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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610129710.3 (22)申请日 2016.03.09 GDMCC No.60002 2016.01.18 A23K 10/18(2016.01) A23K 20/189(2016.01) (71)申请人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区海大路 1 号 (72)发明人 刘唤明 洪鹏志 刘艳芬 雷晓凌 (54) 发明名称 一种发酵豆粕的制备方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 发 酵 豆 粕 的 制 备 方 法， 包括以下主要步骤 ： 将产蛋白酶的耐高温 兼性厌氧菌甲基营养型芽孢杆菌 （Bac。
2、illus methylotrophicus） HL-4 进行培养得到微生物 菌剂备用 ； 将豆粕粉碎后添加营养物和水， 混匀 得到发酵培养基 ； 往发酵培养基中加入Bacillus methylotrophicus菌剂和酶， 并混匀进行建堆发 酵 ； 发酵采取自然静置方式， 发酵时间为 48h 72h ； 发酵后的产物经干燥、 粉碎和包装后制备成 一种发酵豆粕成品。本发明制备的发酵豆粕可用 于饲料工业中大幅度替代进口优质鱼粉， 明显降 低饲料成本， 有良好的应用前景和现实意义。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
3、书2页 说明书3页 CN 105685479 A 2016.06.22 CN 105685479 A 1.一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 该制备方法包括如下步骤： （1） 将斜面保藏的产蛋白酶的耐高温兼性厌氧菌甲基营养型芽孢杆菌 （Bacillus methylotrophicus） 接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中， 于55 、 150r/min培养12h， 制 备成Bacillus methylotrophicusHL-4种子液备用； （2） 将麸皮和水按质量比为1： 1的比例混合， 并混匀制备成麸皮培养基， 麸皮培养基于 121灭菌30min后备用； （3） 将步骤 （1） 制。
4、备的Bacillus methylotrophicusHL-4种子液接入到步骤 （2） 得到的 灭菌后冷却的麸皮培养基中并混匀， 然后将接入菌种的麸皮培养基分装在已消毒的发酵浅 盘中， 装料厚度为4cm， 浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌的湿纱布， 再将浅盘置于已灭菌的 固体发酵房内的搁架上发酵， 控制环境温度在55， 发酵时间为48h， 发酵结束后的发酵产 物经干燥和粉碎后制备成Bacillus methylotrophicus菌剂备用； （4） 将豆粕粉碎后过60目筛备用； （5） 往步骤 （4） 粉碎的豆粕中添加营养物和水， 混匀得到含水量为40%85%范围内的发 酵培养基； （6） 往步骤。
5、 （5） 制备到的发酵培养基中添加酶和步骤 （3） 制备的 Bacillus methylotrophicus菌剂， 并混匀； （7） 将步骤 （6） 得到的加入酶和菌剂的发酵培养基堆积在一起， 物料的厚度控制在50cm 150cm， 并将建堆的发酵物料用塑料薄膜盖上密封好， 静置发酵48 h72h； （8） 成品处理： 将发酵结束后获得的产物经干燥、 粉碎和包装后， 即制得了一种发酵豆 粕成品。 2.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中所用 的产蛋白酶的耐高温兼性厌氧菌Bacillus methylotrophicus HL-4在广东省微生物菌种 。
6、保藏中心的保藏编号为GDMCC No： 60002。 3.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （3） 中所用 的Bacillus methylotrophicus HL-4种子液的接种量以接入种子液的质量占麸皮培养基 总质量百分比计， 为0.1%5%。 4.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （5） 中所用 的营养物为玉米粉、 氯化钙、 氯化锌、 氯化亚铁和磷酸氢二钾组成的混合物。 5.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （5） 中所用 的营养物的添加量以加入营养物的质量占发酵培养基总质量的百。
