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1、(10)申请公布号 CN 104273404 A (43)申请公布日 2015.01.14 CN 104273404 A (21)申请号 201410530357.0 (22)申请日 2014.10.10 CGMCC No9606 2014.08.27 CGMCC No9607 2014.08.27 A23L 1/015(2006.01) A23K 1/14(2006.01) (71)申请人 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 230031 安徽省合肥市庐阳区农科南路 40 号省农科院创新大楼四楼 (72)发明人 吴东 徐鑫 陈丽园 (74)专利代理机构 合肥金安专利事务所 34114 代理。
2、人 金惠贞 (54) 发明名称 一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱 毒的方法。具体操作步骤是将粉碎的菜籽饼粕与 麸皮按 10 ： 1 的重量份进行混匀， 然后按每公斤 菜籽饼粕与麸皮混合物加入总菌数量为 10 20 亿的降解硫苷的微生物菌液 190 200mL， 再加 水， 调节水份的含量为 50 55%， 堆放成料堆， 温 度 28 32固态好氧发酵 3 4 天， 得到脱毒菜 籽饼粕 ； 所述微生物菌液由植物乳杆菌菌液和蜡 样芽孢杆菌菌液混合均匀组成。通过发酵有效地 改善了菜籽饼粕的苦涩味， 发酵菜籽饼粕中硫苷、 异硫氰酸酯 (ITC。
3、) 和噁唑烷硫酮 （OZT） 比空白对 照组分别降低了 67.26%、 60.37% 和 53.24% ； 发酵 菜籽粕中硫苷、 异硫氰酸酯 (ITC) 和噁唑烷硫酮 （OZT）比空白对照组分别降低了 63.05%、 60.45% 和 52.78%。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104273404 A CN 104273404 A 1/1 页 2 1. 一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法， 其特征在于 ： 将粉碎的菜籽饼粕与麸。
4、皮 按 10 ： 1 的重量份比进行混匀， 然后按每公斤菜籽饼粕与麸皮混合物接入总菌数量为 10 20亿的降解硫苷的微生物菌液190200mL， 再加水调节水份的含量为5055%， 堆放成料 堆， 温度 28 32固态好氧发酵 3 4 天， 得到脱毒菜籽饼粕 ； 所述脱毒菜籽饼 （脱毒菜籽粕） 中硫苷的含量为 12.46（33.96） mol/g、 异硫氰酸酯 (ITC) 的含量为 1.05（1.57） mg/g、 噁唑烷硫酮 （OZT） 的含量为 0.65(1.02) mg/g ； 所述微生物菌液由植物乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌菌液按0.91.0 ： 1.01.1的数 量比混合均匀组成 ； 所。
5、述植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC No.9606， 保藏日期 2014 年 08 月 27 日 ； 所述蜡样 芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌 种保藏号为 CGMCC No.9607， 保藏日期 2014 年 08 月 27。 2. 根据权利要求 1 所述的一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法， 其特征在于 ： 将 所述植物乳杆菌接种于植物乳杆菌培养基中， 温度 35 37厌氧静置培养 36 48h， 调 节细菌浓度。
6、为 10 20 亿 / mL， 制得植物乳杆菌发酵种子液 ； 所述植物乳杆菌培养基配方 为 ： 玉米粉 10 13g， 芝麻粕 13 15g， 无水乙酸钠 3 4g， 蒸馏水 1000mL ； 植物乳杆菌培 养基的 pH 值为 6.3 6.5。 3. 根据权利要求 1 所述的一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法， 其特征在于 ： 将 所述蜡样芽孢杆菌接种于蜡样芽孢杆菌培养基中， 温度 35 37， 摇床培养 24 36 h， 摇床转速 160r/min ； 调节细菌浓度为 10 20 亿 /mL， 制得蜡样芽孢杆菌发酵种子液 ； 所述 蜡样芽孢杆菌培养基配方为 ： 玉米粉 10 13g， 芝麻。
