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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510951083.7 (22)申请日 2015.12.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105638651 A (43)申请公布日 2016.06.08 (73)专利权人 佛山市艳晖生物科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市禅城区文沙东 一街5号首层3号铺117室 (72)发明人 胡艳晖 (51)Int.Cl. A01N 25/14(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C05G 3/0。
2、0(2006.01) (56)对比文件 WO 2014193746 A1,2014.04.12, CN 101243801 A,2008.08.20, CN 103160450 A,2013.06.19, CN 102154178 A,2011.08.17, 审查员 曹猛猛 (54)发明名称 一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 (57)摘要 本发明涉及生物农药技术领域， 具体公开的 是一种含有芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌的可湿 性粉剂及其制备方法， 该可湿性粉剂的原料由下 列重量组份组成： 萎缩芽孢杆菌发酵液40-70份； 填料： 高岭土20-30份； 润湿剂： 十二烷基苯磺酸 钠 1-4份； 。
3、分散剂： Morwet D-425 0.2-1份； 芽孢 萌发剂： 果糖0.1-1份， 苏氨酸0.1-1份， 2， 6-吡啶 二羧酸钙0.1-0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1-2份， 羧甲基纤维素0.2-1份； 干燥保护剂： 蔗糖1-5份， 谷氨酸钠0.2-1份。 本发明制备的萎缩芽孢杆菌 可湿性粉剂施入大田后芽孢萌发速度快， 萌发率 高， 可明显提高其防治效果， 可减少芽孢用量， 降 低生产成本。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105638651 B 2018.03.27 CN 105638651 B 1.一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂， 其特征在于， 所述萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂由下列 重。
4、量份组成： 萎缩芽孢杆菌发酵液40-70份； 填料： 高岭土20-30份； 润湿剂： 十二烷基苯磺酸 钠 1-4份； 分散剂： Morwet D-425 0.2-1份； 芽孢萌发剂： 果糖0.1-1份， 苏氨酸0.1-1份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1-2份， 羧甲基纤维素0.2-1份； 干燥保护 剂： 蔗糖1-5份， 谷氨酸钠0.2-1份； 所述萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法由以下几步骤组成： 一、 萎缩芽孢杆菌发酵液的制备 取出菌种保藏管， 用营养肉汤固体培养基划平板进行复苏， 30培养48小时， 在平板下 挑取单个菌落接种至50毫升营养肉汤培养基中。
5、， 在培养箱中30震荡培养24小时， 种子采 用5%的接种量， 接种至5L大三角瓶中的萎缩芽孢杆菌液体培养基， 装液量为2L， 30震荡培 养16-28小时， 检测其菌液浓度， 菌液含量超过30亿/毫升， 即可作为萎缩芽孢杆菌种子液； 将萎缩芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中， 装液量为600L的发酵培养基， 通气量为前 16小时为每分钟液气比为1： 0.8， 其后通气量为1： 1； 培养温度前24小时为30， 开搅拌， 转 速为160r/min， 其后， 每2小时将温度提高1， 培养26-32小时， 检测其芽孢含量超过100亿 CFU/ml， 即可结束发酵， 作为萎缩芽孢杆菌发酵液； 。
6、其中， 所述营养肉汤培养基： 蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 氯化钠5g， 水1000mL， pH7.2， 固体培 养基中加入琼脂2%； 其中， 所述萎缩芽孢杆菌液体培养基： 葡萄糖15g/L， 牛肉膏10 g/L， 蛋 白胨5 g/L， 鱼粉5 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢二钾 0.5 g/L， 氯化钙0.5 g/L， pH7.2； 其中， 所述的发酵培养基： 葡萄糖15g/L玉米粉10 g/L， 玉米浆30 g/L， 蛋白胨10 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢二钾0.。
