一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610993495.1 (22)申请日 2016.11.10 (71)申请人 四川理工学院 地址 643000 四川省自贡市汇兴路学苑街 180号 (72)发明人 刘君 刘华康 王晗 陈静 罗雁 刘永明 张薇 (74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 代理人 姜彦 (51)Int.Cl. A23K 50/50(2016.01) A23K 10/18(2016.01) A23K 20/163(2016.01) A23K 20/105(2016.0。

2、1) (54)发明名称 一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制 备方法 (57)摘要 本发明公开了一种兔用复合型合生元微生 态制剂及其制备方法， 首先分别在不同的环境下 筛选出肠道益生菌， 通过对筛选出的肠道益生菌 的功能和生物学特性比较， 并且在模拟肠道环境 下比较益生菌的活菌数变化， 筛选出最佳的菌 株， 将各类低聚糖含量进行测定， 选择出最佳添 加量， 将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合 生元微生态制剂。 本发明促进了外源性益生菌在 兔肠道的定植， 并且选择性刺激多种益生菌的生 长和繁殖， 减少了动物食用抗生素对兔肉质的影 响， 还能提高饲料的转化率、 增加肉类品质和提 高食品的安全质量。

3、， 解决了由传统的抗生素而带 来的药物残留、 产生抗药性、 动物肠道微生态平 衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质 量问题。 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 106509455 A 2017.03.22 CN 106509455 A 1.一种兔用复合型合生元微生态制剂， 其特征在于， 所述兔用复合型合生元微生态制 剂由益生菌和益生元组成； 按照质量比益生菌： 益生元1:15。 2.如权利要求1所述的兔用复合型合生元微生态制剂， 其特征在于， 所述益生菌由双歧 杆菌、 枯草芽孢杆菌和粪肠球菌组成。 3.如权利要求1所述的兔用复合型合生元微生态制剂， 其特征在于， 所述益生元由低聚。

4、 糖和酸化剂组成； 所述低聚糖为木寡糖、 果寡糖， 乳寡糖， L-阿拉伯糖， 酸化剂由乳酸、 柠檬酸、 延胡索酸 组成的复合酸化剂。 4.如权利要求1或3所述的兔用复合型合生元微生态制剂， 其特征在于， 所述益生菌为 0.02-15g/kg， 益生菌营养物质为0.05-80g/kg， 低聚糖为0.01-90g/kg。 5.如权利要求3所述的兔用复合型合生元微生态制剂， 其特征在于， 木寡糖0.05-5g/ kg、 果寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 添加由1份乳酸、 3份柠檬 酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂， 复合酸化剂占微生态制剂比。

5、例的0.1-0.5。 6.一种如权利要求1所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法， 其特征在于， 该兔 用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括： 步骤一、 从兔的养殖场内的土壤、 喂养饲料槽、 胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌或粪链 球菌、 枯草芽孢杆菌， 根据兔子消化系统特点， 产气和产酸的益生菌都会不同程度给兔子带 来负面效应， 故母本益生菌仅选用双歧杆菌， 将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能及 安全性的鉴定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选益生菌； 步骤二、 利用兔肠道微生物与糖代谢、 维生素的关系， 筛选出具有能提高能量的获取和 储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益。

6、生菌， 利用益生菌在兔肠道中的提高能量 的获取和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力， 根据微生物技术指标筛选优质兔肠道益 生菌； 步骤三、 在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌， 测定各类益生菌的活 菌数， 繁殖代数， 选取得到1株粪肠球菌或粪链球菌、 1株枯草芽孢杆菌和1株双歧杆菌； 步骤四、 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选 择由低聚糖组成的益生元， 得出各类低聚糖的最佳添加量； 步骤五、 向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1-0.5加入由1份重量的乳酸、 3 份重量的柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂； 步骤六、 将添加复合酸化剂后。

7、的3株益生菌与质量比5的益生元进行结合， 配制出兔 用复合型合生元微生态制剂。 7.如权利要求6所述的兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法， 其特征在于， 营养物 质包括： NaCl浓度为1， 蛋白胨1-100g/kg、 牛肉膏2-8g/kg、 蔗糖1-50g/kg、 酵母粉1-20g/ kg、 碘酸钾1-3g/kg、 磷酸二氢钠0.1-2.5g/kg、 硫酸镁0.1-1g/kg、 复合维生素0.01-10g/ kg,、 复合氨基酸0.01-10g/kg。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106509455 A 2 一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发。

