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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510809450.X (22)申请日 2015.11.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105359798 A (43)申请公布日 2016.03.02 (73)专利权人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 司军 宋洪元 任雪松 李成琼 陈静 彭丽莎 (74)专利代理机构 重庆华科专利事务所 50123 代理人 康海燕 吴兴伟 (51)Int.Cl. A01G 1/00(2006.01) A01G 13/00(2006。
2、.01) (56)对比文件 CN 104025870 A,2014.09.10,全文. KR 20120003985 A,2012.01.12,全文. CN 103461037 A,2013.12.25,全文. 司军等.十字花科蔬菜根肿病及其综合防 治. 西南园艺 .2001,第29卷(第01期),第24-25 页. 李惠明等.十字花科根肿病发生规律及测报 防治技术. 长江蔬菜 .1999, (第09期),第15-16 页. 司军等.十字花科植物根肿病及抗根肿病育 种研究进展. 西南农业学报 .2002,第15卷(第 02期),第69-72页. 审查员 丁叶多 (54)发明名称 一种利用荞麦防。
3、治甘蓝根肿病的栽培方法 (57)摘要 本发明属于甘蓝栽培技术领域， 具体涉及一 种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法。 本发明 要解决的技术问题是为防治甘蓝根肿病提供一 种新选择。 本发明的技术方案是利用荞麦防治甘 蓝根肿病的栽培方法， 包括如下步骤： 将荞麦与 甘蓝进行间作或轮作； 间作时， 种植畦中央首先 条播荞麦， 3040d后在荞麦两侧定植甘蓝； 轮作 时， 甘蓝前茬作物为荞麦， 荞麦种植为常规栽培， 荞麦收获后种植甘蓝。 本发明中的间作和轮作植 物为荞麦， 该种植物对作物的根腐病、 全蚀病等 病害具有很好的防治效果， 相较于传统化学农药 防治具有安全和无农药残留， 对环境无污染等特 点。
4、。 权利要求书1页 说明书5页 CN 105359798 B 2017.11.07 CN 105359798 B 1.一种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 将荞麦与甘 蓝进行间作或轮作； 间作时， 露地田间 1.61.8m 作畦， 在畦中央条播荞麦， 3040d 后在 荞麦两侧定植甘蓝， 甘蓝行株距为 7590cm4560cm； 轮作时， 甘蓝前茬作物为荞麦， 荞 麦种植为常规栽培， 荞麦收获后种植甘蓝， 露地田间1.11.3m 作畦， 甘蓝行株距为 50 65cm4560cm。 2.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于： 所述的荞麦为花荞品种或苦荞品种。 。
5、3.如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于： 间作时， 大型甘蓝品种露地田间 1.8m作畦， 小型甘蓝品种露地田间 1.6m 作畦。 4.如权利要求1 或 2所述的方法， 其特征在于： 间作时， 荞麦播种 35d 后定植甘蓝。 5.如权利要求1 或 2所述的方法， 其特征在于： 间作时， 大型甘蓝品种甘蓝定植行株距 为 90cm60cm， 小型甘蓝品种定植行株距为 75cm45cm。 6.如权利要求1 或 2所述的方法， 其特征在于： 轮作时， 大型甘蓝品种种植露地田间 1.3m 作畦， 小型甘蓝品种种植露地田间 1.1m 作畦。 7.如权利要求1 或 2所述的方法， 其特征在于： 。