7、5 g/L， 氯化钙0.5 g/ L， 碳酸钙5g/L， pH7.2； 各培养基灭菌的条件为： 0.10-0.15MPa， 121灭菌30分钟； 二、 将萎缩芽孢杆菌发酵液40-70份； 填料： 高岭土20-30份； 紫外保护剂： 海藻糖1-2份， 羧甲基纤维素0.2-1份； 干燥保护剂： 蔗糖1-5份， 谷氨酸钠0.2-1份； 混匀后喷雾干燥， 得到 萎缩芽孢杆菌粉剂； 三、 将润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 1-4份； 分散剂： Morwet D-425 0.2-1份； 芽孢萌发 剂： 果糖0.1-1份， 苏氨酸0.1-1份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份； 混匀得到萎缩芽孢杆菌的 。
8、助剂； 四、 将步骤二与步骤三所得到的萎缩芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉 碎过400目筛， 检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g， 悬浮率不低于82%， 润湿时间不高于75s， 水分含量低于5%， 真空包装， 即为萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂； 所述萎缩芽孢杆菌菌种从中国工业微生物菌种保藏管理中心 购置， 编号为CICC 23950 。 2.根据权利要求1所述的一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂， 其特征， 在于所述萎缩芽孢杆 菌可湿性粉剂由下列重量份组成： 萎缩芽孢杆菌发酵液60份； 填料： 高岭土28份； 润湿剂： 十 二烷基苯磺酸钠 3份； 分散剂： Morwet D-425 1份； 芽。
9、孢萌发剂： 果糖0.8份， 苏氨酸0.4份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1.8份， 羧甲基纤维素0.8份； 干燥保护剂： 蔗 糖4份， 谷氨酸钠0.8份。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105638651 B 2 一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物农药技术领域， 具体涉及一种含有萎缩芽孢萌发剂的萎缩芽孢 杆菌可湿性粉剂及其制备方法。 背景技术 0002 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus、 ， 非致病菌， 枯草芽孢杆菌的一类变种， 在 含有碳水化合物的培养基上可形成可溶的黑色菌落， 主要从土壤中分。
10、离得到。 在农业、 工 业、 科研、 医疗和卫生等领域都有广泛的应用。 萎缩芽孢杆菌能产生过氧化氢酶， 不产生接 触酶， VP反应阳性， 不产生硫化氢、 吲哚以及二羟丙酮， 能将硝酸盐还原成亚硝酸盐， 能水解 淀粉和酪素。 萎缩芽孢杆菌最适生长温度范围： 2830； 最大生长温度范围： 5055； 最小 生长温度范围： 510。 萎缩芽孢杆菌能在PH为4-9以及在7%NaCl中生长。 萎缩芽孢杆菌能 利用L-阿拉伯糖、 D-果糖、 D-葡萄糖、 甘露醇、 水杨苷、 蔗糖、 海藻糖和木糖产酸不产气， 不能 利用蜜二糖和乳糖发酵。 罗华东等人筛选出对马铃薯甲虫具强致病性的细菌生防菌株萎缩 芽孢杆菌。
11、CPB072、 CPB108， 能降解几丁质、 蛋白质， 能利用蔗糖、 甘露醇发酵， 不能进行D-葡 萄糖发酵， CPB072能将硝酸盐还原成亚销酸盐， 但是CPB108不能将硝酸盐还原成亚硝酸盐。 0003 1872年， 由德国科学家Cohn建立的第一个细菌分类系统中， 根据细菌形态特征建 立了芽孢杆菌属(BaciUus)。 芽孢杆菌属细菌是一类能产球形或椭圆形芽孢的革兰氏阳性 菌， 对干旱、 紫外线、 低温、 高温等不良因子抗性强， 分布广， 存在于水、 土壤、 空气、 植物以及 动物肠道中。 同样， 萎缩芽孢杆菌在环境中分布较广。 韩松等人在铃铛刺花部器官中分离出 一株内生细菌HS-4，。
12、 该菌最终确定为萎缩芽孢杆菌。 薛鹏辑从平均海拔4000米以上的青藏 高原土样中分离到萎缩芽孢杆菌。 Fall等人发现在植物根系中存在萎缩芽孢杆菌。 0004 生物防治(biological control)是利用生物种之间的相互关系， 达到抑制另一种 或另一类有害生物的方法。 微生物生防作用， 作为生物防治的一种重要方法， 也是一种可持 续控制病害的手段， 备受关注。 近来， 人们从土壤和农作物内部分离出萎缩芽孢杆菌， 逐渐 将其用于防治病害。 0005 吴忠红对具有耐盐促生和防病作用2株萎缩芽抱杆菌进行鉴定， 并且研究其与其 它3株菌株混合培养以观察混合菌剂的防效作用。 涂彩虹从土壤中分离。
