰岛素作为内标。 从图中可以看出， 市售阿胶中含有的蛋白质、 多肽相对分子量比其他样品都大 （最短出峰时 间为7.621） 。 实施例1、 2、 3样品中蛋白质、 多肽的出峰时间均向后推迟， 由此可说明加入到。
45、 说 明 书 CN 103798649 A 11 9/9 页 12 纳豆中的阿胶所含有的蛋白质被纳豆中的蛋白酶降解成小分子量的多肽。 从峰面积比较上 可以看出实施例 1、 2、 3 样品中多肽的含量比市售纳豆的多肽含量要高。 0104 综合以上实验例表明， 本发明的阿胶纳豆与普通纳豆相比， 阿胶纳豆香气浓郁， 氨 味较淡， 不仅有效的减少了氨味的产生， 还改善了纳豆的硬度、 拉丝性以及口感。而且纳豆 中含有的纳豆激酶活力、 蛋白酶活力和游离氨基酸均高于市售普通纳豆。阿胶纳豆中含有 的蛋白酶能够酶解阿胶使其转变成为人体更易吸收的小分子量多肽。 说 明 书 CN 103798649 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103798649 A 13 2/2 页 14 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103798649 A 14 。