技术领域
本发明涉及植物诱变育种技术领域，具体而言，涉及一种基于诱导多倍体的黄瓜育种方法及多倍体植株的鉴定方法。
背景技术
多倍体因其“巨大性”，提高作物产量和品质、增强抗病抗逆能力，在生产上应用较广。多倍体育种已广泛应用于粮食作物(罗小金和贺浩华，2011)、果蔬作物(陈劲峰等，2004；马跃等，2015，Amaral等，2015)、观赏植物(李涵等，2009，李豆豆等，2013，Chen等，2016)以及药用植物(王朝梁等，2007，王跃华等，2010)育种工作中，用于改善二倍体亲本的农艺性状。利用多倍体作为育种中间材料获得三倍体(刁卫平等，2009；Diao等，2009)、附加系材料在生产上具有重要的应用价值。
黄瓜是大宗性蔬菜作物，为各地主要栽培蔬菜作物之一，既可鲜食又可做熟食。目前关于黄瓜多倍体育种方面的研究已经开展，各地人们喜好不同，主栽品种和类型差异较大。
人工诱导多倍体常见的化学诱变剂有氨磺灵、氟乐灵和秋水仙素等(岳敏等，2011；储丽红等，2014)。秋水仙碱的发现与使用，使得体外多倍化使用抗裂剂成为人工多倍体诱导的最重要的应用(Sattler等，2016)。虽然植物多倍体诱变技术已被广泛采用，但由于市场对黄瓜的需求旺盛，现有的黄瓜种质资源还无法满足人们的需要。
有鉴于此，特提出本发明。
参考文献
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发明内容
本发明采用不同浓度和不同处理时间分别对三种类型黄瓜进行多倍体诱变，旨在建立黄瓜同源四倍体秋水仙素诱导及鉴定体系，获得同源四倍体植株，创造新的黄瓜种质资源，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，包括：
将萌发后的黄瓜种子育成幼苗，用秋水仙素溶液对所述幼苗的生长点进行诱导处理。
秋水仙素(英语：Colchicine)是最初萃取于百合科植物秋水仙的种子和球茎的一种植物碱。秋水仙素将细胞内的微管中主要的成分微管蛋白黏 合，阻止微管的聚合作用，从而抑制纺锤体的形成，阻止随着细胞支架改变的有丝分裂，细胞也不能分裂成两个子细胞，于是就形成染色体数目加倍的细胞。因此，秋水仙素亦可透过诱发多倍性培育植物新品种。
多倍体植物具有很多优良的性状，与正常染色体组成的植物相比，其形态上加大(如茎秆、叶片、果实、种子、花朵等)和营养物质增多(如蛋白质、糖类、脂肪)。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，所述秋水仙素溶液的浓度为0.18～0.24wt％。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，在上午7:00～8:00和下午5:00～6:00各处理一次。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，处理次数一共为5～7次。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法：
当所述秋水仙素溶液的浓度为0.2wt％时，共处理5次。
进一步优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法：
当所述秋水仙素溶液的浓度为0.2wt％时，共处理7次。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，所述将萌发后的黄瓜种子育成幼苗的操作包括：
将所述黄瓜种子在28～32℃萌发34～38h后播于50孔穴盘中育成幼苗。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，当所述幼苗的两片子叶完全展开后再对其进行秋水仙素诱导处理。
优选的，如上所述的基于诱导多倍体的黄瓜育种方法，所述用秋水仙素对所述幼苗的生长点进行诱导处理的方法为：
将棉球置于生长点，将秋水仙素溶液滴于生长点棉球上，完全浸湿棉球。
如上所述的黄瓜育种方法所得多倍体植株的鉴定方法，包括：
对二倍体与变异植株同时进行植株形态鉴定、气孔鉴定、流式细胞仪鉴定及细胞学鉴定。