7、分比计， 分别为： 玉米粉 0.01%5%， 氯化钙0.01%5%， 氯化锌0.01%5%， 氯化亚铁0.01%5%， 磷酸氢二钾0.01% 5%。 6.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （6） 中所用 的酶为纤维素酶、 木聚糖酶、 -葡聚糖酶、 -甘露聚糖酶和蛋白酶。 7.根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （6） 中酶的 加入量以添加的酶的质量占发酵培养基总质量百分比计， 分别为： 纤维素酶0.01%2%， 木 聚糖酶0.01%2%， -葡聚糖酶0.01%2%， -甘露聚糖酶0.01%2%， 蛋白酶0.01%2%。 8.。
8、根据权利要求1所述的一种发酵豆粕的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （6） 中 Bacillus methylotrophicus菌剂的加入量以添加的菌剂的质量占发酵培养基总质量百分 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105685479 A 2 比计， 为 0.1%8%。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105685479 A 3 一种发酵豆粕的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种发酵豆粕的制备方法， 属于发酵工程的技术领域。 背景技术 0002 发酵豆粕是以优质豆粕为主要原料， 在微生物菌种发酵下， 利用微生物产生的蛋 白酶， 不但可以将豆粕中的抗原蛋白降解， 而。
9、且还通过富含小肽而提高制备饲料蛋白的消 化和吸收性能。 近年来， 发酵豆粕作为一种鱼粉替代蛋白在我国饲料工业得到了广泛的应 用。 0003 目前， 发酵豆粕主要采用多菌种混合发酵技术来制备。 专利ZL 200310111688 “一 种发酵法去除豆粕中抗营养因子的方法” 公开了一种采用芽孢杆菌、 酵母菌和乳酸菌的多 菌种混合发酵的发酵豆粕技术。产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、 酶学性质及发酵豆粕应用 探究（食品科学， 2014年第9期） 公开了一种采用兼性厌氧菌的发酵豆粕技术。 0004 现有的用于豆粕发酵的主要菌种为常温的枯草芽孢杆菌。 该菌是一种好氧菌， 在 饲料蛋白这种大规模的固态深层发酵中。
10、， 供养严重不足， 需要不断间隔通气； 并且发酵是一 种放热反应， 发酵过程中的物料温度不断升高， 会抑制发酵的继续进行， 因而也要需要不断 翻动降温。 虽然， 现有技术中有采用兼性厌氧菌的发酵豆粕技术， 但是发酵是一种放热反 应， 发酵过程中的物料温度不断升高， 会抑制发酵的继续进行， 因而还是需要不断翻动降 温。 总之， 现有的发酵豆粕制备技术中都需在发酵过程不断翻动， 这既增加了能耗， 又增加 了劳动力成本。 发明内容 0005 针对现有豆粕发酵技术所存在的问题， 本发明提供了一种发酵豆粕的制备方法。 本发明的主要目的提供一种不用翻动的制备发酵豆粕的方法。 0006 为了解决上述问题， 。
11、本发明所采用的技术方案如下： 一种发酵豆粕的制备方法， 包 括如下步骤： （1） 将斜面保藏的产蛋白酶的耐高温兼性厌氧菌甲基营养型芽孢杆菌 （Bacillus methylotrophicus） 接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中， 于55 、 150r/min培养12h， 制 备成Bacillus methylotrophicusHL-4种子液备用； （2） 将麸皮和水按质量比为1： 1的比例混合， 并混匀制备成麸皮培养基， 麸皮培养基于 121灭菌30min后备用； （3） 将步骤 （1） 制备的Bacillus methylotrophicusHL-4种子液接入到步骤 （2） 得到的 灭。
12、菌后冷却的麸皮培养基中并混匀， 然后将接入菌种的麸皮培养基分装在已消毒的发酵浅 盘中， 装料厚度为4cm， 浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌的湿纱布， 再将浅盘置于已灭菌的 固体发酵房内的搁架上发酵， 控制环境温度在55， 发酵时间为48h， 发酵结束后的发酵产 物经干燥和粉碎后制备成Bacillus methylotrophicus菌剂备用； （4） 将豆粕粉碎后过60目筛备用； 说 明 书 1/3 页 4 CN 105685479 A 4 （5） 往步骤 （4） 粉碎的豆粕中添加营养物和水， 混匀得到含水量为40%85%范围内的发 酵培养基； （6） 往步骤 （5） 制备到的发酵培养基中添加酶。
13、和步骤 （3） 制备的Bacillus methylotrophicus菌剂， 并混匀； （7） 将步骤 （6） 得到的加入酶和菌剂的发酵培养基堆积在一起， 物料的厚度控制在50cm 150cm， 并将建堆的发酵物料用塑料薄膜盖上密封好， 静置发酵48 h72h； （8） 成品处理： 将发酵结束后获得的产物经干燥、 粉碎和包装后， 即制得了一种发酵豆 粕成品。 0007 所述步骤 （1） 中所用的产蛋白酶的耐高温兼性厌氧菌甲基营养型芽孢杆菌 （Bacillus methylotrophicus） HL-4已于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中 心， 保藏编号为GDMCC No： 。