6、轮作时， 大型甘蓝品种定植行株距为 65cm60cm， 小型甘蓝品种定植行株距为 5045cm。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105359798 B 2 一种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法 技术领域 0001 本发明属于甘蓝栽培技术领域， 具体涉及防治甘蓝根肿病的栽培方法。 背景技术 0002 结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)简称甘蓝， 为十字花科蔬菜。 在我国各地均有栽培， 是我国主要蔬菜作物之一， 在我国蔬菜的全年供应中占有重要地位。 甘蓝根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)。
7、侵染引起的一种世界性 的土传病害， 主要危害十字花科作物。 近年来， 我国甘蓝根肿病发病面积急剧增加， 造成产 量和品质大幅度降低， 严重时甚至绝收。 国内外对其防治方法进行了大量的研究， 但至今仍 未找到行之有效的根治根肿病的防治措施， 探索防治根肿病的新方法和新技术具有重要的 现实意义。 0003 荞麦1是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill.)的双子叶禾谷类作物。 在世界上分布较广， 几乎遍及所有种植有粒用作物的国家。 1994年张庆平2试验研究表明 连作小麦重病田复种荞麦， 翌年小麦产量增加， 小麦全蚀病害也明显降低。 同一科属的金荞 麦， 也有相关报道。
8、。 2005年王立波3和2006年冯黎莎4对金荞麦抗菌活性研究中， 得出金荞 麦对细菌和真菌均有一定的抑制作用。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是为防治甘蓝根肿病提供一种新选择。 0005 本发明的技术方案是首次发明并利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法， 包括如下 步骤： 将荞麦与甘蓝进行间作或轮作； 间作时， 露地田间1.61.8m做畦， 种植畦中央首先条 播荞麦， 3040d后在荞麦两侧定植甘蓝； 主要考虑到甘蓝育苗时间需3040d， 同时荞麦根 系分泌物在田间有一定的积累， 甘蓝行株距为7590cm4560cm； 轮作时， 甘蓝前茬作物 为荞麦， 荞麦种植为常规栽培， 荞麦收获。
9、后种植甘蓝， 露地田间111.3m作畦， 甘蓝行株 距为5065cm4560cm,畦宽和行株距主要根据甘蓝品种的不同确定。 0006 其中， 所述的荞麦为花荞品种或苦荞品种。 0007 其中， 间作时， 大型甘蓝品种露地田间1.8m作畦， 小型甘蓝品种露地田间1.6m作 畦。 0008 其中， 间作时， 荞麦播种35d后定植甘蓝。 0009 其中， 间作时， 大型甘蓝品种甘蓝定植行株距为90cm60cm， 小型甘蓝品种定植行 株距为75cm45cm。 0010 其中， 轮作时， 大型甘蓝品种种植露地田间1.3m作畦， 小型甘蓝品种种植露地田间 1.1m作畦。 0011 其中， 轮作时， 大型甘。
10、蓝品种定植行株距为65cm60cm， 小型甘蓝品种定植行株距 为5045cm。 0012 本发明的有益效果： 说 明 书 1/5 页 3 CN 105359798 B 3 0013 (1)本发明中的间作和轮作植物为荞麦， 该种植物对作物的根腐病、 全蚀病等病害 具有很好的防治效果。 但在甘蓝栽培中利用很少， 特别是防治根肿病方面还处于空白， 因 此， 本发明有助于完善对该种重要植物在蔬菜病害防治方面的认识。 0014 (2)采用荞麦和甘蓝间作和轮作的栽培制度， 可以提高土地利用率， 减少光能的浪 费， 抑制杂草的生长， 降低成本。 有利于调动农户的种植积极性， 也可帮助种植户增收。 进一 步发。
11、展了甘蓝抗病的栽培理论， 有益于建立1套甘蓝防治根肿病的栽培模式。 0015 (3)抗病原理主要是利用荞麦的根系分泌物， 可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发， 可 以降低甘蓝根肿病的发生程度。 相较于传统化学农药防治具有安全和无农药残留， 对环境 无污染等特点。 具体实施方式 0016 实施例 荞麦与甘蓝轮间作对苗期甘蓝根肿病的防治效果 0017 (1)试验设计： 室内和田间试验共设5个处理， 单作甘蓝(G)； 苦荞与甘蓝间作(K+ G)； 花荞与甘蓝间作(H+G)； 苦荞与甘蓝轮作(K-G)； 花荞与甘蓝轮作(H-G)， 每个处理3次重 复。 0018 室内试验： 设计单作每盆3株甘蓝(CK)， 。
