技术领域
本发明属于水果病害防治和保鲜领域，具体涉及一种具有抑制柑橘采后病原菌作用的五指毛桃提取物及其制备方法和新用途。
背景技术
柑橘是世界第一大贸易水果，也是第三大贸易农产品。我国柑橘资源丰富、种植历史悠久。目前我国柑橘的种植面积和产量均居世界第一位，2013年柑橘种植面积达3600多万亩，总产量约为3200多万吨，柑橘产业在我国农业经济中占有非常重要的地位。
柑橘果实组织细嫩多汁且富含糖分，在采摘、贮运和销售等过程中容易发生机械损伤，果皮损伤后易受多种病原真菌的侵染而产生采后病害。柑橘采后发生的病理性病害种类多达20余种，主要有意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病，这些病害易造成果实腐烂变质，腐烂率一般为10％～30％，严重时可高达40％～50％以上，造成巨大的经济损失。柑橘其它的病理性病害还包括黑腐病、酸腐病、褐腐病、褐色帝腐病、炭疽病和焦腐病等。
长期以来，人们主要采用化学合成物质作为保鲜剂对柑橘进行保鲜，不同时期使用的化学杀菌剂有所不同。硼砂、山梨酸及其盐类等是最早使用的柑橘防腐剂；包括苯菌灵(Benomyl)、托布津(Thiophanate)、甲基托布津(Thiophanate methyl)、多菌灵(Carbendazim)、噻菌灵(Thiabendazole)等的苯并咪唑类杀菌剂是70年代应用的第二代柑橘防腐剂；目前使用的第三代柑橘防腐剂包括抑霉唑(Imazalil)、双胍盐(Guazatine)、咪鲜胺(Prochloraz)等。这些化学杀菌剂能杀死或抑制病原微生物的生长，有较好的防腐保鲜效果。由于化学杀菌剂会造成药剂残留、污染环境，以及长期使用导致柑橘采后病菌产生抗药性等原因使得化学杀菌剂的使用安全性日益得到人们的关注。另外，随着科技的发展、检测分析手段的完善和化学杀菌剂毒理的深入研究，发现一些化学防腐剂有致癌或潜在致癌、致突变、致畸的可能性。目前一些化学杀菌剂已被欧美等发达国家禁止或限制使用，如苯菌灵和双胍盐类杀菌剂等己被美国环保局明令禁止使用或在部分果实产品上限制使用。
近年来，人们开始转向天然植物源保鲜剂的研发。天然植物源保鲜剂具有高效、低毒、低残留、无污染、使用安全等优点，采用其处理柑橘进行防腐保鲜将受到消费者的普遍欢迎。另外，植物源药剂是通过多成分，多靶点发挥抑菌作用，不易产生抗药性。因此，有必要从天然植物中寻找、开发天然植物源防腐剂对柑橘进行保鲜以减少对化学药剂的依赖。
五指毛桃(Ficus simplicissima Lour.)为桑科无花果属植物裂掌榕的根，收载于历年《中国药典》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《中药志》、《中华本草》等多种中药学书籍中。五指毛桃是广东岭南地区的道地中药材，又名五爪龙、亚桠木、五爪毛桃、五爪牛奶、土黄芪、南芪等，具有很好的益气健脾功效，有“广东人参”之美誉。五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾补肺、利湿舒筋之功，可用于脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、盗汗、风湿痹痛、产后无乳等症，在广东民间使用历史悠久。现代药理活性研究表明，五指毛桃可以通过改善微循环对胃黏膜发挥保护作用，减轻肝组织损伤，提高机体免疫功能，减轻脑缺血缺氧的损害(王伟伟，陈瑶；五指毛桃的化学成分和药理作用研究进展；《中国民族民间医药》，2013，22(3)：41-42)。关于五指毛桃使用的安全性，有动物急性毒性实验研究表明小鼠灌服五指毛桃水提物后14d内，动物均无死亡，眼、鼻、口无黏液性分泌物，体重、饮水量及进食量与空白对照组无显著差异，各脏器均无异常。表明五指毛桃毒性极低，生物安全性好(罗骞，席萍，廖雪珍，蔡庆群招荣鉴；五指毛桃水煎液的药理安全性实验研究；《今日药学》，2009，19(2):12-13)。
多篇专利文献也公开了五指毛桃的医药用途。如，发明名称“五指毛桃在制备抗肿瘤药物中的应用”(公开号CN103156922A)的中国发明专利申请，公开了五指毛桃的提取物具有体外抗人乳腺癌细胞株Bcap-37的作用，并能在体内及体外诱生肿瘤坏死因子(TNF)，具有抗肿瘤的作用。发明名称“一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途”(公开号CN101129473A)的中国发明专利申请，公开了五指毛桃提取物在制备急慢性支气管炎、哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病药物、免疫力低下疾病药物、病毒性肝炎、慢性乙型肝炎等药物中的应用。发明名称“五指毛桃在制备肝炎的辅助治疗药物和保健食品中的用途”(公开号CN1660354A)的中国发明专利申请，公开了以五指毛桃提取物为活性成分的药物或保健食品可有效地治疗扑热息痛中毒性肝炎、四氯化碳中毒性肝炎和可卡因中毒性肝炎。