14、60002， 保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省 微生物研究所。 0008 所述步骤 （3） 中所用的Bacillus methylotrophicus HL-4种子液的接种量以接入 种子液的质量占麸皮培养基总质量百分比计， 为0.1%5%。 0009 所述步骤 （5） 中所用的营养物为玉米粉、 氯化钙、 氯化锌、 氯化亚铁和磷酸氢二钾 组成的混合物。 所述步骤 （5） 中所用的营养物的添加量以加入营养物的质量占发酵培养基 总质量的百分比计， 分别为： 玉米粉0.01%5%， 氯化钙0.01%5%， 氯化锌0.01%5%， 氯化 亚铁0.01%5%， 磷酸氢二钾0.01%5。
15、%。 0010 所述步骤 （6） 中所用的酶为纤维素酶、 木聚糖酶、 -葡聚糖酶、 -甘露聚糖酶和蛋 白酶。 所述步骤 （6） 中酶的加入量以添加的酶的质量占发酵培养基总质量百分比计， 分别 为： 纤维素酶0.01%2%， 木聚糖酶0.01%2%， -葡聚糖酶0.01%2%， -甘露聚糖酶0.01% 2%， 蛋白酶0.01%2%。 0011 所述步骤 （6） 中Bacillus methylotrophicus菌剂的加入量以添加的菌剂的质量 占发酵培养基总质量百分比计， 为 0.1%8%。 0012 与现有技术相比， 本发明具有以下优点和特点。 0013 （1） 生产过程不需翻动， 降低生产成。
16、本。 本发明采用的是耐高温兼性厌氧菌 Bacillus methylotrophicus HL-4作为发酵菌种， 该菌有比较宽的发酵温度， 在15 75 之内都可发酵， 最佳发酵温度为5055。 该菌种是一种兼性厌氧菌， 因而可以进行大 规模的深层发酵； 另外该菌是耐高温菌种， 其最佳发酵温度为5055， 故固态发酵过程 的产热升温反而有利于菌种的发酵， 因而发酵过程不用降温， 采取直接的静置发酵。 综上所 述， 本发明通过耐高温的兼性厌氧菌来发酵， 可以直接采取静置的自然发酵方式， 生产成本 大大降低。 0014 （2） 发酵效果显著提高。 现有豆粕的发酵主要采用枯草芽孢杆菌这种好氧菌， 而。
17、豆 粕的发酵是一种固态深层发酵， 其供氧能力很差， 因而， 采用枯草芽孢杆菌这样好氧菌进行 饲料蛋白发酵效果不佳。 而本发明采用耐高温兼性厌氧菌进行发酵， 在供氧很差的情况下 也有很好的发酵效果。 再加上本发明采用的是高温发酵， 在高温下酶的活性显著增强， 从而 进一步提高发酵效果。 0015 本发明提供了一种发酵豆粕的制备方法。 本发明得到的发酵豆粕在华南地区的对 虾、 猪和罗非鱼等动物的养殖试验表明， 用本发明制备的发酵豆粕可替代部分优质进口鱼 说 明 书 2/3 页 5 CN 105685479 A 5 粉， 明显降低饲料成本， 取得显著的经济效益 。 具体实施方式 0016 为了更好地。
18、理解本发明， 下面就发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明 作进一步描述， 但本发明的保护范围不限于此。 0017 实施例1： 将斜面保藏的产蛋白酶耐高温兼性厌氧菌Bacillus methylotrophicus HL-4接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中， 于55 、 150r/min培养12h， 制备成Bacillus methylotrophicus HL-4种子液备用； 将麸皮和水按质量比为1： 1的比例混合， 并混匀制备 成麸皮 培养基 ， 麸皮 培养基于1 21 灭 菌30m in 后备 用 ； 将 制备的 Ba cill us methylotrophicus HL-4种子。
19、液接入到灭菌后冷却的麸皮培养基中并混匀， 然后将接入菌 种的麸皮培养基分装在已消毒的发酵浅盘中， 装料厚度为4cm， 浅盘中发酵培养基表面覆盖 灭菌的湿纱布， 再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵， 控制环境温度在55， 发 酵 时 间 为 4 8 h ， 发 酵 结 束 后的 发 酵 产 物 经 干 燥 和粉 碎 后 制备 成 Ba c i l l u s methylotrophicus菌剂备用。 将豆粕粉碎后过60目筛备用； 将 1吨豆粕、 20公斤玉米粉、 1公 斤氯化钙、 1公斤氯化锌、 1.8公斤氯化亚铁、 2公斤磷酸氢二钾和800斤水进行混匀， 得到发 酵培养基； 往发酵培养基中加入1公斤维素酶、 1公斤木聚糖酶、 1公斤 -葡聚糖酶、 1公斤 - 甘露聚糖酶、 1公斤蛋白酶和5公斤Bacillus methylotrophicus菌剂， 并混匀； 加入菌种和 酶的发酵培养基进行建堆， 建堆的物料厚度为120cm， 并将建堆的发酵物料用塑料薄膜盖上 密封好， 静置发酵55h； 发酵结束后， 将发酵产物经干燥和粉碎后即可制备成一种发酵豆粕 成品。 说 明 书 3/3 页 6 CN 105685479 A 6 。