12、间作处理中每盆2株甘蓝， 1株荞麦。 荞麦生 长15d之后， 播种甘蓝。 轮作处理中荞麦种植50d后种植甘蓝3株， 每个处理20盆， 人工气候室 中培养(25/18)， 各处理重复3次。 甘蓝播种露一片真叶， 两片真叶， 三片真叶时， 采用5 点采样法， 取甘蓝根际同层次土样， -79下保存土样用于PLFA种类和含量的分析。 最后一 次取土样时测定甘蓝的株高和鲜重， 并采集各处理甘蓝叶片与根系用于保护性酶活性测 定。 0019 田间试验设计荞麦和甘蓝均采用点播， 间作小区按1行荞麦1行甘蓝方式种植， 间 作小区内4个荞麦种植带， 3个甘蓝种植带。 2014年8月10日同时播种， 2014年10。
13、月10日调查 并采集甘蓝根际土， -79下保存土样用于根际土壤微生物区系PLFA的种类和含量的分析。 0020 甘蓝根肿病单株分级标准： 0021 0级： 根系生长正常、 无肿瘤； 0022 1级： 根系主根不发病或膨大不明显， 其直径2倍茎基部或须根有小肿瘤； 0023 2级： 主根明显肿大， 直径2-3倍茎基部； 0024 3级： 主根明显肿大， 直径3-4倍茎基部； 0025 4级： 主根明显肿大， 直径4倍以上茎基部或根部发黑腐烂， 无须根。 0026 发病率感染根肿病的单株数/该材料参与统计的总株数100。 0027 病情指数(各级病株数该病级值)/(调查总株数最高级值)。 0028。
14、 (2)荞麦与甘蓝轮间作对甘蓝根际土壤微生物区系的影响 0029 磷脂脂肪酸(PLFA)的提取： 用于测定微生物生物量的新鲜土样先除去可见动、 植物残体， 过2mm筛子， 根据水分系数称取相当于8g干重的土壤， 置于35ml离心管中， 向离心 管中加入5ml磷酸缓冲液， 6ml三氯甲烷， 12ml甲醇； 285320r， 26， 振荡2小时； 先预热离 心机2h， 25， 3500rpm， 离心10分钟， 取上清液倒入大试管A中； 下层土壤样品重复步骤一 (加入5ml磷酸缓冲液， 6ml三氯甲烷， 12ml甲醇)， 手工上下摇动两分钟， 285320R， 26， 振 荡30分钟， 3500rp。
15、m， 25， 离心10分钟， 上清液倒入大试管A中； 加12ml CHCL3， 12ml磷酸缓 说 明 书 2/5 页 4 CN 105359798 B 4 冲液于大试管A中， 封上封口膜， 摇动2分钟， 静止过夜； 用吸管将大试管A中下层溶液吸入新 备好的大试管B中， 贴好标签； 30-32水浴， N2浓缩吹干； 取500ml CHCL3冲洗大试管B底部 并转移到萃取小柱， 此步骤重复2次； 加3ml CHCL3调解萃取小柱； 向萃取小柱加入依次加入 5ml CHCL3， 5ml丙酮； 用1ml枪取甲醇清洗萃取小柱底部， 弃小试管A； 向萃取小柱内加5ml甲 醇， 小试管B收集淋洗液； 用1。
16、0ul的移液枪第一次加入4ul内标， 第二次用移液枪加入淋洗液 冲洗内标、 小试管B壁部， 摇动， 再多次用移液枪冲洗试管使之混匀。 32水浴， N2浓缩吹干； 加1ml 1:1甲醇： 甲苯1ml 0.2M KOH溶液， 摇匀； 37水浴加热15分钟； 加0.3ml 1M醋酸溶 液， 2ml己烷， 2ml超纯水； 低速振荡10分钟(120-200R)， 上层己烷溶液移入小试管C； 下层加 2ml己烷再振荡10分钟； 上层己烷溶液移入小试管C； 小试管C， N2脱水干燥， 不用水浴； 加入 200ul的正己烷冲洗小试管C底部及壁部， 摇动， 再多次用胶头玻璃滴管冲洗试管使之混匀， 用胶头玻璃滴管。
17、转移到GC专用内衬管， 2-3天内检测-20保存。 超过3天检测， -80保存。 0030 PLFA的检测： 采用美国Agilent 6850气相色谱仪(FID)检测器分析PLFA的成分。 在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本： HP-5柱(25.0m200 m 0.33 m)， 进样量1 l， 分流比1:1载气H2尾吹气高纯N2， 助燃气空气， 流速0.8mL/min。 汽化室 温度250、 检测器温度300， 柱前压10.0psi(1psi6.895kpa)。 二阶程序升高柱温： l70 起始， 5/min升至260， 而后40/min升温至310， 维持1.5min。 。