8、明属于生物制剂领域， 尤其涉及一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备 方法。 背景技术 0002 目前， 我国合生元微生态制剂在动物的生产中的应用研究还较少， 畜牧业动物食 用添加剂中微生态制剂的使用情况还较少， 人们对微生态制剂适用添加比较模糊， 即混淆 有针对性的添加对象， 导致动物生长的效果往往低于预期效果。 微生态制剂的出现是由于 人们生活水平的提高， 人们逐渐认识到抗生素长期添加于饲料中可通过食物链对人类的健 康造成危害。 微生态制剂的研究应用克服了长期使用抗生素给养殖业造成的种种弊端， 对 发展绿色饲料添加剂具有广阔的应用前景， 己被农业部列为二十一世纪重点推广技术项 目。 这意味。

9、着对微生态制剂的研究、 推广符合我国可持续发展的总体要求。 0003 现有的微生态制剂中菌株的稳定性没有得到很好的保证， 投给菌必须以活菌的形 式通过胃到达肠道代谢， 并定居在肠道内培殖， 这对一般的孢子形式的细菌来说是不易做 到的； 微生态制剂没有针对性的添加对象， 国内对微生态制剂的应用还不够充分， 推广度不 够， 被养殖户接受的程度不高为了解决滥用抗生素导致越来越多的致病菌产生抗药性， 药 物残留， 降低兔肉产品品质以及由于食物链累积对人类身体健康带来的严重影响， 生产替 代抗生素的微生态制剂势在必行。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，。

10、 旨在解 决目前动物用合生元微生态制剂吸收利用率低， 应用效果差的问题。 0005 本发明是这样实现的， 一种兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法， 首先分别 在不同的环境下筛选出肠道益生菌， 通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比 较， 并且在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化， 筛选出最佳的菌株， 将各类低聚糖含 量进行测定， 选择出最佳添加量， 将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制 剂。 本发明是这样实现的， 一种兔用复合型合生元微生态制剂， 所述兔用复合型合生元微生 态制剂由益生菌和益生元组成； 0006 所述益生菌： 益生元1:15的质量比比例混合。 0007 进。

11、一步， 所述益生菌由双歧杆菌、 芽孢杆菌和粪肠球菌组成(标准菌株均购自北京 北纳创联生物技术研究院)。 0008 进一步， 所述益生元由低聚糖和酸化剂组成； 0009 所述低聚糖为木寡糖、 果寡糖， 乳寡糖， L-阿拉伯糖， 酸化剂由乳酸、 柠檬酸、 延胡 索酸组成的复合酸化剂。 0010 进一步， 所述益生菌为0.02-15g/kg， 益生菌营养物质为0.05-80g/kg， 低聚糖为 0.01-90g/kg。 说 明 书 1/9 页 3 CN 106509455 A 3 0011 进一步， 低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5- 3g/k。

12、g， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 添加由1份乳酸、 3份柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂 0.1-0.5(占微生态制剂比例)。 0012 本发明的另一目的在于提供一种所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法， 所述制备方法包括以下步骤： 0013 首先针对性的分离、 筛选出肠道益生菌， 通过在模拟肠道环境下比较益生菌的活 菌数变化， 筛选出最佳的菌株， 将各类低聚糖含量进行测定， 选择出最佳添加量， 将适合兔 胃、 肠道的益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。 0014 进一步， 兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括： 0015 步骤一、 从兔的养殖场内的土壤、 喂。

13、养饲料槽、 胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌 (粪链球菌)、 枯草芽孢杆菌和双歧杆菌， 将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能及安全 性的鉴定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选益生菌； 0016 步骤二、 利用兔肠道微生物与糖代谢、 维生素的关系， 筛选出具有能提高能量的获 取和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌， 利用益生菌在兔肠道中的提高 能量的获取和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力， 根据微生物技术指标筛选优质兔肠 道益生菌； 0017 步骤三、 在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌， 测定各类益生菌 的活菌数， 繁殖代数， 进行更进一步的筛选， 最终选取得。