优选的，如上所述的鉴定方法，所述植株形态鉴定包括：
于同一时间测量二倍体与变异植株的高度，选取相同节位完全展开的叶片测量长和宽；
取当天开放的雌花和雄花进行拍照，分割雌花与子房，比较二倍体和同源四倍体雌雄花和子房大小。
优选的，如上所述的鉴定方法，所述气孔鉴定包括：
于同一时间选取二倍体与变异植株相同节位完全展开的叶片，撕取所述叶片的下表皮于滴有一滴蒸馏水的载玻片上，盖片，显微镜下观察气孔的数目和密度、保卫细胞内叶绿体数目；
优选的，所述气孔鉴定还包括：每个植株选取8～12个视野，统计单位面积气孔数目，每个视野随机选一个气孔测量气孔保卫细胞的长度和宽度。
优选的，如上所述的鉴定方法，所述细胞学鉴定包括：
取二倍体和变异植株生长点幼嫩叶片，利用流式细胞仪进行DNA含量测定；
根据流式细胞仪检测结果，对DNA含量加倍植株于晴天上午7:00～8:00取长度0.7mm～1.3mm的幼嫩雄花，于卡诺氏固定液中固定20～28h，蒸馏水洗涤2～4次，体积百分数为73％～77％的乙醇溶液(最优选为75％的乙醇溶液)中保存。
挑取花药于0.8M～1.2M(最优选为1.0M)的HCl中60℃水浴7min，蒸馏水洗涤2～4次，置于载玻片上，卡宝染液染色3min，压片制片，显微镜观察花药绒毡层体细胞染色体数目。
优选的，如上所述的鉴定方法，每个植株统计18～22个花药绒毡层体细胞，以加倍染色体数目所占比例高于85％作为同源四倍体纯合体的鉴定标准
通过本发明提供的技术手段，可以有效选育出适合生产应用的黄瓜多倍体新品系，从而使其经济效益得以改善。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为变异植株与对应二倍体叶片比较；
图2为变异植株与对应二倍体雌雄花器官比较；A、C、E为二倍体，B、D、F分别为其对应变异植株；
图3为变异植株与对应二倍体气孔比较。
具体实施方式
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1材料与方法
1.1试验材料
以河北科技师范学院黄瓜课题组提供的三个类型黄瓜(华南型‘TZT’、华北型‘D19’、欧洲温室型‘NS3’)种子为试验材料。
1.2多倍体诱导
三种类型黄瓜种子30℃萌发36h后，播于50孔穴盘中，置于日光温室内育苗。当两片子叶完全展开后，将棉球置于生长点，用胶头滴管吸取秋水仙素溶液，滴于生长点棉球上，完全浸湿棉球。采用三个秋水仙素浓度(0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％)分别于上午7:00-8:00和下午5:00-6:00各处理一次，处理次数为3次、5次和7次，共3×3个处理，每处理100株，对三种类型黄瓜幼苗生长点进行多倍体诱导处理。每个处理结束后，弃去棉球。
1.3多倍体植株的鉴定
1.3.1植株形态与气孔鉴定
于同一时间测量二倍体与变异植株的高度，选取相同节位完全展开的叶片测量长和宽。撕取该叶片的下表皮于滴有一滴蒸馏水的载玻片上，盖片，显微镜下观察气孔的数目和密度、保卫细胞内叶绿体数目，进行初步鉴定。每个植株选取10个视野，统计单位面积(20×)气孔数目，每个视野随机选一个气孔测量气孔保卫细胞的长度和宽度。
取当天开放的雌花和雄花进行拍照，分割雌花与子房，比较二倍体和同源四倍体雌雄花和子房大小。
1.3.2细胞学鉴定
取二倍体和变异植株生长点幼嫩叶片，利用流式细胞仪进行DNA含量测定，进行进一步鉴定。
根据流式细胞仪检测结果，对DNA含量加倍植株于晴天上午7:00-8:00取长度约1mm的幼嫩雄花，于卡诺固定液(无水乙醇：冰乙酸 3:1)中固定24h，蒸馏水洗涤三次，75％乙醇中保存。挑取花药于1M HCl中60℃水浴7min，蒸馏水洗涤三次，置于载玻片上，卡宝染液染色3min，压片制片，显微镜观察花药绒毡层体细胞染色体数目，进行最终鉴定。每个植株统计20个细胞，以加倍染色体数目所占比例高于85％作为同源四倍体纯合体的鉴定标准。
根据秋水仙素处理后成苗植株数目计算死亡率，根据上述鉴定方法鉴定同源四倍体株数计算诱导率。
死亡率(％)＝死亡的幼苗数/总数×100。
