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1、(10)授权公告号 CN 103404508 B (45)授权公告日 2014.12.24 CN 103404508 B (21)申请号 201310244709.1 (22)申请日 2013.06.19 A01N 1/02(2006.01) A01K 61/00(2006.01) (73)专利权人 浙江省淡水水产研究所 地址 313001 浙江省湖州市杭长桥南路 999 号 (72)发明人 练青平 宓国强 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 CN 102578076 A,2012.07.18, WO 0128326 A1,2001.04.26, C。
2、N 1596670 A,2005.03.23, CN 101878741 A,2010.11.10, CN 102763640 A,2012.11.07, 郝忱 . 两种淡水经济鱼类精子超低温冷冻 保存技术的研究 .南京农业大学硕士学位论 文 .2013, (54) 发明名称 花精子超低温冷冻保存和复苏方法 (57) 摘要 本发明公开了一种花精子超低温冷冻保 存和复苏方法， 具体为选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的亲本， 对其进行激素诱 导， 促使精子成熟， 采精， 稀释， 添加抗冻剂， 液氮 冷冻保存后， 解冻， 进行人工授精。本发明具有操 作时间短、 成本低、 操作方便。
3、、 保存时间长、 损伤程 度小、 复苏后精子成活率较高等优点， 在花的 种质保存、 遗传育种、 可持续养殖及病害防治等方 面有着重要的理论意义和应用价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 史爱民 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 103404508 B CN 103404508 B 1/1 页 2 1. 一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1)亲本选择 ： 选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的花 雄鱼作为亲 本。
4、， (2) 取精 ： 对性成熟的雄鱼注射催产剂， 在水温 16-18环境中暂养 16-20h 后， 轻压鱼 腹， 取精液 ； (3) 冷冻 ： 将精液与稀释液按 1:2-3 的体积比混合均匀， 2-4下平衡 20-30min 后， 加入抗冻剂 DMSO 混匀得混合精液， 分装至离心管中， 置于液氮液面上方 4-7cm 处平衡 15-20min， 然后再置于液氮液面上平衡 5-8min， 再放入液氮中保存 ； (4) 复苏 ： 从液氮中取出装有精液的离心管， 置于液氮蒸汽中平衡 5-10min， 然后迅速 置于 371水浴中快速晃动至融化得解冻精液 ； (5) 人工授精 ： 将解冻精液与花鱼卵混。
5、合进行人工授精 ； 所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、 促黄体素释放激素 A2和马来酸地欧酮组成， 每 千克体重的鱼催产剂注射量为 ： 绒毛膜促性腺激素 500-750IU， 促黄体素释放激素 A2 4-6 微克， 马来酸地欧酮 2-3 毫克 ； 所述稀释液的配方为 ： 氯化纳 1.0-1.5wt、 氯化钾 0.05-0.1wt、 葡萄糖 1-2wt， 余量为水 ； 所述混合精液中抗冻剂 DMSO 占的体积百分比为 6-8； 人工授精是将解冻精液与花鱼卵搅拌混匀后， 加入泥浆水中， 继续搅拌 10-60 秒， 再用清水清洗鱼卵， 洗净后放入孵化器中孵化 ； 解冻精液与花鱼卵用量为每 300ml 鱼。
6、卵 加 10-15ml 解冻精液 ； 泥浆水的体积为花鱼卵体积的 3-5 倍。 权 利 要 求 书 CN 103404508 B 2 1/4 页 3 花精子超低温冷冻保存和复苏方法 技术领域 0001 本发明涉及一种鱼类精子的保存及复苏方法， 特别涉及一种花精子超低温冷冻 保存和复苏方法。 背景技术 0002 花（Hemibarbus maculates） 俗称麻鲤、 麻花鱼、 杨花鱼、 季郎鱼等。是湖泊、 河 流中常见的一种中小型经济鱼类。因其肉质细嫩， 味道鲜美， 营养价值高等特点， 深受广大 消费者的青睐， 2001 年突破花的人工繁殖技术以来， 已成为淡水养殖新品种之一。近年 来， 因。
7、环境污染不断加剧， 加上鱼类资源的过度捕捞， 太湖野生花资源不断减少， 野生种 质严重退化， 因此， 对其进行精子超低温冷冻保存技术的研究对于花优良品种的种质资 源保护及遗传多样性保护具有重要意义。 0003 CN100569071C 的发明公开了一种中华鲟精子超低温冷冻保存的方法， 包括精子采 集， 镜检， 精子稀释， 加抗冻剂分装及液氮保存等步骤， 但其不适合于花精子的保存。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法， 具有操作时间 短、 成本低、 操作方便、 保存时间长、 损伤程度小、 复苏后精子成活率较高等优点， 对于花 优良品种的种质资源保护及遗传多。