14、到1株粪肠球菌(粪链球菌)、 1株枯 草芽孢杆菌和1株双歧杆菌； 0018 步骤四、 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程 度选择由低聚糖组成的益生元， 得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果寡 糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 0019 步骤五、 向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1-0.5加入由3份重量的乳 酸、 1份重量的柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂； 质量比0.1-0.5； 0020 步骤六、 将添加复合酸化剂后的3株益生菌与质量比5的益生元(木寡糖0.05- 5g/k。

15、g、 果寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg)进行结合， 配制出兔 用复合型合生元微生态制剂。 0021 进一步， 步骤一中进行菌种的鉴定包括： 0022 常规鉴定： 芽孢杆菌繁殖快速， 四小时增殖10万倍， 生命力强无湿状态可耐低温 60、 耐高温+280， 耐强酸、 耐强碱、 抗菌消毒、 耐高氧(嗜氧繁殖)、 耐低氧(厌氧繁殖)。 体 积比一般病原菌分子大四倍数， 占据空间优势， 抑制有害菌的生长繁殖。 粪肠球菌为圆形或 椭圆形、 呈单个或成对或短链状排列的革兰阳性球菌， 无芽胞， 无鞭毛， 为需氧或兼性厌氧 菌。 本菌对营养要求较高， 要。

16、求高盐(6.5NaCl),高碱(pH9.6),40胆汁培养基和10-45 环境下生长。 0023 将双歧杆菌、 芽孢杆菌和肠球菌益生菌和选择出的益生元有机结合起来， 再加入 有利于益生菌生长的营养物质， 制成复合型合生元微生态制剂。 0024 营养物质： 由于兔属于哺乳类动物， 所用稀释生理盐水与哺乳类、 两栖动物略有区 别， 一般NaCl浓度为0.9， 蛋白胨1-100g/kg、 牛肉膏2-8g/kg、 蔗糖1-50g/kg、 酵母粉1- 20g/kg、 碘酸钾1-3g/kg、 磷酸二氢钠0.5-2.5g/kg、 硫酸镁0.1-1g/kg、 复合维生素0.01- 说 明 书 2/9 页 4 。

17、CN 106509455 A 4 10g/kg,、 复合氨基酸0.01-10g/kg。 0025 本发明的兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法， 能避免单独使用益生菌产 品的弱点， 相辅相成， 扬长避短， 促进了外源性益生菌在兔肠道的定植， 并且选择性刺激多 种益生菌的生长和繁殖， 从而达到促进动物健康的目的， 减少了动物食用抗生素对兔肉质 的影响， 更加健康安全， 无公害， 不仅可以促进动物生长， 还能提高饲料的转化率、 增加肉类 品质和提高食品的安全质量， 根据各类益生菌选择出合适的益生元， 解决了由传统的抗生 素而带来的药物残留、 产生抗药性、 动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质。

18、量等食 品安全与质量问题。 0026 本发明提供的兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法， 解决了饲养商品兔单 独使用益生菌产品的弱点， 并且适合于各类型商品兔， 扬长避短， 促进了外源性益生菌在动 物肠道的定植， 并且选择性刺激多种益生菌的在兔只体内的迅速生长和繁殖， 从而达到促 进兔只健康的目的， 其生产性能也得以极大提高， 减少了传统动物食用添加剂对兔肉的影 响， 更加经济适用。 目前对动物微生态制剂的作用机理了解程度还不够全面， 缺乏深层次的 机理、 机制研究， 而本发明较清楚地阐述了该复合型微生态制剂的作用机理并且大胆采用 了模拟动物肠道环境实验， 通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生。

19、物学特性比较， 在模拟 肠道环境下比较益生菌的活菌数变化， 筛选得到最佳的菌株； 再将各类低聚糖含量进行了 测定， 选择出最佳添加量， 将肠道益生菌和低聚糖混合制成兔用复合型合生元微生态制剂。 目前使用的抗生素替代品功能还比较单一， 而本发明所得的复合型微生态制剂充分克服了 这一缺点， 通过将各种益生菌与益生元以最适的比例混合实现了调节动物肠道微生物平 衡， 维持肠道健康， 刺激有益菌群的生长， 竞争性抑制有害菌， 最终达到促进动物的生长， 提 高兔只的免疫力以及生产性能， 而且获得的菌种能够直接运用于发酵制备微生态制剂， 无 污染、 无残留。 现有技术只是将益生菌与益生元简单机械地混合， 并。

