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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510220830.X (22)申请日 2015.05.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104885847 A (43)申请公布日 2015.09.09 (73)专利权人 黑龙江省森林工程与环境研究所 地址 150081 黑龙江省哈尔滨市哈平路134 号 (72)发明人 李琳 梁素钰 田松岩 杜倩 刘铁男 刘延坤 王文帆 王明强 刘旭平 (74)专利代理机构 哈尔滨市船大专利事务所 23201 代理人 张贵丰 (51)Int.Cl. A01G 17/0。
2、0(2006.01) G01N 21/31(2006.01) 审查员 李莹 (54)发明名称 基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤 造林树种选择的方法 (57)摘要 本发明提供的是一种基于Biolog Eco微平 板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方法。 主要 包括： (1)采集不同造林树种根际土壤样品； (2) 进行Biolog Eco微平板实验， 绘制平均吸光值 (AWCD)曲线； (3)测定不同造林树种根际土壤样 品环境指标； (4)RDA/CCA排序分析。 本发明提供 了一种基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土 壤造林树种选择的方法， 该方法是一种快捷、 敏 感的造林树。
3、种选择的方法。 解决了传统方法工作 量大、 周期长、 资金投入大等问题， 弥补了相关的 理论空白， 从而为轻度盐渍土壤改良利用奠定了 基础。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 104885847 B 2017.04.05 CN 104885847 B 1.基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方法， 其特征是： (1)采集各待选造林树种根际土壤样品， 并将采集的各待选造林树种根际土壤样品分 别分成两份； (2)用各待选造林树种根际土壤样品中的一份， 进行Biolog Eco微平板实验， 连续测定 10天590nm与750nm波长的吸光度值， 按照一行代表一个样品。
4、、 一列代表一种碳源的规则绘 制平均吸光度值曲线， 选取所述曲线趋于平缓时的吸光度值数据作为微生物多样性数据保 存为一个.csv格式的文件； (3)用各待选造林树种根际土壤样品中的另一份， 测定各待选造林树种根际土壤样品 的根际土壤环境指标， 按照一行代表一个样品、 一列代表一个土壤环境指标的规则将土壤 样品的各个环境指标保存为一个.csv格式的文件； (4)利用R软件Vegan软件包调用两个.csv文件， 进行数据分析， 通过判定， 采用RDA或 CCA模型进行排序分析， 分析结果以排序图的方式进行显示， 选取根际土壤微生物多样性与 土壤环境指标相关性低， 即植物根际土壤微生物多样性受土壤环。
5、境因子的影响小的树种为 适于种植的树种。 2.根据权利要求1所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方 法， 其特征是： 所述Biolog Eco微平板实验具体包括： 将相当于10g烘干土壤的待选造林树 种根际鲜土壤样品悬浮于90mL磷酸缓冲液中、 并将静置后的上清液稀释至10-3， 接种至 Biolog Eco微平板上， 在25培养箱中培养， 46h后开始读取590nm和750nm的吸光度值， 此后每24h读取一次， 培养时间为10天。 3.根据权利要求1或2所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择 的方法， 其特征是： 所述根际土壤环境指标。
6、包括： 含水率、 pH值、 容重、 全氮含量、 全磷含量、 全钾含量、 有机质含量、 水溶性盐含量。 4.根据权利要求1或2所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择 的方法， 其特征是： 用于Biolog Eco微平板实验的待选造林树种根际土壤样品保存于4温 度下， 并于采集后7日内进行Biolog Eco微平板实验。 5.根据权利要求3所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方 法， 其特征是： 用于Biolog Eco微平板实验的待选造林树种根际土壤样品保存于4温度 下， 并于采集后7日内进行Biolog Eco微平板实验。 6.根据权利要。