7、粕 15 17g， 氯化钠 4 5g， 1000 mL 水， 蜡样芽孢杆菌培养基的 pH 值为 7.0 7.2。 4. 根据权利要求 1 所述的一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法， 其特征在于 ： 料 堆固态好氧发酵 12h 时翻堆通气一次， 24h 再翻堆通气一次。 权 利 要 求 书 CN 104273404 A 2 1/4 页 3 一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法 技术领域 0001 本发明属于饲用蛋白质资源开发技术领域， 具体涉及一种菜籽饼粕的脱毒方法。 背景技术 0002 随着我国饲料工业的迅速发展， 蛋白质饲料资源严重紧缺的矛盾日益突出， 已成 为我国饲料工业发展的主要制约因。
8、素， 并将长期成为我国畜牧业发展的瓶颈， 开发利用蛋 白质资源已成为我国发展饲料工业的重要课题， 菜籽饼粕中含有35%45%植物蛋白， 是重 要的植物蛋白资源， 而且其蛋白质中氨基酸组成比较平衡， 其饲用价值可以与大豆饼相媲 美。 0003 但菜籽饼粕中含有硫代葡萄糖苷， 即芥子苷 (3% 10%) 经芥子酶催化水解， 生成 有毒物质一异硫氰酸醋 （ITC） 、 硫氰酸酯 （SCN） 、 噁唑烷硫酮 （OZT） 和睛类， 动物采食后会使 动物中毒， 导致肝脏肿大、 出血及肝上淋巴增加， 降低细胞堆积体积， 同时导致甲状腺肿大， 还可引起高血糖， 降低血液中的甘油三酷含量， 限制了其作为动物蛋白。
9、质饲料资源的应用。 我国大量菜籽饼粕未能物尽其用， 被迫投入农田作肥料， 造成蛋白饲料资源的严重浪费。 0004 为了充分利用菜籽饼粕这一宝贵的蛋白质资源， 长期以来， 国内外众多研究者做 了许多不懈努力。目前菜籽饼粕脱毒方法主要有物理法、 化学法、 添加剂脱毒法等， 并在实 践中取得了一定的成效， 但目前的化学法脱毒率不高， 添加剂脱毒法效果不确切而且成本 比较高， 不适于大规模生产 ； 物理法会丧失某些营养成分， 设备投资大， 工艺复杂， 操作条件 苛刻， 不适用于大规模工业应用。 发明内容 0005 为了解决现有技术中菜籽饼粕脱毒方法存在的不足之处， 充分利用菜籽饼粕这一 宝贵的蛋白质资。
10、源， 本发明提供一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法。 0006 本发明利用微生物的作用， 通过微生物酶系 （芥子酶） 的作用， 使菜籽饼粕中的硫 代葡萄糖苷降解， 从而达到去除抗营养因子的效果。 0007 具体的技术解决方案如下 ： 一种微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的方法， 将粉碎的菜籽饼粕与麸皮按 10 ： 1 的重量 份比进行混匀， 然后按每公斤菜籽饼粕与麸皮混合物接入总菌数量为 10 20 亿的降解硫 苷的微生物菌液 190 200mL， 再加水调节水份的含量为 50 55%， 堆放成料堆， 温度 28 32固态好氧发酵 3 4 天， 得到脱毒菜籽饼粕 ； 所述脱毒菜籽饼 （脱毒菜籽粕）。
11、 中硫苷的含量为 12.46（33.96） mol/g、 异硫氰酸酯 (ITC) 的含量为 1.05（1.57） mg/g、 噁唑烷硫酮 （OZT） 的含量为 0.65(1.02) mg/g ； 所述微生物菌液由植物乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌菌液按0.91.0 ： 1.01.1的数 量比混合均匀组成。 0008 所述植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC No.9606， 保藏日期 2014 年 08 月 27 日 ； 所述 说 明 书 CN 104273404 A 3 2/4 页 4 蜡样芽。
12、孢杆菌 (Bacillus cereus) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 菌种保藏号为 CGMCC No.9607， 保藏日期 2014 年 08 月 27。 0009 将所述植物乳杆菌接种于植物乳杆菌培养基中， 温度 35 37厌氧静置培养 36 48h， 调节细菌浓度为 10 20 亿 /mL， 制得植物乳杆菌发酵种子液 ； 所述植物乳杆菌 培养基配方为 ： 玉米粉 10 13g， 芝麻粕 13 15g， 无水乙酸钠 3 4g， 蒸馏水 1000mL ； 植 物乳杆菌培养基的 pH 值为 6.3 6.5。 0010 将所述蜡样芽孢杆菌接种于蜡样芽孢杆菌培养基中， 温。