经文献检索，关于五指毛桃的抗菌活性研究，仅见五指毛桃水煎煮提取液对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用(陈琼,叶思霞；微量显色法测定五指毛桃抑菌活性，《安徽农业科学》,2012,(15):8452-8454)，但对黑曲霉、黄曲霉没有抑制作用(王晓平，段丽菊，陈晓白，李丽梅，陆奇丰，李鉴清；五指毛桃水提液体外抗菌作用的实验研究，《时针国医国药》，2010，21(7):1692-1693)。
另外，公开号CN101138585A的中国发明专利申请公开了一种超临界二氧化碳萃取五指毛桃有效成分的方法。该方法存在仪器设备价格昂贵，仅适用于亲脂性、分子量较小物质的萃取。
可见现有技术对五指毛桃的研究主要局限在以人为施用对象的医药用途。迄今，尚未见五指毛桃提取物对柑橘采后病原真菌作用的报道，也没有关于超声波辅助提取制备五指毛桃提取物的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种五指毛桃提取物的制备方法及其制备的五指毛桃提取物新用途。本发明以天然的中草药植物为原料，制备的五指毛桃提取物对柑橘采后病原真菌的抑菌效果明显且无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，预示着很好的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种五指毛桃提取物的制备方法，采用超声波辅助提取，以乙醇为提取溶剂，包括如下步骤：
所述五指毛桃中加入五指毛桃重量10～40倍的质量百分比浓度为60％～100％的乙醇，在提取温度为40～60℃，提取时间为30min～150min，超声频率为30～40KHz的条件下提取；过滤，回收乙醇，浓缩，即得。
在本发明所述制备方法中，优选的，乙醇的重量为所述五指毛桃重量的20～40倍；更优选为30倍。
优选的，乙醇的质量百分比浓度优选为90％～100％；更优选为90％。
优选的，超声波辅助提取时间优选为30～90min，更优选为60min。
优选的，超声波辅助提取的温度为60℃。
还优选的，乙醇提取前，所述五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末进行超声波辅助提取。
作为一个优选的具体实施方式，本发明提供一种五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：
I.将五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量20～40倍的质量百分比浓度为90％～100％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃～60℃，提取时间为60min～90min，超声频率为30～40KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。
作为一个更优选的具体实施方式，本发明提供一种五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：
I.将五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量30倍的质量百分比浓度为90％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为60℃，提取时间为60min，超声频率为30～40KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。
本发明的另一个目的，在于提供上述制备方法制备得到的五指毛桃提取物。
本发明还有一个目的，在于提供五指毛桃或五指毛桃提取物在制备用于防治柑橘采后病原菌的药物组合物和/或柑橘采后保鲜剂中的用途；优选的，所述五指毛桃提取物通过本发明所述制备方法制备得到。