20、没有针对性， 进而得到 的复合型微生态制剂的效果不是很显著， 而本发明所得微生态制剂是将各种益生菌与益生 元按照最佳的比例而制得的， 很具针对性， 效果也很明显。 0027 本发明兔用复合型合生元微生态制剂能够调节兔肠道微生物平衡， 维持肠道健 康， 刺激有益菌群的生长， 竞争性抑制有害菌， 最终达到促进兔的生长， 提高兔的免疫力的 目的； 获得的菌种能够直接运用于发酵制备微生态制剂， 无污染、 无残留， 是现阶段标准的 绿色动物食用添加剂， 满足人们对食品的健康标准， 符合日益提高的食品安全与质量要求； 这种兔用复合型合生元微生态制剂在畜牧业中发挥着重要作用， 不仅可以促进兔生长， 还 能提。

21、高饲料的转化率， 并且符合食品质量与安全的标准。 0028 本发明为寻找替代传统兔用食用添加剂， 以用来解决畜牧行业面临的因抗生素滥 用造成的兔肉的安全性和品质的问题， 提出一种兔用复合型合生元微生态制剂； 旨在弥补 将益生菌或益生元直接添加进入饲料中的不足和对兔肉品质的影响， 能够提高兔肉生产质 量， 且对畜牧产业动物传统食用添加剂更新换代具有促进作用。 0029 本发明涉及一种有益于兔生长、 提高兔肉的复合型合生元微生态制剂； 合生元微 生态制剂作为一种新型、 绿色的动物食用添加剂， 主要作用是优化兔的肠道菌群， 调节兔肠 道微生物平衡， 维持其肠道健康， 利用低聚糖益生元刺激有益菌群的生。

22、长， 竞争性抑制有害 菌， 最终达到促进兔的生长， 提高动物机体对病原物质的抵抗力， 调节机体免疫系统， 从而 提高动物的免疫力， 达到提高兔肉的品质目的； 本发明模拟肠道环境筛选出有益菌后， 根据 说 明 书 3/9 页 5 CN 106509455 A 5 各类益生菌选择出合适的益生元， 如木寡糖、 寡甘露糖、 果寡糖等低聚糖,合成一种复合型 合生元微生态制剂， 为我国畜牧业解决新型动物食用添加剂以提供新的选择， 且解决了由 传统的抗生素而带来的药物残留、 产生抗药性、 动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制 品质量等食品安全与质量问题。 附图说明 0030 图1是本发明实施例提供的兔用复合。

23、型合生元微生态制剂的制备方法流程图。 具体实施方式 0031 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0032 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。 0033 本发明实施例的兔用复合型合生元微生态制剂为益生菌、 益生元； 按照质量比所 述益生菌(冻干粉)： 益生元1:15的比例混合。 0034 进一步， 所述益生菌由双歧杆菌、 芽孢杆菌和粪肠球菌组成(标准菌株均购自北京 北纳创联生物技术研究院)。 0035 进一步， 所述益生元由低聚糖和酸化剂组。

24、成； 0036 所述低聚糖为木寡糖、 果寡糖， 乳寡糖， L-阿拉伯糖， 酸化剂由乳酸、 柠檬酸、 延胡 索酸组成的复合酸化剂。 0037 进一步， 所述益生菌为0.02-15g/kg， 益生菌营养物质为0.05-80g/kg， 低聚糖为 0.01-90g/kg。 0038 进一步， 低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5- 3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 添加由1份乳酸、 3份柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂 0.1-0.5(占微生态制剂比例)。 0039 本发明的另一目的在于提供一种所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备。

25、方法， 所述制备方法包括以下步骤： 0040 首先针对性的分离、 筛选出肠道益生菌， 通过在模拟肠道环境下比较益生菌的活 菌数变化， 筛选出最佳的菌株， 将各类低聚糖含量进行测定， 选择出最佳添加量， 将适合兔 胃、 肠道的益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。 0041 进一步， 兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括： 0042 步骤一、 从兔的养殖场内的土壤、 喂养饲料槽、 胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌 (粪链球菌)、 枯草芽孢杆菌和双歧杆菌， 将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能及安全 性的鉴定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选益生菌； 0043 步骤二、 利用兔。