13、度 35 37， 摇床培养 24 36 h， 摇床转速 160r/min ； 调节细菌浓度为 10 20 亿 /mL， 制得蜡样芽孢杆菌发酵 种子液 ； 所述蜡样芽孢杆菌培养基配方为 ： 玉米粉 10 13g， 芝麻粕 15 17g， 氯化钠 4 5g， 1000mL 水， 蜡样芽孢杆菌培养基的 pH 值为 7.0 7.2。 0011 本发明的有益技术效果体现在以下方面 ： 1、 在发酵过程中可有效地改善菜籽饼 （粕） 的苦涩味， 发酵菜籽饼中硫苷、 异硫氰酸酯 (ITC) 和噁唑烷硫酮 （OZT） 比空白对照组分别降低了 67.26%、 60.37% 和 53.24% ； 发酵菜籽 粕中硫苷。
14、、 异硫氰酸酯 (ITC) 和噁唑烷硫酮 （OZT） 比空白对照组分别降低了 63.05%、 60.45% 和 52.78% ； 2、 菜籽饼中蛋白质含量提高了 2.74 个百分点， 活性小肽提高了 2.4 个百分点 ； 菜籽粕 中蛋白质含量提高了 2.51 个百分点， 活性小肽提高了 2.2 个百分点 ； 3、 本发明生产的产物改善日粮的适口性， 提高动物采食量， 能促进动物生长发育， 提高 了动物的生长性能 ； 4、 本发明生产的产物在发酵过程中产生的大量活性益生菌可调节胃肠道菌群平衡， 降 低了腹泻率 ； 5、 本发明生产的产物营养较豆粕更能被动物吸收利用， 大大地提高了蛋白质的利用 率。
15、， 促进动物机体氮代谢与平衡， 而且可以保护肝脏合成蛋白的能力及肝脏的功能 ； 6、 本发明工艺简单， 产物的附加值高， 生产成本低， 利用率高， 而且易于推广应用。 具体实施方式 0012 下面结合实施例， 对本发明作进一步地描述。 0013 以下实施例所用原料来源说明 ： 普通菜籽饼 （市售） ， 蛋白质 35.75%， 小肽 1.68%， 水分 6.08%， 硫苷 38.06mol/L， 异硫氰酸酯 （ITC） 2.65mg/g， 噁唑烷硫酮 （OTC） 1.39 mg/g ； 普通菜籽粕 （市售） ， 蛋白质 35.14%， 小肽 2.36%， 水分 7.18%， 硫苷 91.92mo。
16、l/L， 异硫氰酸 酯 （ITC） 3.97mg/g， 噁唑烷硫酮 （OTC） 2.16 mg/g ； 麸皮 （市售） 含水量 8.46%， 粗蛋白 14.88% ； 玉米粉 （市售） 含水量 13.3%， 粗蛋白 8.18% ； 芝麻粕 （市售） 含水量 13.5%， 粗蛋白 43.6%。 0014 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC No.9606， 保藏日期 2014 年 08 月 27 日 ； 所述蜡样 芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委。
17、员会普通微生物中心， 菌 种保藏号为 CGMCC No.9607， 保藏日期 2014 年 08 月 27 日。 0015 实施例 1 微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的具体操作步骤如下 ： （1） 菌株分离、 筛选和鉴定 说 明 书 CN 104273404 A 4 3/4 页 5 初筛 ： 取菜籽榨油厂周围的土壤数份， 分为表层和深层土壤。分别取 10g 土样接种到 90mL 无菌水中， 160r/min 37 振荡 30min。取溶液依次稀释至 10-4、 10-5、 10-6， 分别涂布到 牛肉膏蛋白胨和 MRS 固体培养基平板上， 牛肉膏蛋白胨平板放置于 37培养箱中 24h， MRS 平。
18、板放置于厌氧条件下， 放置于 37培养箱中 48h。根据菌落形态、 大小、 颜色、 透明度等进 行初步筛选， 然后再分离纯化至 3-4 代， 于 4保存 ； 复筛 ： 将初筛得到的几株菌株挑取单菌落接到液体培养基中活化， 按 1%（2%） 接种到各 自培养基中制成发酵种子液 （当菌密度达到 10cfu/mL 时， 即可接种发酵） 。好氧菌按 10% 接 种量接种到 500g 菜籽饼 （粕） 中， 厌氧菌按 6% 接种量接种到 500g 菜籽饼中， 料水比均为 1 ： 1， 混匀后放置于 30培养箱中好氧发酵 3 天， 每隔 12h 翻料 1 次。厌氧菌按 6% 接种量接种 到 500g 菜籽饼。