所述柑橘采后病原菌选自意大利青霉(Penicillium italicum)，指状青霉(Penicillium digitatum)，柑橘酸腐病菌(Geotrichum candidum)和柑橘黑腐病菌(Alternaria citri)中的一种或几种。
由此，本发明提供一种防治柑橘采后病原菌的药物组合物，包括本发明所述制备方法制备得到的五指毛桃提取物。
另外，本发明还提供一种柑橘采后保鲜剂，包括本发明所述制备方法制备得到的所述五指毛桃提取物。
本发明所述的药物组合物或柑橘采后保鲜剂，除所述五指毛桃提取物外，还可以包括可以接受的辅料，例如选自羧甲基纤维素、壳聚糖等成膜剂，选自甘油、蔗糖酯、吐温等的助溶剂，选自柠檬酸、丙酸钙、山梨酸钾或苯甲酸钠等的防腐剂，以及适当的溶剂，如水。
超声波具有“空化效应”，“机械振动”以及“热效应”等特性，“空化效应”可瞬间产生几千个大气压力，使提取介质的微小气泡压缩、爆裂、破碎提取原料的细胞壁，加速天然药用成份的溶出，“机械振动”和“热效应”进一步强化了溶出成份的扩散，使药用成份在提取介质中快速达到浓度平衡，可大大缩短提取成本。而且提取温度较低，避免了长时间高温水煎煮对五指毛桃化学成分的破坏，提高产品质量。
本发明以天然的药食两用植物五指毛桃为原料得到的提取物，具有很强的抑制意大利青霉，指状青霉，柑橘黑腐病菌和酸腐病菌的作用。本发明所述含有五指毛桃提取物的药物组合物和柑橘保鲜剂，无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，具有很好的应用前景。
附图说明
图1的照片显示的是试验例1中，实施例1制备的五指毛桃提取物对意大利青霉、指状青霉、柑橘酸腐病菌和柑橘黑腐病菌的抑菌效果，箭头指示的是抑菌环的边缘；其中1A显示的是五指毛桃提取物对意大利青霉的抑菌效果，1B显示的是五指毛桃提取物对指状青霉的抑菌效果,1C显示的是五指毛桃提取物对酸腐病菌的抑菌效果，1D显示的是五指毛桃提取物对黑腐病菌的抑菌效果。
图2的照片显示的试验例1中，实施例1制备的不同浓度的五指毛桃提取物对接种了柑橘黑腐病菌的柑橘的防治效果。
具体实施方式
通过下面给出的具体的实例对本发明作进一步说明，但它不能理解为对本发明的限定。
下述实施例所用的药材、试剂、生物材料，如无特殊说明，均来源于商业途径。
实施例1一种五指毛桃提取物
所述五指毛桃提取物通过如下步骤制备：
I.将五指毛桃40℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量20倍的重量百分比浓度为95％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为60℃，提取时间为2小时，超声频率为30KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得所述五指毛桃提取物。
试验例1五指毛桃提取物对柑橘采后病原真菌的抑菌作用
实验材料：
①供试药物：实施例1制备的五指毛桃提取物，用蒸馏水配制成浓度为1g药材/mL的溶液。
②供试菌株：意大利青霉(Penicillium italicum，ACCC30399)，指状青霉(Penicillium digitatum，ACCC30389)，均来自中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)；柑橘酸腐病菌(Geotrichum candidum)和柑橘黑腐病菌(Alternaria citri)实验室从赣南脐橙病果分离得到。
实验方法：
1、琼脂扩散法测定五指毛桃提取物对意大利青霉和指状青霉的抑菌作用
取供试菌接种于试管斜面培养基，30℃培养2-3d，将试管培养基中的供试菌用PDB培养液将孢子洗入三角瓶中，摇匀，玻璃珠打散，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使菌液浓度达106-107cfu/mL备用。
吸取上述孢子菌悬液5mL混入冷却至50℃左右PDA培养基，制备带菌培养基。然后放置无菌牛津杯，分别于牛津杯中加入200μL所述五指毛桃提取物溶液，置于28℃恒温箱中培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的大小。重复测定三次，计算抑菌环直径平均值。
2、生长速率法测定五指毛桃提取物对柑橘酸腐病菌和柑橘黑腐病菌的抑菌作用