26、肠道微生物与糖代谢、 维生素的关系， 筛选出具有能提高能量的获 取和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌， 利用益生菌在兔肠道中的提高 能量的获取和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力， 根据微生物技术指标筛选优质兔肠 道益生菌； 0044 步骤三、 在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌， 测定各类益生菌 说 明 书 4/9 页 6 CN 106509455 A 6 的活菌数， 繁殖代数， 进行更进一步的筛选， 最终选取得到1株粪肠球菌(粪链球菌)、 1株枯 草芽孢杆菌和1株双歧杆菌； 0045 步骤四、 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程 。

27、度选择由低聚糖组成的益生元， 得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果寡 糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 0046 步骤五、 向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1-0.5加入由3份重量的乳 酸、 1份重量的柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂； 质量比0.1-0.5 0047 进一步， 步骤一中进行菌种的鉴定包括： 0048 常规鉴定： 芽孢杆菌繁殖快速， 四小时增殖10万倍， 生命力强无湿状态可耐低温 60、 耐高温+280， 耐强酸、 耐强碱、 抗菌消毒、 耐高氧(嗜氧繁殖)、 耐低氧(厌氧繁殖)。 体 积比。

28、一般病原菌分子大四倍数， 占据空间优势， 抑制有害菌的生长繁殖。 粪肠球菌为圆形或 椭圆形、 呈单个或成对或短链状排列的革兰阳性球菌， 无芽胞， 无鞭毛， 为需氧或兼性厌氧 菌。 本菌对营养要求较高， 要求高盐(6.5NaCl),高碱(pH9.6),40胆汁培养基和10-45 环境下生长。 0049 将双歧杆菌、 芽孢杆菌和肠球菌益生菌和选择出的益生元有机结合起来， 再加入 有利于益生菌生长的营养物质， 制成复合型合生元微生态制剂。 0050 营养物质： 由于兔属于哺乳类动物， 所用稀释生理盐水与哺乳类、 两栖动物略有区 别， 一般NaCl浓度为0.9， 蛋白胨1-100g/kg、 牛肉膏2-。

29、8g/kg、 蔗糖1-50g/kg、 酵母粉1- 20g/kg、 碘酸钾1-3g/kg、 磷酸二氢钠0.5-2.5g/kg、 硫酸镁0.1-1g/kg、 复合维生素0.01- 10g/kg,、 复合氨基酸0.01-10g/kg。 0051 为能进一步了解本发明的发明内容、 特点及功效， 兹例举以下实施例， 并配合附图 详细说明如下： 0052 请参阅图1： 0053 一种兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法， 首先分别在不同的环境下筛选出 肠道益生菌， 通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比较， 并且在模拟肠道环境 下比较益生菌的活菌数变化， 筛选出最佳的菌株， 将各类低聚糖含量进行测定。

30、， 选择出最佳 添加量， 将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。 0054 进一步， 兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括： 0055 S101、 从兔的养殖场内的土壤、 喂养饲料槽、 胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌(粪 链球菌)、 枯草芽孢杆菌和双歧杆菌， 将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能及安全性 的鉴定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选益生菌； 0056 S102、 利用兔肠道微生物与糖代谢、 维生素的关系， 筛选出具有能提高能量的获取 和储存、 提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌， 利用益生菌在兔肠道中的提高能 量的获取和储存、 提高兔从日粮中获取能。

31、量的能力， 根据微生物技术指标筛选优质兔肠道 益生菌； 0057 S103、 在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌， 测定各类益生菌的 活菌数， 繁殖代数， 进行更进一步的筛选， 最终选取得到1株粪肠球菌(粪链球菌)、 1株枯草 芽孢杆菌和1株双歧杆菌； 0058 S104、 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度 说 明 书 5/9 页 7 CN 106509455 A 7 选择由低聚糖组成的益生元， 得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果寡糖 0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg； 0。

32、059 S105、 向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1-0.5加入由1份重量的乳 酸、 3份重量的柠檬酸、 1份延胡索酸组成的复合酸化剂； 0060 S106、 将添加复合酸化剂后的3株益生菌与质量比5的益生元进行结合， 配制出 兔用复合型合生元微生态制剂。 0061 实施例1： 从养殖场附近的土壤初步筛选芽孢杆菌类益生菌。 0062 第一步： 含芽孢杆菌土壤样品的采集。 选择大型养殖场附近的土壤为采集目的地， 随机选择3-5个小区， 每个小区取20-50g原始土壤， 装入已灭菌的自封袋中， 带回实验室置 于4冰箱中保存备用； 0063 第二步： 芽孢杆菌的分离。 在无菌条件下， 在土壤。