13、纯化出一株具有黄 曲霄拮抗活性的萎缩芽孢杆菌， 利用该菌株的发酵上清液观察抑制黄曲霉生长效果。 0006 石磊等通过平板透明圈法从大量生防菌中筛选获得一株具有几丁质酶活性的细 菌菌株CAB-1， 该菌株对番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌表现较强的拮抗活性。 通过生理 生化、 16S rDNA和gyrB基因序列测定， 将菌株CAB-1鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。 刘丁等从土壤中分离筛选的1株对黄曲霉具有拮抗作用的萎缩芽孢杆菌 (BaciUm atrophaeus、 进一步深入研究。 从营养竞争、 直接寄生、 诱导寄主抗性和抗生作用 多个方面探讨该株拮抗菌抑制黄曲霉。
14、的作用途径， 通过营养竞争作用和诱导寄主抗性研究 发现， 萎缩芽孢杆菌培养液无菌上清液中可能含有一种或几种萎缩芽孢杆菌的次级代谢产 物， 具有拮抗黄曲霉的作用。 说 明 书 1/6 页 3 CN 105638651 B 3 0007 目前芽孢杆菌作为生防制剂以可湿性粉剂为主， 这种剂型虽然便于储存和运输， 但在生产应用中存在很多制约因子。 如施用的可湿性粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中 有效成分的惟一标准， 若芽孢不能及时萌发， 施用效果则不佳， 如王倩利用枯草芽孢杆菌 TR21防治巴西蕉枯萎病时， 前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治 枯萎病， 但是利用芽孢制备可湿性。
15、粉剂的灌根与叶腋效果却不理想， 验证了去掉发酵液后 的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。 0008 芽孢杆菌在自然界中分布广泛， 当外部条件适合生长时， 芽胞会由休眠状态经过 一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用， 这个过程称为萌发 (germination)。 自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响， 这类营养物质被称之为 “萌发 剂” ， 通常营养诱导芽孢萌发包括氨基酸、 糖类和嘌吟核苷的单一作用， 也包括它们的协同 作用(例如： AGFK； A： L一天冬酞胺； G： 葡萄糖； F： 果糖； K： 钾离子)。 当营养物质接触到芽孢 时， 芽孢内部会发生一系列变化，（1） 。
16、、 芽孢核内部H十和Zn2+释放出来， 致使芽孢核内部pH由 弱酸性上升至弱碱性； (2)、 芽孢核内部Ca2+-DPA的大量释放； (3)、 芽孢核水合， 内部Ca2+- DPA被水所替代， 芽孢的耐热性下降； (4)、 芽孢皮层的芽孢肤聚糖层水解， 芽孢核膨胀； (5)、 芽孢核进一步水合， 芽孢核内部蛋白质流动性增强， 酶活性加强， 合成ATP； (6)、 降解SASP蛋 白， 以释放芽孢DNA， 进而引导芽孢生长过程中RNA、 蛋白质、 DNA的合成。 0009 芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内， 萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层 到达芽孢内膜的表面， 与位于芽孢内膜上的受体蛋白相。
17、互作用， 激发芽孢进入萌发状态， 接 着启动一连串萌发事件， 之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。 0010 现阶段， 还未有在萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的技术方案公开， 也未有在萎缩芽孢 杆菌可湿性粉剂中加入芽孢萌发剂的研究的报道。 0011 另外， 由于不同的芽孢杆菌与湿润剂， 分散剂等助剂的相容性， 载体对各类芽孢杆 菌吸附性各不相同， 将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺无法用于制备加入芽 孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂， 可湿性粉剂中有效菌的吸附量， 存活率， 对有害菌的 防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大， 其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑 各载体吸附能力， 对萎缩。