无菌条件下，以纯PDA培养基为对照，用直径6mm打孔器打取活化好的各供试菌的菌落边缘菌块，分别将其转接到含五指毛桃提取物的PDA培养基及对照培养基中，每个处理重复三次，并将其置于28℃恒温培养箱中培养，5d后记录各菌落生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。
抑制率(％)＝100×(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径
3、二倍稀释法测定五指毛桃提取物的最低抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MFC)
将所述五指毛桃提取物溶液二倍稀释至1.95mg五指毛桃药材/mL～1000mg五指毛桃药材/mL之间的十个浓度梯度，然后吸取10mL不同浓度的五指毛桃提取物溶液于含90mL未融化的PDA培养基中，摇匀后倒入平板中，制成含药培养基，待培养基凝固后，用平板涂布法将意大利青霉孢子菌悬液均匀涂于含药PDA培养基上，每个浓度重复三次。并设置空白对照组(培养基不接种菌)、菌液对照组(培养基接种菌但不含五指毛桃乙醇提取物)。将试验组和对照组置于28℃的培养箱中培养2d,试验组中以无菌生长的培养皿的最低含药浓度为其MIC，将所有无菌生长的培养皿继续培养7d后观察，以无菌生长的培养皿的最低含药浓度为其MFC。
4、五指毛桃乙醇提取物对赣南脐橙的生防效果
将赣南脐橙果实用2％NaClO溶液消毒处理后，再用流水冲洗干净，晾干备用。用接种针在果实腰部刺伤一个直径4mm，深度3mm的伤口，用微量移液器接种20μL不同浓度的五指毛桃提取物和20μL 1×106CFU/mL意大利青霉孢子悬浮液，试验分3个处理：①柑橘果实接种意大利青霉孢子悬浮液，作为试验空白对照；②五指毛桃提取物处理柑橘果实伤口后再接种意大利青霉孢子悬浮液；③咪鲜胺阳性对照组。
果实置于托盘上，套上薄膜袋，各处理9个果实，重复3次。保持相对湿度在95％左右，27℃培养培养7d后，调查柑橘果实病斑直径，根据下述公式计算防治效果。
防治效果(％)＝100×(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径
实验结果
1、五指毛桃提取物对供试病原菌的抑制作用
五指毛桃提取物对意大利青霉、指状青霉、柑橘酸腐病菌和柑橘黑腐病的抑菌效果参见图1。五指毛桃醇提取物在1g药材/mL的浓度下对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径的大小分别为45.6±1.1mm和41.8±1.0mm，五指毛桃提取物在100mg药材/mL的浓度下对柑橘酸腐病菌的抑制率为90％以上，对黑腐病菌的抑制率为100％。同时以1000倍稀释的咪鲜胺为阳性对照，发现五指毛桃提取物的抑菌能力与1000倍稀释的咪鲜胺相当。
2、五指毛桃提取物抑制意大利青霉的MIC和MFC
五指毛桃乙醇提取物对意大利青霉最低抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MFC)分别为6.25mg五指毛桃药材/mL和50mg五指毛桃药材/mL。
3、五指毛桃提取物对赣南脐橙的生防效果
结果参见图2和表1。
表1 五指毛桃提取物对赣南脐橙的生防效果
100mg药材/mL的五指毛桃提取物对意大利青霉引起的赣南脐橙病害防治效果达到67.5％。五指毛桃提取物浓度的对数值与防治效果之间表现为线性关系，线性方程为Y＝7.3501+1.8261X。经计算EC50为51.6mg/mL。同时以500倍稀释和1000倍稀释的咪鲜胺为阳性对照，发现100mg药材/mL五指毛桃提取物的防治效果比1000倍稀释的咪鲜胺强(37.5％)，效果稍弱于500倍稀释的咪鲜胺(68.1％)。
上述实验结果均说明本发明所述五指毛桃提取物，对柑橘采后多种病原菌具有很强的抑制作用，可以有效防治这些病原菌引起的柑橘采后病害。
实施例2一种五指毛桃提取物
所述五指毛桃提取物通过如下步骤制备：
I.将五指毛桃50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量30倍的重量百分比浓度为100％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为50℃，提取时间为1小时，超声频率为30KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得到所述五指毛桃提取物。
实施例3一种柑橘采后保鲜剂
处方：实施例1制备的五指毛桃提取物100mg(浓度1g药材/mL)，羧甲基纤维素10g，柠檬酸钾0.6g，蔗糖酯5g，甘油5g,丙酸钙10g，余量为蒸馏水，共制成1000mL。