33、样品加入到富集培养液， 形成菌 落， 再将菌种接种到加入无菌生理盐水制成菌悬液， 再用10序列递减法稀释成不同的浓度 梯度， 将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数， 每个稀释度做3个平行， 由此制成的平板 放入保温箱中培养24-72h； 0064 第三步： 芽孢杆菌的分离纯化。 在无菌条件下， 将经过鉴别后的益生菌用接种环接 种于无菌生理盐水中， 制成菌悬液， 再接种于平板上， 培养后观察， 循环操作， 直到获得纯菌 落， 斜面接种保存备用； 0065 第四步： 芽孢杆菌的鉴别。 将分离纯化后的芽孢杆菌进行形态观察， 生理生化特性 测定和16S rDNA序列测定等方法， 分别对不同的菌落进行鉴。

34、定， 达到对其知类辨名的目的。 0066 实施例2： 从动物肠道中初步筛选双歧杆菌益生菌。 0067 第一步： 含益生菌样品的采集。 选择各个大型屠宰场为样品采集目的地， 随机切取 不同健康现杀动物的肠道组织， 装入已灭菌的自封袋中， 并快速带回实验室置于4冰箱中 保存备用； 0068 第二步： 益生菌的富集、 分离。 在无菌条件下， 将肠道组织样品内表面物质加入到 富集培养液中培养， 形成菌落， 再将菌种接种到加入无菌生理盐水制成菌悬液， 再用10序列 递减法稀释成不同的浓度梯度， 将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数， 每个稀释度做3 个平行， 由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；。

35、 0069 第三步： 益生菌的分离纯化。 在无菌条件下， 将经过鉴别后的益生菌用接种环接种 于无菌生理盐水中， 制成菌悬液， 再接种于平板上， 培养后观察， 循环操作， 直到获得纯菌 落， 斜面接种保存备用； 0070 第四步： 益生菌的鉴别。 将分离纯化后的乳杆菌进行形态观察， 生理生化特性测定 和16S rDNA序列测定的等方法， 分别对不同的菌落进行鉴定， 达到对其知类辨名的目的。 0071 实施例3： 从兔肠道或者粪便中初步筛选粪肠球菌(粪链球菌)。 0072 第一步： 兔肠道样品的采集。 选择大型商品兔养殖场为采集目的地， 选择用新鲜宰 杀兔肠衣(各段)作为样品约50g， 装入已灭菌。

36、的自封袋中， 带回实验室置于4冰箱中保存 备用； 0073 第二步： 粪肠球菌的富集、 初步分离。 在无菌条件下， 在兔肠衣样品中加入到富集 培养液中， 形成菌落， 再将菌种接种到无菌生理盐水制成菌悬液， 再用10序列递减法稀释成 不同的浓度梯度， 将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数， 每个稀释度做3个平行， 由此 说 明 书 6/9 页 8 CN 106509455 A 8 制成的平板放入保温箱中培养24-72h； 0074 第三步： 粪肠球菌的分离纯化。 在无菌条件下， 将经过鉴别后的粪肠球菌用接种环 接种于无菌生理盐水中， 制成菌悬液， 再接种于平板上， 培养后观察， 循环操作， 直到。

37、获得纯 种粪肠球菌形成的菌落， 斜面接种保存备用； 0075 第四步： 粪肠球菌的鉴别。 将分离纯化后的粪肠球菌进行形态观察， 生理生化特性 测定和16S rDNA序列测定的等方法， 分别对不同的菌落进行鉴定， 达到对其知类辨名的目 的。 0076 实施例4： 复合型合生元微生态制剂的制备。 0077 第一步： 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程 度选择由低聚糖和酸化剂组成的益生元， 可选择的低聚糖为寡甘露糖， 果寡糖,低聚异麦芽 糖,乳寡糖等， 酸化剂使用由乳酸、 柠檬酸、 延胡索酸等物质组成的复合酸化剂 0078 第二步： 测试各类低聚糖的添加量， 各类低聚糖。

