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1、(10)授权公告号 CN 102577968 B (45)授权公告日 2013.10.16 CN 102577968 B *CN102577968B* (21)申请号 201210056764.3 (22)申请日 2012.03.06 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 吴正景 吴祖峰 李东升 高文 刘亚楠 杜小红 胡灿丽 金祥利 任志敏 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 CN 102172220 A,2011.09.07, 全文 . CN 。
2、102144563 A,2011.08.10, 全文 . 何宽远 . 菊花花瓣与花托再生体系的建 立 .农技服务 .2010, 第 27 卷 ( 第 5 期 ), 第 640 页 . 高昌勇 . 不同牡丹外植体诱导愈伤组织的研 究 . 安徽农业科学 .2007, 第 35 卷 ( 第 34 期 ), 第 11036 页 . (54) 发明名称 一种牡丹不定芽诱导方法 (57) 摘要 本发明涉及一种牡丹不定芽诱导方法， 以 NAA 和 6-BA 为诱导剂， 以花托为外植体进行诱 导培育。本发明采用萘乙酸 (NAA) 和 6- 苄基嘌 呤 (6-BA) 为诱导， 以花托为外植体， 花托营养含 量丰。
3、富， 酶类活性高， 不定芽再生率较高， 可达到 100-490.91， 且玻璃化现象不严重， 能够模化生 产或基因转化。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姜岚 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 (10)授权公告号 CN 102577968 B CN 102577968 B *CN102577968B* 1/1 页 2 1. 一种牡丹不定芽诱导方法， 其特征在于 ： 以萘乙酸和 6- 苄基嘌呤为诱导剂， 以花 托为外植体进行诱导培育 ； 包括以下步骤 ： 以牡丹幼嫩花蕾， 除去萼片后， 用 7。
4、0% 酒精浸泡 15-25sec， 清洗一次， 经浸泡液浸泡 8-20min 后， 无菌水洗 3-5 次， 每次 2-4min ； 以花托作为 外植体接种， 接种到 MS 培养基添加 1.5-2.5mgL-16- 苄基嘌呤 +0.1-0.3mgL-1萘乙酸， 蔗 糖 25-35gL-1， 琼脂 7-8gL-1， pH 调至 5.8， 每天光照 14h， 光照强度 3000lux， 温度 25， 每 30 天转接入新鲜培养基 ； 所述的新鲜培养基为 MS 培养基中添加了 1.5-2.5mgL-16- 苄 基嘌呤 +0.1-0.3mgL-1萘乙酸， 蔗糖 25-35gL-1， 琼脂 7-8gL-1。
5、； 所述的浸泡液为 0.1% 的 HgCl2或 2% 的次氯酸钠。 2. 根据权利要求 1 所述的牡丹不定芽诱导方法， 其特征在于 ： 所述的清洗为采用无菌 水进行清洗。 权 利 要 求 书 CN 102577968 B 2 1/2 页 3 一种牡丹不定芽诱导方法 背景技术 0001 本发明涉及一种牡丹的培育方法， 尤其涉及一种牡丹不定芽诱导方法。 技术领域 0002 牡丹为我国国花， 花大色艳， 雍容华贵， 也为世人普遍喜爱， 但牡丹主要靠分株或 嫁接繁殖， 繁殖系数低， 繁殖速度慢， 不能满足实际需要。目前， 对于牡丹快繁的研究， 多数 是采用茎尖或休眠芽为外植体， 该方法没有通过细胞脱分。
6、化和再分化， 属于微扦插， 繁殖系 数低， 获得的幼苗主要因生根困难和移栽成活率低， 难以在生产中推广应用。 0003 已有文献采用不定芽再生的途径， 但外植体一般选用成熟胚、 种子或幼苗。 李玉花 (2005) 建立了牡丹 凤丹白 子叶再生体系 ； 肖晓蓬 (2008) 以多花野牡丹种子为外植体成 功建立了快繁体系 ； 刘磊 (2009) 建立了牡丹 凤丹白 成熟胚经愈伤组织途径分化不定芽 的完整再生体系， 上述方式均来源于种子的再生体系， 存在变异， 不能保持牡丹原有品种的 特性。 0004 Beruto， et al(2004) 采用牡丹花瓣和花丝为外植体， 仅花瓣或花瓣产生的愈伤组 织。