制备方法：称取处方量的羧甲基纤维素，加入适量蒸馏水溶胀8h，再加入蒸馏水搅拌配制羧甲基纤维素溶液。然后依次加入柠檬酸、蔗糖酯、甘油、丙酸钙及五指毛桃提取物，用蒸馏水稀释至1000mL，搅拌均匀，即得。
实施例4一种柑橘采后保鲜剂
处方：实施例2制备的五指毛桃提取物100mg(浓度1g药材/mL)，羧甲基纤维素10g，柠檬酸钾0.6g，蔗糖酯5g，甘油5g,丙酸钙10g，余量为蒸馏水，共制成1000mL。
制备方法：称取处方量的羧甲基纤维素，加入适量蒸馏水溶胀8h，再加入蒸馏水搅拌配制羧甲基纤维素溶液。然后依次加入柠檬酸、蔗糖酯、甘油、丙酸钙及五指毛桃提取物，用蒸馏水稀释至1000mL，搅拌均匀，即得。
实施例5-19一种五指毛桃提取物
通过如下方法制备：
步骤I～III与实施例1同，但是除提取温度外，步骤II中的各个工艺参数都与实施例1不同，每个实施例具体的工艺参数见表2。
表2 实施例5-19超声提取的工艺条件
试验例2五指毛桃提取物对柑橘采后病原真菌的抑菌作用
实验材料：
①供试药物：实施例5-19制备的五指毛桃提取物，用蒸馏水配制成浓度为1g药材/mL的溶液。
②供试菌株：意大利青霉(Penicillium italicum，ACCC30399)。
实验方法：
1、琼脂扩散法测定五指毛桃提取物对意大利青霉的抑菌作用
同试验例1。
实验结果：见表3。
表3 五指毛桃提取物对意大利青霉的抑菌作用
实施例 抑菌圈直径 实施例 抑菌圈直径 实施例 抑菌圈直径 5 32.63±0.82 10 40.50±0.63 15 41.83±0.55 6 35.50±1.05 11 44.00±0.75 16 44.50±0.98 7 38.67±0.82 12 46.17±0.82 17 40.67±0.75 8 43.77±0.98 13 40.50±0.98 18 39.83±0.63 9 45.17±0.75 14 38.53±0.55 19 37.50±0.63
试验结果表明，本发明实施例5-19所述的提取工艺条件提取得到的五指毛桃乙醇提取物都有抑菌效果，但是以实施例12的乙醇提取物作用最强，其次是实施例9和16，再次是实施例8、10、11、13、15。因此，本发明优选的一种五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：
I.将五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量10～40倍的质量百分比浓度为60％～100％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃～60℃，提取时间为30min～150min，超声频率为30～40KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。
本发明更优选的一种五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：
I.将五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量20～40倍的质量百分比浓度为90％～100％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃～60℃，提取时间为60min～90min，超声频率为30～40KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。
本发明进一步优选的五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：
I.将五指毛桃40～50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；
II.步骤I得到的粉末中加入所述五指毛桃重量30倍的质量百分比浓度为90％的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为60℃，提取时间为60min，超声频率为30～40KHz；过滤，得到醇提取液；
III.步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。
总之，本发明提供一种对柑橘采后多种病原菌具有很强的抑制作用的五指毛桃提取物，可以有效防治这些病原菌引起的柑橘采后病害。