18、芽孢杆菌的干燥过程中保护作用， 湿润剂， 分散剂对可湿性粉剂的 悬浮率， 湿润时间的影响， 并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短， 悬浮 率高， 芽孢保存时间久， 使用后芽孢能快速萌发的， 防效好的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂。 发明内容 0012 本发明所要解决的技术问题是： 针对上述现有技术的不足， 提供一种含有芽孢萌 发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法， 芽孢萌发剂能使萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 融入水后， 萎缩芽孢能快速萌发， 大大提高萎缩芽孢的萌发率， 其制备的萎缩芽孢杆菌可湿 性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克， 悬浮率不低于82%， 润湿时间不高于75S， 细度粉。
19、碎 过400目筛， 水分含量不高于5%， 制备方法稳定。 0013 为了达到上述目的， 一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成： 萎缩芽孢 杆菌发酵液40-70份； 填料： 高岭土20-30份； 润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 1-4份； 分散剂： Morwet D-425 0.2-1份； 芽孢萌发剂： 果糖0.1-1份， 苏氨酸0.1-1份， 2， 6-吡啶二羧酸钙 0.1-0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1-2份， 羧甲基纤维素0.2-1份； 干燥保护剂： 蔗糖1-5份， 谷 说 明 书 2/6 页 4 CN 105638651 B 4 氨酸钠0.2-1份。 0014 一种萎缩芽孢杆菌可湿。
20、性粉剂的制备方法， 由以下几步骤组成： 0015 一、 萎缩芽孢杆菌发酵液的制备 0016 取出菌种保藏管， 用营养肉汤固体培养基划平板进行复苏， 30培养48小时。 在平 板下挑取单个菌落接种至50毫升营养肉汤培养基中， 在培养箱中30震荡培养24小时。 种 子采用5%的接种量， 接种至5L大三角瓶中的萎缩芽孢杆菌液体培养基， 装液量为2L， 30震 荡培养16-28小时， 检测其菌液浓度， 菌液含量超过30亿/毫升， 即可作为萎缩芽孢杆菌种子 液； 将萎缩芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中， 装液量为600L的发酵培养基， 通气量 为前16小时为每分钟液气比为1： 0.8， 其后通气。
21、量为1： 1； 培养温度前24小时为30， 开搅 拌， 转速为160r/min， 其后， 每2小时将温度提高1， 培养26-32小时， 检测其芽孢含量超过 100亿CFU/ml， 即可结束发酵， 作为萎缩芽孢杆菌发酵液； 0017 其中， 所述营养肉汤培养基： 蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 氯化钠5g， 水1000mL， pH7.2， 固 体培养基中加入琼脂2%； 其中， 所述萎缩芽孢杆菌液体培养基： 葡萄糖15g/L， 牛肉膏10 g/ L， 蛋白胨5 g/L， 鱼粉5 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢 二钾0.5 g/L， 氯化钙。
22、0.5 g/L， pH7.2； 0018 其中， 所述的发酵培养基： 葡萄糖15g/L玉米粉10 g/L， 玉米浆30 g/L， 蛋白胨10 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢二钾0.5 g/L， 氯化钙0.5 g/L， 碳酸钙5g/L， pH7.2； 各培养基灭菌的条件为： 0.10-0.15MPa， 121灭菌30分钟； 0019 二、 将萎缩芽孢杆菌发酵液40-70份； 填料： 高岭土20-30份； 紫外保护剂： 海藻糖1- 2份， 羧甲基纤维素0.2-1份； 干燥保护剂： 蔗糖1-5份， 谷氨酸钠0.2-1份； 混匀后喷雾干燥，。