诱导率(％)＝产生变异的幼苗数/总数×100
2结果与分析
2.1秋水仙素对三个类型黄瓜的诱导效果
由表1，秋水仙素不同浓度和不同时间处理，三种类型黄瓜幼苗死亡率均不同。总体上看,随着处理浓度增加和时间延长,三种类型黄瓜的幼苗死亡率随之增加,变异率也不断增加。0.1wt％浓度秋水仙素处理后，黄瓜幼苗死亡率相对较低，但变异率为0.00％。0.3wt％浓度秋水仙素处理后，随着处理时间延长易造成生长点毒害作用增强，黄瓜幼苗死亡率相对较高，处理84h时死亡率分别达到84.00％、97.40％和92.73％。结果发现，以0.2wt％浓度秋水仙素处理60h和84h、0.3wt％浓度秋水仙素处理60h诱导效果较佳。
表1三个类型黄瓜的诱导效果
2.2多倍体黄瓜植株的鉴定
2.2.1诱导植株的形态学与气孔鉴定
对诱导植株进行初步筛选，观察植株形态特征与叶片下表皮气孔特征。与对应二倍体黄瓜材料相比，同源四倍体黄瓜植株高度、生长速度、叶片大小、雌雄花器官与子房均均出现明显的变异现象。植株形态矮小、叶片颜色变深、叶片褶皱(图1)，雌雄花和子房均增大、花冠褶皱程度高(图2)，花粉败育率较高。多倍体气孔的巨大性是多倍体植株在细胞水平的表现，也是初步筛选和鉴定的重要标准。实验表明，同源四倍体D19、TZT和NS3的气孔面积有所增大，单位面积的气孔数有所减少(表2；图3)，分别为其二倍体的48.15％、50％、33.85％。同源四倍体D19、TZT和NS3的保卫细胞内叶绿体数目分别增加了2.00、1.73.2.03倍(表2；图3)。
表2黄瓜变异植株与对应二倍体的形态与叶表皮气孔比较
利用流式细胞仪对变异植株进行进一步鉴定，测定三种类型黄瓜二倍体相对DNA含量作为对照，均在50处有一个主峰，对应同源四倍体基因组DNA均在100处有一个主峰。采用常规染色体压片制片技术观察染色体数目，对变异植株进行最终鉴定。结果表明，三种类型黄瓜二倍体染色体均为2n＝2x＝14，对应同源四倍体染色体均为2n＝4x＝28。本实验成果获得三种类型黄瓜的同源四倍体新种质。
讨论
陈劲峰等(2004)对采用不同浓度秋水仙素溶液浸泡干种子的方法获得黄瓜同源四倍体，发现0.4％的秋水仙素浸萌动种子4h的染色体加倍率可达26.7％。本研究中通过秋水仙素处理分别获得了三种类型黄瓜的同源四倍体材料，丰富了黄瓜的种质资源。实验发现秋水仙素处理时间越长、浓度越高，黄瓜幼苗的死亡率越高。三种类型黄瓜比较发现，不同类型黄瓜对秋水仙素处理的时间和浓度的耐受性存在差异，其中华北型黄瓜对秋水仙素的耐受性相对较高，秋水仙素处理浓度为0.3％、时间为84h时，华北型黄瓜成活率为26％，比华南型和欧洲温室型黄瓜分别高出23.4％和17.73％。同源四倍体鉴定后发现，三种类型黄瓜秋水仙素诱导率较高的浓度和时间均为0.2％浓度处理60h、84h和0.3％浓度处理6h。
二倍体与同源四倍体植株在形态学、生理学、细胞学等方面均存在较大差异，研究表明紫松果菊同源四倍体植株叶片气孔、花粉粒、花、叶片宽度与厚度、保卫细胞内叶绿体数目均高于二倍体亲本，而植株高度、气孔密度均低于二倍体亲本(Abdoli等,2013)。与二倍体亲本比较发现同源四倍体植株粗壮、植株相对生长缓慢；叶片深绿、叶色身、叶有褶皱；雌雄花和子房均有一定程度的增大；叶片下表皮气孔增大、单位面积气孔密 度减小，保卫细胞内叶绿体数目增加。综上所述，二倍体亲本黄瓜通过秋水仙素诱变后，在形态学、解剖学、细胞学等方面均表现出不同程度的畸形现象。
多倍化易导致植物育性降低(Sattler等，2016)。陈劲峰等(2004)四倍体花粉粒大小不一，每一朵花中平均有2.3％的4孔花粉粒。刁卫平等(2008)发现四倍体植株自交后代在细胞遗传水平上的稳定性，但二倍体与同源四倍体黄瓜育性上存在较大差异。本研究中显微镜观察黄瓜花粉发现，三种类型同源四倍体黄瓜花粉有较高比率的败育现象，并出现四孔、五孔型花粉等形态变异花粉。自交授粉后，同源四倍体黄瓜单瓜结籽率较低。实验发现，增加雄花授粉花个数，可在一定程度上提高同源四倍体黄瓜的单瓜结籽率，可用于同源四倍体黄瓜新种质繁育与推广。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。