7、求1或2所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择 的方法， 其特征是： 用于测定根际土壤环境指标的待选造林树种根际土壤样品于背阴处风 干后保存于一次性自封袋中。 7.根据权利要求3所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方 法， 其特征是： 用于测定根际土壤环境指标的待选造林树种根际土壤样品于背阴处风干后 保存于一次性自封袋中。 8.根据权利要求4所述的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方 法， 其特征是： 用于测定根际土壤环境指标的待选造林树种根际土壤样品于背阴处风干后 保存于一次性自封袋中。 9.根据权利要求5所述。
8、的基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方 法， 其特征是： 用于测定根际土壤环境指标的待选造林树种根际土壤样品于背阴处风干后 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 104885847 B 2 保存于一次性自封袋中。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 104885847 B 3 基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的 方法 技术领域 0001 本发明涉及的是一种轻度盐渍土壤造林树种的选择方法。 背景技术 0002 盐渍土壤是盐土和碱土以及各种盐化、 碱化土壤的统称。 按含盐量和pH值的不同 盐渍土壤可分为轻度盐渍土壤(pH值为7.18.5。
9、， 含盐量低于0.3)、 中度盐渍土壤(pH值 为8.59.5， 含盐量0.30.6)和重度盐渍土壤(pH值为9.5以上， 含盐量高于0.6)。 我国有9913万公顷的盐渍土壤， 气候干旱、 不合理灌溉、 过度放牧等原因使盐渍土壤面积呈 逐渐增长的趋势， 盐渍土壤的改良和利用具有长远的战略意义。 其中重度和重度盐渍土壤， pH值、 含盐量较高， 种植以抗性较强的草本植物为主， 种植树木几乎无法存活； 而轻度盐渍 土壤， pH值、 含盐量较低， 可以种植一些抗性较强的木本植物， 虽然无法成材， 但对生态环境 的改善作用不可忽视。 因此， 轻度盐渍土壤造林树种的正确选择， 成为盐渍土壤改良的基 础。
10、。 0003 树木生长所需的碳源是通过光合作用将空气中的CO2固定得到的， 而水分的吸收、 矿物质养分则必须通过根系与土壤的交换途径进入植物体内， 土壤除了给树木生长提供固 定的场所外， 还为树木的生长提供必须的养分。 同时， 树木又通过根系将自身新陈代谢的产 物排入土壤， 改善并影响土壤环境。 土壤中的有机氮是由土壤中的硝化细菌吸收无机氮通 过自身代谢转化而来的。 因此， 植物-土壤-微生物构成了树木根系的微生态环境， 这一微生 态环境中， 植物、 土壤和微生物的相互作用， 逐步改善了土壤的性质， 达到通过种植树木改 良盐渍土壤的目的。 0004 Biolog Eco微平板技术是通过微生物对。
11、单一碳源的利用， 表征土壤微生物生长情 况， 从而评价土壤微生物群落功能多样性的研究方法， 广泛应用于土壤生态系统的研究中。 RDA/CCA分析是基于对应分析发展而来的一种排序方法， 将对应分析与多元回归分析相结 合， 每一步计算均与环境因子进行回归， 又称多元直接梯度分析。 RDA/RCC分析广泛应用于 生态学研究中， 分析结果用来反应各生态因子之间的相关性。 有关Biolog技术和RDA/RCC分 析应用已有报道。 例如申请号为201410226089.3的专利文件中公开的 “基于Biolog微平板 及微量热法判断可提高土壤微生物活性碳源因子的方法” ； 申请号为201110206246.。
12、0的专 利文件中公开的 “一种应用于转基因作物土壤微生态安全性评价的Biolog ECO微平板技 术” 等。 但将这两种技术和分析方法结合起来用于盐渍土壤造林树种选择方面的研究还未 见报道。 因此， 利用RDA/RCC分析方法， 将Biolog Eco微平板结果和土壤环境因子相关联， 建 立基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造林树种选择的方法， 对轻度盐渍土壤改良利 用具有重要意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种快捷、 敏感， 能为轻度盐渍土壤改良利用提供基础的 说 明 书 1/5 页 4 CN 104885847 B 4 基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍。
