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1、10申请公布号CN104195118A43申请公布日20141210CN104195118A21申请号201410380228822申请日20140804C12N7/02200601A61K39/145200601A61P31/16200601C12R1/9320060171申请人北京科兴生物制品有限公司地址100085北京市海淀区上地西路39号北大生物城72发明人庞鉴勇陈秋兰惠增弟张景敏李军胡伟尹卫东74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称一种处理流感病毒收获液的方法57摘要本发明提供了一种处理流感病毒收获液的方法，该方法将感染了流感病毒的鸡胚尿囊液收集。
2、后，分别使用碟片离心机、预过滤器、减菌滤器对其进行处理，使处理后的流感病毒收获液流感病毒抗原的损失率低于10，显著降低流感病毒收获液中微生物限度，比国家药典中规定的微生物下限低了2个数量级。本发明方法能有效去除收获液中的杂质，为后期制备流感疫苗提供了安全保障，且能够提高了单根减菌滤器的通量和使用效率，降低了减菌滤器的使用成本，在流感病毒疫苗的制备领域具有较好的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104195118ACN104195118A1/1页21一种处理流感病毒收获液的方法，其特征在于，包。
3、括以下步骤1将流感病毒收获液经碟片离心机离心后，收集澄清液；2澄清液通过预过滤器过滤；3滤液经过减菌滤器过滤；所述的流感病毒收获液为接种流感病毒后收获的鸡胚尿囊液。2如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流感病毒收获液获得方法是将102105EID50/ML的流感病毒接种于911日龄鸡胚的尿囊腔中，将接种后鸡胚置于3236孵化器中培养3090小时，留下活胚，置010冷胚后，收获的鸡胚尿囊液即为流感病毒收获液。3如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1碟片离心机转速为400010000RPM,排渣时间为3090MIN。4如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1是将流感病毒收获液投放入碟片。
4、离心机的速度控制在2050KG/MIN。5如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2的预过滤器孔径5M。6如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2过滤过程中滤器压力02MPA。7如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3的减菌滤器孔径为02045M。8如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3过滤过程中滤器压力02MPA。9权利要求18任一所述的方法在制备流感疫苗中的应用。权利要求书CN104195118A1/4页3一种处理流感病毒收获液的方法技术领域0001本发明涉及疫苗制备领域，具体地，涉及一种处理流感病毒收获液的方法。背景技术0002流行性感冒INFLUENZA，简称流感是由甲A、乙B。
5、、丙C三型流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病，具有传染性强、传播速度快的特点。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并能在动物中引起流感流行和动物大量死亡；乙型流感病毒常常引起流感局部暴发；丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流感主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。接种流感疫苗是预防和控制流感的最有效手段之一，可以减少接种者感染流感的机会或者减轻流感症状。0003根据WHO相关指南规定，流感疫苗的生产可使用健康鸡群来源的鸡胚。目前，国内外流感疫苗生产普遍遵循这一原则，基本工艺步骤包括毒种接种鸡胚尿囊腔、。
6、培养、病毒收获、纯化、灭活、裂解、再纯化等。但传统的鸡胚培养技术存在收获液成分复杂不易处理问题。收获液中杂质主要有卵清、蛋壳、鸡血细胞、来自蛋壳表面和鸡胚本身可能存在的外源性微生物等，这些杂质会增加后期灭活和纯化工艺的难度，尤其微生物过多，会产生大量细菌内毒素，增加疫苗的副反应，给疫苗的安全性带来风险。中国药典第三部2010版中规定收获液中微生物限度应小于105CFU/ML。0004为了满足流感疫苗收获液中国家规定的微生物小于105CFU/ML的标准，现有各厂家在处理流感病毒收获液过程中使用了不同的工艺技术，分别采用绢布过滤，20M1M多级滤器过滤，管式离心机分离澄清，045M滤芯过滤，除菌级。
7、02M滤芯过滤，或前述两种或两种以上方法的组合。但这些处理流感病毒收获液方法的效果均不理想，主要表现在流感病毒抗原损失较大、收获液微生物限度降低不显著、使用大量滤芯造成成本增加。因此需要开发一种处理流感病毒收获液的新工艺来解决上述问题。发明内容0005本发明的目的在于提供一种处理流感病毒收获液的方法，以解决现有技术在处理后的流感病毒收获液中流感病毒抗原损失较大、收获液中微生物限度降低不显著、且使用大量滤芯造成生产成本增加的诸多问题。0006本发明提供的一种处理流感病毒收获液的方法，包括以下步骤00071将流感病毒收获液经碟片离心机离心后，收集澄清液；00082澄清液通过预过滤器过滤；00093。
8、滤液经过减菌滤器过滤；0010本发明所述的流感病毒收获液为接种流感病毒后收获的鸡胚尿囊液。所述的流感病毒收获液获得方法是将102105EID50/ML的流感病毒接种于911日龄鸡胚的尿囊腔中，将接种后鸡胚置于3236孵化器中培养3090小时，留下活胚，置010冷胚后，收获的鸡说明书CN104195118A2/4页4胚尿囊液即为流感病毒收获液。0011本发明方法中，步骤1碟片离心机转速为400010000RPM,排渣时间为3090MIN。0012优选地，步骤1碟片离心机转速为7200RPM,排渣时间为60MIN。0013其中，步骤1进料速度控制在2050KG/MIN。进料即将流感病毒收获液投放入。
9、碟片离心机。0014本发明方法中，步骤2的预过滤器孔径5M。0015优选地，步骤2的预过滤器孔径为10M。0016步骤2过滤过程中滤器压力02MPA。优选01MPA。0017本发明方法中，步骤3的减菌滤器孔径为02045M。优选02M0018其中，步骤3过滤过程中滤器压力02MPA。优选01MPA。0019本发明提供了上述方法在制备流感疫苗中的应用。0020本发明的创新之处在于将碟片离心机、预过滤器、减菌滤器的组合应用于流感病毒收获液的处理中。碟片离心机是立式连续流离心机的一种，其转鼓装在立轴上端，通过传动装置由电动机驱动而高速旋转。在转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件碟片。碟片与碟片之间留。