7、在 TDZ 诱导下获得了不定芽的再生， 此种方式玻璃化现象较严重， 难以形成完成的不定 芽。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种再生率高的牡丹不定芽诱导方法。 0006 为了实现上述目的， 本发明的技术方案采用了一种牡丹不定芽诱导方法， 以 NAA 和 6-BA 为诱导剂， 以花托为外植体进行诱导培育。 0007 本发明的牡丹不定芽诱导方法具体包括以下步骤 ： 以牡丹幼嫩花蕾， 除去萼片 后， 用 70酒精浸泡 15-25sec， 清洗一次， 经浸泡液浸泡 8-20min 后， 无菌水洗 3-5 次， 每次 2-4min ； 以花托作为外植体接种， 接种到 MS 培养基添加 1.5-。
8、2.5mgL-16- 苄基嘌呤 6-BA+0.1-0.3mgL-1萘乙酸 NAA， 蔗糖 25-35gL-1， 琼脂 7-8gL-1， pH 调至 5.8， 每天光照 14h， 光照强度 3000lux， 温度 25， 每 30 天转接入新鲜培养基。 0008 所 述 的 新 鲜 培 养 基 为 MS 培 养 基 中 添 加 了 1.5-2.5mgL-16- 苄 基 嘌 呤 6-BA+0.1-0.3mgL-1萘乙酸 NAA， 蔗糖 25-35gL-1， 琼脂 7-8gL-1。 0009 所述的清洗为采用无菌水进行清洗。 0010 所述的浸泡液为 0.1的 HgCl2或 2的次氯酸钠。 0011。
9、 本发明采用萘乙酸 (NAA) 和 6- 苄基嘌呤 (6-BA) 为诱导， 以花托为外植体， 花托营 养含量丰富， 酶类活性高， 不定芽再生率较高， 可达到 100-490.91， 且玻璃化现象不严重， 能够模化生产或基因转化。 具体实施方式 0012 实施例 1 说 明 书 CN 102577968 B 3 2/2 页 4 0013 本实施例的方法具体步骤为 ： 选择牡丹幼嫩花蕾， 除去萼片后， 70酒精浸 泡 20sec， 然后无菌水洗一次， 经 0.1的 HgCl2浸泡 10min 后， 无菌水洗 4 次， 每次 3min。置吸水纸上把饼状的花托分为 4 份， 作为外植体接种 ； 接种到。
10、 MS 培养基添加 2.0mgL-16-BA+0.2mgL-1NAA， 蔗糖 30gL-1， 琼脂 7.5gL-1， pH 调至 5.8 ； 每天光照 14h， 光照强度 3000lux， 温度 25 ； 每 30 天转接入新鲜培养基， 经过 7 周的诱导培养， 部分 牡丹品种的不定芽诱导生成率达 100。 0014 实施例 2 0015 本实施例的方法具体步骤为 ： 以牡丹幼嫩花蕾， 除去萼片后， 用 70酒精浸泡 15sec， 清洗一次， 经 0.1的 HgCl2浸泡 15min 后， 无菌水洗 3 次， 每次 2min ； 以花托作为外 植体接种， 接种到 MS 培养基添加 1.5mgL。
11、-16- 苄基嘌呤 6-BA+0.1mgL-1萘乙酸 NAA， 蔗糖 25gL-1， 琼脂 7gL-1， pH 调至 5.8， 每天光照 14h， 光照强度 3000lux， 温度 25， 每 30 天 转接入新鲜培养基。经过 7 周的诱导培养， 部分牡丹品种的不定芽诱导生成率达 330。 0016 实施例 3 0017 本实施例的方法具体步骤为 ： 以牡丹幼嫩花蕾， 除去萼片后， 用 70酒精浸泡 25sec， 清洗一次， 经浸泡液浸泡 20min 后， 无菌水洗 5 次， 每次 4min ； 以花托作为外植体接 种， 接种到MS培养基添加2.5mg L-16-苄基嘌呤6-BA+0.3mg L-1萘乙酸NAA， 蔗糖35g L-1， 琼脂 8g L-1， pH 调至 5.8， 每天光照 14h， 光照强度 3000lux， 温度 25， 每 30 天转接入新鲜 培养基。经过 7 周的诱导培养， 部分牡丹品种的不定芽诱导生成率达 490.91。 说 明 书 CN 102577968 B 4 。