13、土壤造林树种选择的方法。 0006 本发明的目的是这样实现的： 0007 (1)采集各待选造林树种根际土壤样品， 并将采集的各待选造林树种根际土壤样 品分别分成两份； 0008 (2)用各待选造林树种根际土壤样品中的一份， 进行Biolog Eco微平板实验， 连续 测定10天590nm/750nm波长的吸光度值， 按照一行代表一个样品、 一列代表一种碳源的规则 绘制平均吸光度值曲线， 选取所述曲线趋于平缓时的吸光度值数据作为微生物多样性数据 保存为一个.csv格式的文件； 0009 (3)用各待选造林树种根际土壤样品中的另一份， 测定各待选造林树种根际土壤 样品的根际土壤环境指标， 按照一行。
14、代表一个样品、 一列代表一个土壤环境指标的规则将 土壤样品的各个环境指标保存为一个.csv格式的文件； 0010 (4)利用R软件Vegan软件包调用两个.csv文件， 进行数据分析， 通过判定， 采用RDA 或CCA模型进行排序分析， 分析结果以排序图的方式进行显示， 选取根际土壤微生物多样性 与土壤环境指标相关性低， 即植物根际土壤微生物多样性受土壤环境因子的影响小的树种 为适于种植的树种。 0011 本发明还可以包括： 0012 1、 所述Biolog Eco微平板实验具体包括： 将相当于10g烘干土壤的待选造林树种 根际鲜土壤样品悬浮于90mL磷酸缓冲液中并稀释至10-3， 接种至Bi。
15、olog Eco微平板上， 在25 培养箱中培养， 46h后开始读取590nm和750nm的吸光度值， 此后每24h读取一次， 培养时 间为10天。 0013 2、 所述根际土壤环境指标包括： 含水率、 pH值、 容重、 全氮含量、 全磷含量、 全钾含 量、 有机质含量、 水溶性盐含量。 0014 3、 用于Biolog Eco微平板实验的待选造林树种根际土壤样品保存于4温度下并 于采集后7日内进行Biolog Eco微平板实验。 0015 4、 用于测定根际土壤环境指标的待选造林树种根际土壤样品保存于背阴处风干 处。 0016 本发明的主要步骤包括： (1)采集不同造林树种根际土壤样品； (。
16、2)进行Biolog Eco微平板实验， 绘制平均吸光值(AWCD)曲线； (3)测定不同造林树种根际土壤样品环境指 标； (4)RDA/CCA排序分析。 本发明提供了一种基于Biolog Eco微平板进行轻度盐渍土壤造 林树种选择的方法。 在实际生产中， 针对不同造林树种根际土壤微环境进行评价分析， 通过 微生物功能多样性和环境因子的相关性分析， 选取植物根际土壤微生物多样性受土壤环境 因子的影响小的树种进行造林。 该方法是一种快捷、 敏感的造林树种选择的方法， 解决了传 统方法工作量大、 周期长、 资金投入大等问题， 弥补了相关的理论空白， 从而为轻度盐渍土 壤改良利用奠定了基础。 附图说。
17、明 0017 图1为本发明的工艺流程示意图。 0018 图2为不同造林树种根际土壤微生物群落对碳源利用情况的AWCD分析图， 其中各 符号的含义为： H-黄菠萝； Y-小黑杨； Z-樟子松； YB-银白杨； L-落叶松； J-碱斑。 说 明 书 2/5 页 5 CN 104885847 B 5 0019 图3为RDA分析图， 其中各符号的含义为： BD， 土壤容重； MC， 土壤含水率； pH， 土壤pH 值； OM， 土壤有机质含量； tN， 土壤总氮含量； tP， 土壤总磷含量； tK土壤总钾含量； SC， 土壤水 溶性盐含量。 具体实施方式 0020 (1)对不同待选造林树种根际土壤样品。
18、进行采集。 将采集的土壤样品分成两份， 一 份保存于4冰箱于7日内进行Biolog Eco微平板实验， 一份于背阴处风干用于测定各项环 境指标。 (2)称取待选造林树种根际土壤样品进行Biolog Eco微平板实验， 连续测定10天 590nm/750nm波长的吸光度值， 并绘制平均吸光度值(AWCD)曲线， 根据曲线变化情况选取曲 线趋于平缓时的吸光度值进行后续实验分析， 将该数据作为微生物多样性数据保存为一 个.csv格式的文件(一行代表一个样品， 一列代表一种碳源)。 (3)测定不同造林树种根际土 壤样品的各环境指标， 将土壤样品的各个环境指标保存为一个.csv格式的文件(一行代表 一个。
19、样品， 一列代表一个土壤环境指标)。 (4)利用R软件Vegan软件包调用两个.csv文件， 进 行数据分析， 通过判定， 采用RDA或CCA模型进行排序分析， 分析结果以排序图的方式进行显 示。 通过排序图可以了解各土壤环境指标间的相关性、 各根际土壤微生物多样性与土壤环 境指标间的相关性， 选取根际土壤微生物多样性与土壤环境指标相关性低， 即植物根际土 壤微生物多样性受土壤环境因子的影响较小的树种进行造林。 0021 所述的Biolog Eco微平板实验步骤为： 称取相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品 悬浮于90ml磷酸缓冲液中并稀释至10-3， 接种至Biolog Eco微平板上， 在2。