38、的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、 果 寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5-3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。 添加由乳酸、 柠檬酸、 延胡索酸 等物质组成的复合酸化剂0.1-0.5； 0079 第三步： 将三种益生菌和选择出的益生元有机结合起来， 再加入有利于益生菌生 长的营养物质， 制成复合型合生元微生态制剂； 0080 第四步： 最后制成的产品添加到动物食用料中进行动物实验， 根据实验动物的增 重量、 饲料消耗量和料肉比等来判断实验动物的生产性能情况。 0081 下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。 0082 步骤一、 从养兔场内的土壤、 喂养兔的饲料槽、。

39、 胃肠道区域分离筛选出双歧杆菌、 芽孢杆菌和粪肠球菌益生菌， 将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能以及安全性的鉴 定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选益生菌； 0083 步骤二、 利用兔肠道微生物与糖代谢、 维生素的关系， 筛选出提高兔从日粮中获取 能量的优质益生菌， 利用优质益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、 提高兔从日粮 中获取能量的能力， 再根据微生物技术指标(现有技术:1.在选择性培养基上分离益生菌, 然后对所选的每株细菌逐一进行耐酸、 耐胆盐、 耐消化酶等的生理特性检测,最后进行益生 菌其他特性实验。 2.先在动物消化道内取少量内容物,并进行稀释,于厌氧状态下,在MRS。

40、培 养基中进行富集培养， 获得可作为益生菌种的细菌， 然后再通过梯度培养， 逐渐增加培养基 的酸度(pH为3.0左右)及胆汁盐浓度， 选出具有耐酸和耐胆汁特性的菌株， 再根据益生菌特 性的要求， 在培养基中添加其他的抑制剂或病原菌， 筛选出长势良好并能抑杀病原菌的菌 株， 最后再对该菌株进行革兰氏染色、 触酶等形态和生化鉴定， 并确定其种属。 )筛选优质兔 肠道益生菌； 3.筛选及测定将分离得到的益生菌进行生物学特性、 功能的比较以及安全性 的鉴定， 并进行体外益生效果评价， 初步筛选优质益生菌； 1)双歧杆菌(以从动物胃肠道筛 选为例)： 分别取胃 十二指肠 肥肠 空肠 盲肠内容物一定量溶于。

41、100mL改良MRS培养基， 富 集培养24h,取1mL梯度稀释， 涂布于平板上， 在厌氧条件下培养48h， 用接种环挑取蓝色菌落 纯化3次， 得到双歧杆菌， 挑取严格厌氧的菌株进行革兰氏染色， 镜检观察菌体颜色 大小 形状等是否符合双歧杆菌属的基本特征。 2)枯草芽孢杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)分别 取胃 十二指肠 肥肠 空肠 盲肠内容物一定量于50mL厌氧稀释液中 搅拌 作10倍系列稀 释， 分别取3个稀释度各0.1mL涂布LBS平板， 37培养48h-72h,用接种环挑取疑是菌落， 先 说 明 书 7/9 页 9 CN 106509455 A 9 进行复红简单染色观察， 再进行革兰氏染。

42、色和芽孢染色， 挑取芽孢杆菌菌落进行纯培养， 并 于斜面保存， 再进行过氧化氢酶测定， 即将各分离株接种于LB固体培养基斜面上， 37培养 18h-24h， 取一干净载玻片， 在上面滴一滴10的H2O2,挑取一环培养好的菌苔， 在H2O2中涂 抹， 若有气泡， 则为阳性， 反之为阴性。 3)粪肠球菌(以养殖场附近的土壤为例)： 0084 (1)土壤的采集处理 0085 采用五点取样法从养殖场附近的土壤中取样。 由于土壤中的微生物一般在5-25cm 的土层里， 所以先用灭菌铲除去土壤的表皮， 然后采取土壤200-300g， 至于无菌塑料袋内， 并标明采取地点、 日期。 将其运回实验室后至于冰箱中。

43、保存， 备用。 0086 (2)土壤中菌种的分离 0087 将采回的样品用四分法获取样品20-30g， 将其置于研钵中研磨均匀。 称取1g土壤， 置于液体培养基灭菌葡萄汁， 经28， 12h， 180rpm摇床富集培养。 取1mL富集培养液， 分别进 行五个梯度稀释(1:1000、 1:5000、 1:10000、 1:50000、 1:100000)， 再用移液枪分别从每一稀 释度各取0.1mL稀释液， 注入平板上， 利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面(注意不能 使培养基表面破裂)， 将培养皿盖好， 再把培养皿倒置， 于适宜温度(一般为25或28)的 恒温箱中培养， 每个梯度做三个重复。 。