18、各成分脂肪酸通过 MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version 6.1， MIDI， Inc.， Newark， DE)， 标准品购于美国 MIDI公司的C9-C20的脂肪酸甲酯， 定量分析以正十九烷酸甲酯(19:0)为内标。 0031 按照Frostegard(1993)的方法， 对PLFAs进行命名。 代表细菌的标记性的磷脂脂肪 酸有14:00、 14:0iso、 15:0anteiso、 15:0iso、 15:1iso G、 16:00、 16:0anteiso、 16:0iso、 16: 1 2OH、 16:1iso G、 16:1w5c、 16:1w9c、 17:0an。
19、teiso、 17:0cyclo、 17:0iso、 17:1w8c、 18:00、 18:1w7c11-methyl、 19:0cyclo w8c、 20:1w9c、 12:00、 17:00、 10:0 3OH、 13:00； 代表放线菌 标记性的磷脂脂肪酸有17:0 10-methyl、 18:0 10-methyl， TBSA； 代表真菌标记性磷脂脂肪 酸18:1w9c； 代表原生生物标记性的磷脂脂肪酸有20:4w6， 9， 12， 15c， 18:3w6c(6， 9， 12)。 0032 (3)荞麦根系分泌物对甘蓝根肿病的影响 0033 荞麦根系分泌物的少量收集： 将花荞、 苦荞种子。
20、在25条件下催芽2d， 播种在盛 有1/2Hoagland营养液的小烧杯的纱布上， 每杯播15颗， 营造密闭不透光的环境， 在25人 工气候室中培养7d后收集含根系分泌物的溶液， 在苗子培养期间需向烧杯中加入营养液以 保持其体积不变。 将收集的含根系分泌物的溶液在超净工作台上用细菌过滤器(其滤膜的 孔径为0.22um)过滤灭菌， 过滤灭菌的滤液保存于4冰箱内， 用于根肿菌休眠孢子的萌发 试验。 0034 根肿菌休眠孢子悬浮液的制备： 参考肖崇刚的方法有所改进， 根据土重计算应 称取的肿根量， 用自来水下冲洗干净后， 按大约1:3比例加无菌水用组织搅碎机搅成匀浆， 用8层医用纱布过滤， 滤液移入。
21、离心管， 以500r/min离心5min， 取上清液及上层的灰色沉淀， 加无菌水悬浮， 3100r/min离心15min， 去上清液， 沉淀溶于无菌水中， 3100r/min离心10min， 去上清液(此步骤可重复2-3次)， 将沉淀溶于一定量的无菌水中， 配制成浓度为2108个/ ml的母液(利用纽鲍尔血球计数板计数)， 保存于4冰箱内备用。 0035 休眠孢子萌发试验设计： 将休眠孢子悬浮液加入到过滤灭菌的根系分泌物溶液 中， 将孢子浓度稀释至108个/ml。 将4.5ml含有根肿菌休眠孢子悬浮液的根系分泌物溶液加 说 明 书 3/5 页 5 CN 105359798 B 5 入到灭菌的试。
22、管中， 无菌水作为对照。 每个处理3次重复， 在24的培养箱内进行黑暗培养， 10d后镜检孢子萌发情况。 0036 休眠孢子萌发的判定： 采用孙良菲等的1地衣红染液染色判断取一定量的休 眠孢子悬浮液均匀的涂抹在载玻片上， 自然干燥或在酒精灯上微热干燥， 滴入1地衣红染 液染色2-3min， 然后用95的酒精冲洗掉残留的地衣红染液， 待其干燥后滴入一定量的 15的甘油(已灭菌)作为浮载剂并盖上盖玻片观察。 显微镜下整个孢子都被地衣红染上色 的为未萌发的休眠孢子， 只有孢子的边缘被染上色， 中间透明的孢子为萌发的休眠孢子。 将 待测根肿病菌的休眠孢子用地衣红染液染色后， 显微镜下镜检孢子萌发数， 。
23、记载孢子萌发 情况并计算孢子萌发抑制率。 计算荞麦根系分泌物对休眠孢子萌发的影响。 0037 休眠孢子萌发率孢子萌发数/调查孢子总数100； 0038 休眠孢子萌发抑制率(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率 100。 0039 荞麦根系分泌物的大量收集： 采用自制荞麦水培系统， 由塑料盆、 泡沫板、 通气 泵构成。 用蒸馏水制成剂量为1/2Hoagland营养液， 每盆盛5L营养液。 在泡沫板上小孔中定 植荞麦幼苗， 尽量不伤根， 每盆定植生长20d的荞麦植株， 营造密闭不透光的环境， 在25人 工气候室中通气培养。 每7d更换一次营养液， 每次更换的营养液保存于4下备用， 共培。