10、有很小的间隙。料液从位于转鼓中心的进料管进入转鼓。再流过碟片之间的间隙，固体颗粒或液滴在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣或液层。沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转鼓。0021碟片的作用是缩短固体颗粒或液滴的沉降距离、扩大转鼓的沉降面积，转鼓中由于安装了碟片而大大提高了分离机的生产能力。积聚在转鼓内的沉渣通过排渣装置在不停机的情况下从转鼓中排出。0022预过滤滤器和减菌滤器的原理两种过滤器原理一样，都是料液经过一定孔径的滤芯，在直接拦截和惯性撞击作用下，将料液中较大的微生物细菌等、较大的蛋白团块拦截下来，比孔径小流感病毒等可通过滤芯，达到降低微生。
11、物限度的目的。0023本发明方法使用了碟片离心机大大的提高了处理料液能力，提高了生产能力。使处理后的流感病毒收获液中流感病毒抗原的损失率低于10，显著降低流感病毒收获液中微生物限度，比国家药典中规定的微生物下限105CFU/ML低了2个数量级。本发明方法能有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块等，使流感病毒充分暴露，有利于后期流感病毒的灭活，使灭活更加充分，减少疫苗副反应的发生，保证了疫苗的安全性，且能够提高了单根减菌滤器的通量和使用效率，降低了减菌滤器的使用成本，在流感病毒疫苗的制备领域具有较好的应用前景。具体实施方式0024以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的。
12、范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。0025若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中使用的碟片离心机，型号HGDH204VC90A，南京中船绿洲机器有限公司；预过滤器，货号ZCGF210CDOMNICK说明书CN104195118A3/4页5HUNTER；减菌滤器，货号BPH22CASDOMNICKHUNTER；鸡胚孵化器，型号XF45北京云峰利民畜牧设备有限公司。0026本发明实施例中，流感病毒收获液是通过如下方法获得的流感病毒工作种子工作种子。
13、是由世界卫生组织WHO推荐、并经国家药品管理部门认可的甲型和乙型流感病毒的当年流行株或相似株传12代制备成的主种子批，主种子批传12代制备成的工作种子批接种、培养将稀释至一定病毒量102105EID50/ML的工作种子接种于911日龄鸡胚尿囊腔中，将接种后鸡胚置于3236中培养3090小时。收获流感病毒对培养完成的鸡胚进行照检，留下活胚，置010经一定时间冷胚后，收获流感病毒尿囊液。0027从收获的流感病毒尿囊液中取样检测血凝素含量、微生物限度。采用平皿法检测微生物限度。具体为，将样品用PH70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液进行110系列稀释，每一稀释度各取2ML，分注于2个平皿中，每块平皿注入1ML。
14、，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。0028实施例1处理流感病毒收获液的方法100291、碟片离心机离心流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心机转速为4000RPM,排渣时间为30MIN，进料速度控制在20KG/MIN。00302、澄清液经过孔径1M的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在005MPA。00313、料液再经过孔径为02M减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在005MPA，并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见表1。本方法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。0032实施例2处理流感病毒收获液的方法2003。
15、31、碟片离心机离心流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心机转速为7000RPM,排渣时间为60MIN，进料速度控制在35KG/MIN。00342、澄清液经过孔径3M的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在01MPA。00353、料液再经过孔径为03M减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在01MPA，并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见表1。本方法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。0036实施例3处理流感病毒收获液的方法300371、碟片离心机离心流感病毒收获液经过碟片离心机离心收集澄清液，碟片离心机转速为10000RP。
16、M,排渣时间为90MIN，进料速度控制在50KG/MIN。00382、澄清液经过孔径5M的预过滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在02MPA。00393、料液再经过孔径为045M减菌滤器过滤，过滤过程中滤器压力控制在02MPA，并记录减菌滤器的通量。过滤完成后取样检测血凝素含量、微生物限度。结果见表1。本方法有效去除收获液中的杂质，去除蛋壳、鸡血细胞、较大的蛋白团块。0040实施例4处理流感病毒收获液的方法对照试验0041流感病毒收获液通过20M滤器、10M滤器、3M滤器、1M滤器多级滤器过滤，再将澄清液经过除菌级02M滤芯过滤，进料速度与新工艺一致，记录减菌滤器的通量，与实施例13方法的结果进。
17、行比较，评价本发明方法中减菌滤器的处理能力。结果见表1。0042通过对比实施例14的方法处理流感病毒收获液后的各项指标，可以发现，实施例13采用本发明的方法收获抗原损失率较低，微生物限度远远低于2010版中国药典标准说明书CN104195118A4/4页6105CFU/ML。本发明方法中减菌滤器通量高于对照工艺中减菌滤器通量。0043表1本发明方法处理流感病毒收获液后的各项指标评价00440045注抗原损失率处理前收获液血凝素含量处理后血凝素含量处理前收获液血凝素含量0046虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104195118A。