44、观察培养基， 直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为 了在筛选过程中排除细菌的干扰， 在培养基中加30ug/mL的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态， 然后在显微观察记录细胞大小、 形态， 进行分析和初步的归 类。 0088 步骤三、 在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的兔肠道益生菌， 测定各类 益生菌的活菌数， 繁殖代数， 进行更进一步的筛选， 筛选最佳的菌株； 1.鉴定： 双歧杆菌为革 兰氏阳性的无芽孢杆菌， 长短不等， 典型的双歧杆菌有V字型或Y字型， 排列呈单、 双、 短链、 X、 Y、 V或栅状。 芽孢杆菌存在两种形态： 芽孢和营养体。 营养体的细胞基本形。

45、态有杆状和椭 圆状。 杆状中有长杆状、 短杆状， 椭圆状有长椭圆和短椭圆。 粪肠球菌是单细胞真核微生物， 肠球菌细胞的形态通常有球形、 卵圆形、 腊肠形、 椭圆形、 柠檬形或藕节形等。 比细菌的单细 胞个体要大得多， 一般为1-5微米5-30微米， 肠球菌无鞭毛， 不能游动。 2.比较： 根据比较 不同益生菌的形态特征， 从而鉴定各益生菌。 0089 步骤四： 根据益生菌的种类、 各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程 度选择由各类低聚糖和组成的益生元， 选择出各类低聚糖最佳添加量； 0090 步骤五、 对步骤三筛选株益生菌与步骤四选择出的益生元， 混合制成兔用复合型 合生元微生态制剂。。

46、 添加由乳酸、 柠檬酸、 延胡索酸物质组成的复合酸化剂0.1-0.5。 在 最佳酸化剂添加量下:1.动物的消化道环境能得到改善， 从而改善动物的健康状况和生长 性能。 2.提高胃肠道的酸度， 从而提高胃蛋白酶的活性。 3.改善胃肠道内微生物区系， 抑制 有害微生物的繁殖4.促进动物体对矿物质元素和维生素的吸收5.促进有益菌的增殖， 能够 替代某些抗生素的功能) 0091 进一步， 步骤三筛选最佳的菌株中优选： 1株肠球菌、 1株枯草芽孢杆菌、 和1株双歧 杆菌。 1.提高兔饲料转化率,促进肉兔生长； 2.产生营养物质,并可以调节动物体内酶的活 性； 3.增强商品兔的免疫功能4.提高兔的成活率5。

47、.提高肉兔的日增重等6， 增强动物的非特 异性免疫功能。 0092 进一步， 步骤四中各类低聚糖为： 木寡糖、 果寡糖， 乳寡糖， L-阿拉伯糖； 说 明 书 8/9 页 10 CN 106509455 A 10 0093 各类低聚糖最佳添加量优选木寡糖0.05-5g/kg、 果寡糖0.02-2g/kg， 乳寡糖0.5- 3g/kg， L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。 1.能促使机体生成多种营养物质， 包括维生素B1、 B2、 B6、 B12、 烟酸和叶酸； 2.对肠道中双岐杆菌、 粪链球菌、 枯草芽孢杆菌等分别有选择性增殖作 用， 使有益菌群在肠道中占有优势， 抑制有害菌的生长， 减少有毒物。

48、质(如内毒素、 氨类等) 的形成， 并且对肠粘膜细胞和肝具有保护作用， 从而防止病变肠癌的发生， 增强机体免疫 力； 3.对有害菌的抑制作用。 0094 本发明的兔用复合型合生元微生态制剂能避免单独使用益生菌产品的弱点， 相辅 相成， 扬长避短， 促进了外源性益生菌在兔肠道的定植， 并且选择性刺激多种益生菌的生长 和繁殖， 从而达到促进动物健康的目的， 减少了动物食用抗生素对兔肉质的影响， 更加健康 安全， 无公害， 不仅可以促进动物生长， 还能提高饲料的转化率、 增加肉类品质和提高食品 的安全质量， 根据各类益生菌选择出合适的益生元， 解决了由传统的抗生素而带来的药物 残留、 产生抗药性、 动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问 题。 0095 以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式上的限制， 凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改， 等同变化与修饰， 均属于 本发明技术方案的范围内。 说 明 书 9/9 页 11 CN 106509455 A 11 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 12 CN 106509455 A 12 。