8、样性保护具有重要意义。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 0006 一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法， 包括以下步骤 ： 0007 （1） 亲本选择 ： 选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的花雄鱼作 为亲本， 0008 （2） 取精 ： 对性成熟的雄鱼注射催产剂， 在水温 16-18环境中暂养 16-20h 后， 轻 压鱼腹， 取精液 ； 0009 （3）冷冻 ： 将精液与稀释液按 1:2-3 的体积比混合均匀， 2-4下平衡 20-30min 后， 加入抗冻剂 DMSO 混匀得混合精液， 分装至离心管中， 置于液氮液面上方 4-7cm 处平衡 15-2。
9、0min， 然后再置于液氮液面上平衡 5-8min， 再放入液氮中保存 ； 0010 （4） 复苏 ： 从液氮中取出装有精液的离心管， 置于液氮蒸汽中平衡 5-10min， 然后 迅速置于 371水浴中快速晃动至融化得解冻精液 ； 0011 （5） 人工授精 ： 将解冻精液与花鱼卵混合进行人工授精。 0012 本发明针对花的生物特性， 配制特定的催产剂 （绒毛膜促性腺激素、 促黄体素 释放激素 A2和马来酸地欧酮组成） ， 促使雄鱼快速高效产精， 然后配制稀释液稀释后， 加入 抗冻剂， 开发了精子保存时间长、 损伤程度小、 复苏后精子成活率较高的冷冻保存及复苏方 法， 设计了有效的人工授精方法。
10、， 对于花优良品种的种质资源的保存具有重要意义。 说 明 书 CN 103404508 B 3 2/4 页 4 0013 作为优选， 所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、 促黄体素释放激素 A2和马来酸地欧 酮组成， 每千克体重的鱼催产剂注射量为 ： 绒毛膜促性腺激素500-750 IU， 促黄体素释放激 素 A2 4-6 微克， 马来酸地欧酮 2-3 毫克。控制各催产剂组分的用量促使雄鱼快速高效产精 效果好。 0014 作为优选， 所述稀释液的配方为 ： 氯化纳 1.0-1.5wt%、 氯化钾 0.05-0.1wt%、 葡萄 糖 1-2wt%， 余量为水。稀释液是针对花精液的渗透压进行特定配制的，。
11、 对精子的保存效 果好。 0015 作为优选， 所述混合精液中抗冻剂 DMSO 占的体积百分比为 6-8%。这样抗冻效果 好。 0016 作为优选， 人工授精是将解冻精液与花鱼卵搅拌混匀后， 加入泥浆水中， 继续搅 拌 10-60 秒， 再用清水清洗鱼卵， 洗净后放入孵化器中孵化。作为优选， 解冻精液与花鱼 卵用量为每 300ml 鱼卵加 10-15ml 解冻精液。作为优选， 泥浆水的体积为花鱼卵体积的 3-5 倍。这样受精成功率高。 0017 本发明的有益效果是 ： 具有操作时间短、 成本低、 操作方便、 保存时间长、 损伤程度 小、 复苏后精子成活率较高等优点， 在花的种质保存、 遗传育种。
12、、 可持续养殖及病害防治 等方面有着重要的理论意义和应用价值。 具体实施方式 0018 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 0019 本发明中， 若非特指， 所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为本领域的常规方法。 0020 绒毛膜促性腺激素 （HCG， 市售， 宁波市三生药业有限公司） ， 0021 促黄体素释放激素 A2（LHRH-A2， 市售， 宁波市三生药业有限公司） ， 0022 马来酸地欧酮 （DOM， 市售， 宁波市三生药业有限公司） 。 0023 花来源为太湖捕获的野生花。 0024 实施例 1。
13、 ： 0025 （1） 亲本选择 ： 选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的花雄鱼作 为亲本。 0026 （2） 取精 ： 在花的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂， 在水温 16环境中暂养 20h 后， 轻压鱼腹， 用干净医用注射器获取无血污、 无尿污的精液， 先用塑料细口吸管吸一滴 水于载玻片上， 对准视野， 然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀， 观察其活力， 鲜 精活力在 90% 以上的精液样品用于精子冷冻保存。 0027 催产剂由绒毛膜促性腺激素、 促黄体素释放激素 A2和马来酸地欧酮组成， 每千克 体重的鱼催产剂注射量为 ： 绒毛膜促性腺激素500 IU， 促黄体素。
14、释放激素A2 6微克， 马来酸 地欧酮 3 毫克。 0028 （3） 冷冻 ： 将23.5ml精液与70.5ml稀释液混合均匀， 2下平衡20min后， 加入6ml 抗冻剂 DMSO（市售） 混匀得混合精液， 分装至 1.5ml 离心管中， 置于液氮液面上方 4cm 处平 衡 15min， 然后再置于液氮液面上平衡 5min， 再放入液氮中保存。 说 明 书 CN 103404508 B 4 3/4 页 5 0029 稀释液的配方为 ： 氯化纳 1.0wt%、 氯化钾 0.1wt%、 葡萄糖 2wt%， 余量为水。 0030 （4） 复苏 ： 从液氮中取出装有精液的离心管， 置于液氮蒸汽中平衡。