24、养 50d， 用于浇灌甘蓝。 0040 接种方法： 用菌土法(2108g/干土)接种根肿菌， 在播种前5d， 播种时， 播种后 每隔5d， 用所获得的荞麦根系分泌物浇灌， 设置营养液处理对照(CK)， 50d左右调查植株的 发病率和病情指数， 。 0041 土壤中的休眠孢子含量的测定： 取10g含休眠孢子的土样溶于20ml 0.05 Tween80(polyoxyethylene sorbitan monooleate)溶液中， 置于摇床上摇2-3h。 混合液依 次通过100、 120、 200、 50目的筛网， 滤去有机物质和砂粒， 收集滤液， 滤液3100r/min下离心 15min， 弃。
25、上清液， 沉淀重溶于50ml灭菌水中， 3100r/min离心10min， 此步操作可重复2-3次。 弃上清液， 在沉淀中加5ml 50蔗糖溶液， 混匀后， 3100r/min离心10min， 用移液枪把上清 液小心移入一干净的离心管， 加25ml灭菌水， 3100r/min离心10min， 弃上清液， 沉淀重溶于 25ml灭菌水， 3100r/min离心10min， 此步操作可重复2次， 最后沉淀溶于5ml灭菌水备用。 取 一滴休眠抱子提取液与载玻片上， 盖上盖玻片， 于400倍显微镜下镜检， 并在血球计数板上 计数， 按照下面的公式计算每毫升带菌溶液中的孢子含量。 0042 (4)实验结果。
26、 0043 从表1可以看出： 花荞处理的甘蓝根肿病的发病率为80.0， 苦荞处理的甘蓝根肿 病的发病率为87.5， 与单作100的发病率相比分别降低了20.0、 12.5。 苦荞和花荞 间作后病情指数分别比对照降低了14.38、 13.13。 田间结果表明： 甘蓝单作根肿病发病 率为88.5， 间作处理甘蓝中， 苦荞处理的甘蓝根肿病的发病率为58.0， 花荞处理的甘蓝 根肿病发病率为67.5。 相对于甘蓝单作对照， 苦荞处理的甘蓝根肿病病情指数降低了 23.63， 花荞处理的降低了13.13。 0044 通过甘蓝和荞麦轮作有效防治了根肿病的发生。 室内防效试验发现： 与甘蓝单作 相比， 苦荞与。
27、甘蓝轮作的发病率、 病情指数分别降低了77.5、 77.87； 花荞与甘蓝轮作的 发病率、 病情指数各降低了80、 84 .10。 田间防效结果： 甘蓝单作根肿病发病率为 说 明 书 4/5 页 6 CN 105359798 B 6 88.5。 苦荞与甘蓝轮作， 甘蓝根肿病的发病率为20.0。 花荞与甘蓝轮作同前， 与甘蓝单 作相比， 发病率降低了68.5。 苦荞处理的甘蓝根肿病的病情指数为11.25， 与对照相比降 低了39.38。 花荞处理的甘蓝根肿病的病情指数为15.63， 与对照相比降低了35.00。 0045 表1 不同处理对甘蓝根肿病的影响 0046 0047 通过浇灌荞麦的根系分。
28、泌物发现对甘蓝根肿病的发生具有良好的防治效果。 未浇 灌荞麦根系分泌物的甘蓝根肿病发病率极显著高于浇灌花荞根系分泌物， 其又极显著高于 浇灌苦荞根系分泌物的发病率。 0048 参考文献： 0049 1汪灿， 阮仁武， 袁晓辉， 等.荞麦茎秆解剖结构和木质素代谢及其与抗倒性的关 系J.作物学报， 2014， 10期(10):1846-1856. 0050 2张庆平， 刘中兴.荞麦根系分泌物对小麦全蚀病菌的抑制及根际微生物种群数 量观察J.内蒙古农业科技， 1994， (01):8-9. 0051 3王立波， 邵萌， 高慧媛， 等.金荞麦抗菌活性研究J.中国微生态学杂志， 2005， (05):330-331. 0052 4冯黎莎， 付先龙， 陈放， 等.金荞麦提取物对植物病原菌的抑菌活性初探J.四 川大学学报： 自然科学版， 2006， (03):688-691。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105359798 B 7 。