20、5培养箱中培养 10天， 培养46h后， 读取590nm和750nm的吸光度值， 此后每24h读取一次。 0022 所述的土壤环境指标包括： 含水率、 pH值、 容重、 全氮含量、 全磷含量、 全钾含量、 有 机质含量、 水溶性盐含量。 含水率采用铝盒法测定； 容重采用环刀法测定； pH值采用电位法 测定； 全氮含量采用半微量开氏法测定； 全磷含量采用高氯酸浓硫酸熔融， 钼锑抗比色法测 定； 全钾含量采用高氯酸浓硫酸熔融， 火焰光度法测定； 有机质含量采用重铬酸钾氧化法测 定； 水溶性盐含量为土壤水溶性阳离子(Ca2+、 Mg2+、 K+、 Na+)和阴离子(HCO3-、 CO32-、 SO4。
21、2-、 Cl-) 之和。 0023 所述的RDA/CCA分析步骤： RDA分析图中， 不同形状代表不同样方， 不同性状之间距 离的远近可以代表样方之间的差异程度； 环境因子与样方之间的夹角代表样方与环境因子 间的相关性， 锐角为正相关， 钝角为负相关， 直角为无相关性； 不同样方向代表环境因子的 箭头做垂线， 投影点越相近说明样方间该该环境因子属性值越相似； 环境因子间的夹角也 可代表环境因子之间的相关性， 同样， 锐角为正相关， 钝角为负相关， 直角为无相关性。 0024 下面举例对本发明做更详细的描述。 0025 样品的采集： S型选取9棵待选树种， 沿着根系用土钻采集1020cm土壤样品。
22、， 每3 棵树木的土壤样品混合为1个样品。 将采集的土壤样品装入无菌自封袋， 置于冰盒内带回实 验室过1mm筛后， 分成两份， 一份于4冷藏保存， 用于Biolog Eco微平板实验， 一份至于背 阴通风处晾干， 用于土壤样品环境指标的测定。 0026 Biolog Eco实验： (1)称取2.654g磷酸二氢钾(KH2PO4， 分析纯)， 6.962g磷酸氢二钾 (K2HPO4， 分析纯)， 加入蒸馏水定容至1L， 调节pH7.0得0.05mol/L磷酸缓冲液， 灭菌备用； (2)在超净工作台中， 称取相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品， 将土壤样品加入至带玻璃 说 明 书 3/5 页 6 。
23、CN 104885847 B 6 珠的含90ml磷酸缓冲液的三角瓶中； (3)将三角瓶置于摇床， 100r/min转速下振荡20min后 静置30min； (4)吸取上清液， 按10倍稀释法将土壤溶液稀释至10-3； (5)使用8通道移液器吸 取150 L稀释液接种至Biolog Eco板每个微孔中； (6)在25培养箱中培养10d； (7)培养4 6h后， 使用酶标仪(MD VersaMax)读取590nm和750nm波长第一次数据， 此后每24h读取一次 数据， 连续10d。 0027 土壤环境因子的测定： 测定结果如表1至表4. 0028 表1 不同造林树种根际土壤基本理化性质 0029。
24、 0030 注： 1.15为5种不同待选造林树种， 6为碱斑草甸 0031 2.同列的不同字母表示差异的显著性(P0.05， n3) 0032 表2 不同造林树种根际土壤水溶性阴离子含量 0033 0034 15为5种不同待选造林树种， 6为碱斑草甸 0035 表3 不同造林树种土壤水溶性阳离子含量 0036 0037 注： 1.15为5种不同待选造林树种， 6为碱斑草甸 0038 2.同列的不同字母表示差异的显著性(P0.05， n3) 0039 表4 不同植物群落根际土壤水溶性盐含量 0040 0041 注： 1.15为5种不同待选造林树种， 6为碱斑草甸 0042 2.同行的不同字母表示。
25、差异的显著性(P0.05， n3) 0043 RDA/CCA分析。 结合图3， 结果表明， 2和5根际土壤微生物功能多样性较为相似， 其 它造林树种根际土壤微生物多样性相差较大； 3、 4和5根际土壤理化性状属性值较为相似； 土壤理化性状间的相关性表现为， 土壤有机质、 全磷、 全钾、 全氮呈正相关， 土壤容重、 pH值、 水溶性盐含量呈正相关， 土壤养分因子与土壤容重、 pH值、 水溶性盐含量呈负相关， 含水率 与其他理化性状间的相关性较低； 6根际土壤微生物多样性与土壤pH值、 土壤可溶性盐含 说 明 书 4/5 页 7 CN 104885847 B 7 量、 容重正相关， 与土壤养分性状。
26、负相关， 表明了极端环境土壤微生物对碳酸盐逆境的适应 性； 3、 4、 5三种造林树种根际土壤微生物多样性与土壤养分性状和土壤逆境性状的相关性 较低， 说明这三种植物根际土壤微生物多样性受土壤环境因子的影响较小； 1和2两种造林 树种根际土壤微生物多样性与土壤养分性状正相关， 与土壤逆境性状负相关， 表明这两种 植物根际土壤微生物对养分因子依赖性较强， 受逆境因子的影响也较强。 因此宜选择3、 4、 5 作为轻度盐渍土壤的造林树种。 说 明 书 5/5 页 8 CN 104885847 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 104885847 B 9 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 104885847 B 10 。