15、 5min， 然后迅速 置于 371水浴中快速晃动至融化得解冻精液。 0031 （5） 人工授精 ： 将解冻精液与花鱼卵 （每 300ml 鱼卵加 10ml 解冻精液） 搅拌混匀 后， 加入泥浆水中， 泥浆水的体积约为花鱼卵体积的 3 倍， 继续搅拌 10 秒， 再用清水清洗 鱼卵， 洗净后放入孵化器中孵化。 0032 实施例 2 ： 0033 （1） 亲本选择 ： 选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的花雄鱼作 为亲本。 0034 （2） 取精 ： 在花的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂， 在水温 18环境中暂养 16h 后， 轻压鱼腹， 用干净医用注射器获取无血污、 无尿污的。
16、精液， 先用塑料细口吸管吸一滴 水于载玻片上， 对准视野， 然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀， 观察其活力， 鲜 精活力在 90% 以上的精液样品用于精子冷冻保存。 0035 催产剂由绒毛膜促性腺激素、 促黄体素释放激素 A2和马来酸地欧酮组成， 每千克 体重的鱼催产剂注射量为 ： 绒毛膜促性腺激素750 IU， 促黄体素释放激素A2 4微克， 马来酸 地欧酮 2 毫克。 0036 （3） 冷冻 ： 将 30ml 精液与 62ml 稀释液混合均匀， 4下平衡 30min 后， 加入 8ml 抗 冻剂 DMSO 混匀得混合精液， 分装至 1.5ml 离心管中， 置于液氮液面上方 7cm 。
17、处平衡 20min， 然后再置于液氮液面上平衡 8min， 再放入液氮中保存。 0037 稀释液的配方为 ： 氯化纳 1.5wt%、 氯化钾 0.05wt%、 葡萄糖 1wt%， 余量为水。 0038 （4） 复苏 ： 从液氮中取出装有精液的离心管， 置于液氮蒸汽中平衡 10min， 然后迅 速置于 371水浴中快速晃动至融化得解冻精液。 0039 （5） 人工授精 ： 将解冻精液与花鱼卵 （每 300ml 鱼卵加 15ml 解冻精液） 搅拌混匀 后， 加入泥浆水中， 泥浆水的体积约为花鱼卵体积的 5 倍， 继续搅拌 60 秒， 再用清水清洗 鱼卵， 洗净后放入孵化器中孵化。 0040 实施例。
18、 3 ： 0041 （1） 亲本选择 ： 选择形态正常、 生长良好、 健康无疾病、 达到性成熟的花雄鱼作 为亲本。 0042 （2） 取精 ： 在花的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂， 在水温 17环境中暂养 16h 后， 轻压鱼腹， 用干净医用注射器获取无血污、 无尿污的精液， 先用塑料细口吸管吸一滴 水于载玻片上， 对准视野， 然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀， 观察其活力， 鲜 精活力在 90% 以上的精液样品用于精子冷冻保存。 0043 催产剂由绒毛膜促性腺激素、 促黄体素释放激素 A2和马来酸地欧酮组成， 每千克 体重的鱼催产剂注射量为 ： 绒毛膜促性腺激素500 IU， 促黄。
19、体素释放激素A2 5微克， 马来酸 地欧酮 2 毫克。 0044 （3） 冷冻 ： 将 31ml 精液与 62ml 稀释液混合均匀， 4下平衡 30min 后， 加入 7ml 抗 冻剂 DMSO 混匀得混合精液， 分装至 1.5ml 离心管中， 置于液氮液面上方 5cm 处平衡 15min， 然后再置于液氮液面上平衡 5min， 再放入液氮中保存。 说 明 书 CN 103404508 B 5 4/4 页 6 0045 稀释液的配方为 ： 氯化纳 1.0wt%、 氯化钾 0.05wt%、 葡萄糖 1.5wt%， 余量为水。 0046 （4） 复苏 ： 从液氮中取出装有精液的离心管， 置于液氮蒸。
20、汽中平衡 5min， 然后迅速 置于 371水浴中快速晃动至融化得解冻精液。 0047 （5） 人工授精 ： 将解冻精液与花鱼卵 （每 300ml 鱼卵加 12ml 解冻精液） 搅拌混匀 后， 加入泥浆水中， 泥浆水的体积约为花鱼卵体积的 4 倍， 继续搅拌 30 秒， 再用清水清洗 鱼卵， 洗净后放入孵化器中孵化。 0048 冻精活力检测 0049 先用塑料细口吸管吸一滴水于载玻片上， 对准视野， 然后用针尖挑取解冻精液立 即于显微镜下搅匀， 观察其活力， 经检测精子存活率平均为 75.6%。 0050 人工授精具体实施 0051 2013 年 4 月 24 日， 进行复苏精液人工授精实验。将花鱼卵挤入干燥的碗中， 共 挤卵 250ml （约 132000 粒） ， 滴加约 9ml 解冻精液并拌匀后倒入 1000ml 的泥浆水中， 继续搅 拌约1分钟， 再用清水清洗鱼卵， 洗净后放入孵化器孵化。 受精率平均为79.2%， 孵化率平均 为 76.5%。2013 年 4 月 28 日共计孵化出约 80000 尾鱼苗。 0052 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说 明 书 CN 103404508 B 6 。