19、中， 料水比均为 1 ： 1， 混匀后放置于 30培养箱中厌氧发酵 3 天。发酵结束 后取样至于 65烘箱中烘干待测， 检测其中硫苷含量。选出硫苷降解率最高的好氧和厌氧 菌各 1 株 ； 菌种鉴定 ： 细菌 16SrRNA 菌种鉴定。菌株 Y4 为蜡样芽孢杆菌， 菌株 R1 为植物乳杆菌 ； （2） 制备微生物菌液 植物乳杆菌培养基的配方 ： 玉米粉10g， 芝麻粕13g， 无水乙酸钠3g， 水1000mL， pH 6.5。 培养条件为培养温度 37， 静置培养 48h， 制得植物乳杆菌发酵种子液 ； 蜡样芽孢杆菌培养基配方 ： 玉米粉 10g， 芝麻粕 15g， 氯化钠 5g， 水 1000。
20、mL， pH7.0。培养 温度 37， 培养时间 24h， 摇床培养， 摇床转速为 160r/min， 制得蜡样芽孢杆菌发酵种子液 ； 将植物乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌菌液按 0.9 ： 1.0 的数量比混合均匀组成微生物菌 液备用 ； （3） 固体发酵菜籽饼粕 将粉碎的菜籽饼粕 1000g、 麸皮 100g 混合均匀， 加入微生物菌液 190mL（按每公斤菜 籽饼粕与麸皮混合物加入总菌数量为 20 亿的微生物菌液， 再加入 860mL 水， 混合成含水量 为 50% 的混合物料， 将混合物料堆放成料堆， 温度 30固态好氧发酵 3 天， 得到脱毒菜籽饼 粕 ； 所述脱毒菜籽饼 （脱毒菜籽粕） 。
21、中硫苷的含量为 12.46（33.96） mol/g、 异硫氰酸酯 (ITC) 的含量为 1.05（1.57） mg/g、 噁唑烷硫酮 （OZT） 的含量为 0.65(1.02) mg/g。 0016 实施例 2 微生物固态发酵菜籽饼粕脱毒的具体操作步骤如下 ： （1） 制备微生物菌液 植物乳杆菌培养基的配方 2 ： 玉米粉 12g， 芝麻粕 14g， 无水乙酸钠 4g， 水 1000mL， pH 6.3。培养条件为培养温度 36， 静置培养 36h， 制得植物乳杆菌发酵种子液 ； 蜡样芽孢杆菌培养基配方 2 ： 玉米粉 12g， 芝麻粕 16g， 氯化钠 4g， 水 1000mL， pH7.。
22、2 ； 培 养温度 36， 培养时间 24h， 摇床培养， 摇床转速为 160r/min， 制得蜡样芽孢杆菌发酵种子 液 ； 将植物乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌菌液按 1.0 ： 1.0 的数量比混合均匀组成微生物菌 液备用 ； （2） 固体发酵菜籽饼粕 将粉碎的菜籽饼粕 1000g、 麸皮 100g 混合均匀， 加入微生物菌液 195mL（按每公斤菜籽 说 明 书 CN 104273404 A 5 4/4 页 6 饼粕与麸皮混合物加入总菌数量为 15 亿的微生物菌液） ， 再加入 850mL 水， 混合成含水量 为 50% 的混合物料， 将混合物料堆放成料堆， 温度 28固态好氧发酵 3 天， 。
23、得到脱毒菜籽饼 粕 ； 所述脱毒菜籽饼 （脱毒菜籽粕） 中硫苷的含量为 13.18（35.57） mol/g、 异硫氰酸酯 (ITC) 的含量为 1.13（1.79） mg/g、 噁唑烷硫酮 （OZT） 的含量为 0.76(1.16) mg/g。 0017 实施例 3 （1） 制备微生物菌液 植物乳杆菌培养基的配方 ： 玉米粉13g， 芝麻粕15g， 无水乙酸钠5g， 水1000mL， pH 6.5。 培养条件为培养温度 35， 静置培养 48h， 制得植物乳杆菌发酵种子液 ； 蜡样芽孢杆菌培养基配方 ： 玉米粉 13g， 芝麻粕 17g， 氯化钠 4g， 水 1000ml， pH7.0。培养。
24、 温度 35， 培养时间 24h， 摇床培养， 摇床转速为 160r/min， 制得蜡样芽孢杆菌发酵种子液 ； 将植物乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌菌液按 1.0 ： 1.1 的数量比混合均匀组成微生物菌 液备用 ； （2） 固体发酵菜籽饼粕 将粉碎的菜籽饼粕 1000g、 麸皮 100g 混合均匀， 加入微生物菌液 200mL（按每公斤菜籽 饼粕与麸皮混合物加入总菌数量为 10 亿的微生物菌液） ， 再加入 900mL 水， 混合成含水量 为 55% 的混合物料， 将混合物料堆放成料堆， 温度 32固态好氧发酵 4 天， 得到脱毒菜籽饼 粕 ； 所述脱毒菜籽饼 （脱毒菜籽粕） 中硫苷的含量为 12.85（34.79） mol/g、 异硫氰酸酯 (ITC) 的含量为 1.10（1.71） mg/g、 噁唑烷硫酮 （OZT） 的含量为 0.71(1.09) mg/g。 说 明 书 CN 104273404 A 6 。