23、 得到萎缩芽孢杆菌粉剂； 0020 三、 将润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 1-4份； 分散剂： Morwet D-425 0.2-1份； 芽孢萌 发剂： 果糖0.1-1份， 苏氨酸0.1-1份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份； 混匀得到萎缩芽孢杆菌 的助剂； 0021 四、 将步骤二与步骤三所得到的萎缩芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎 机粉碎过400目筛， 检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g， 悬浮率不低于82%， 润湿时间不高于 75s， 水分含量低于5%， 真空包装， 即为萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂。 0022 其中， 所述萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂最佳重量份组成为： 萎缩芽孢杆。
24、菌发酵液60 份； 填料： 高岭土28份； 润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 3份； 分散剂： Morwet D-425 1份； 芽孢萌 发剂： 果糖0.8份， 苏氨酸0.4份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1.8份， 羧甲 基纤维素0.8份； 干燥保护剂： 蔗糖4份， 谷氨酸钠0.8份。 0023 自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响， 这类营养物质被称之为 “萌发剂” ， 通 常情况下， 芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内， 萌发剂快速跨过芽孢衣和皮 层到达芽孢内膜的表面， 与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用， 激发芽孢进入萌发状态， 接着启动一连串萌发事件， 。
25、之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。 本发明可湿性粉剂 中含有芽孢萌发剂： 果糖， 苏氨酸， 2， 6-吡啶二羧酸钙； 是从苷氨酸， 丙氨酸， 缬氨酸， 亮氨 酸， 异亮氨酸， 丝氨酸， 苏氨酸， 蛋氨酸， 胱氨酸， 天冬酰胺， 谷氨酰胺， 天冬氨酸， 谷氨酸， 赖 氨酸， 精氨酸， 苯丙氨酸， 酪氨酸， 色氨酸， 组氨酸， 脯氨酸， 肌苷， 2， 6吡啶二羧钙中进行单因 素试验， 及组合性试验得到的具有明显诱导萎缩芽孢萌发的萌发剂。 经过试验， 本发明的萎 说 明 书 3/6 页 5 CN 105638651 B 5 缩芽孢杆菌可湿性粉剂与水按1： 1000的比例进行润湿混合均匀， 此时的。
26、芽孢萌发剂能充分 与芽孢接触后， 从而促使其快萌发， 经过试验， 30分钟后， 芽孢萌发率已经达到80%以上， 而 未加芽孢萌发剂的萎缩芽孢在4小时后， 其芽孢萌发率只达到了45%左右。 0024 本发明人通过对载体 （如膨润土， 滑石粉， 高岭土， 硅藻土， 白炭黑， 磷矿粉， 轻质碳 酸钙） 、 助剂 （润湿剂和分散剂） （聚乙烯醇， 聚乙二醇， CMC-Na， 吐温-60， 十二烷基苯磺酸钠， T型木质素， 十二烷基硫酸钠， 茶皂素， Morwet EFW， Morwet D425， My100， D110， 阿拉伯权胶， 2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐， 辛基酚聚氧乙烯醚， 二异辛基琥珀酸酯。
27、磺酸钠， 甲基纤维素， 木 质素磺酸钠） 填料 （硅藻土， 高岭土， 膨润土， 白炭黑， 轻质碳酸钙， 滑石粉） 、 紫外线保护剂 （抗坏血酸， 糊精， 十二烷基苯磺酸钠， 刚果红， 羧甲基纤维素， 卵磷脂） ， 干燥保护剂 （脱脂奶 粉， 蔗糖， 谷氨酸钠， 麦芽糖， 甘露糖， 甲基纤维素等） 进行筛选， 其每种助剂对萎缩芽孢杆菌 的芽孢存活， 悬浮性， 湿润性进行试验， 最后通过多轮单因素与正交试验确定萎缩芽孢杆菌 可湿性粉剂的配方。 通过验证， 本发明的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂在20-25下保存一年， 其芽孢存活率还可达到92亿CFU/克。 0025 本发明的可湿性粉剂采有真空包装， 减少。
28、芽孢与空气的接触， 降低了其萌发的机 率。 0026 本发明的可湿性粉剂的水分含量低于5%， 低水份含量的可湿性粉剂中即使含有芽 孢萌发剂 （果糖， 苏氨酸， 2， 6-吡啶二羧酸钙） ， 对其贮存过程中的芽孢活性也没有明显的影 响， 没有减少其在贮存过程中的芽孢。 0027 本发明中的可湿性粉中含有苏氨酸等单分子氨基酸， 不仅在使用初期作为萌发 剂， 而施入大田后则作为氨基酸肥可起到肥效的作用。 0028 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果： 0029 这是国内首次将萎缩芽孢杆菌的芽孢萌发剂加入萎缩芽孢杆菌可湿剂进行工业 化生产， 大大提升了芽孢萌发速率与萌发率， 解决了因为芽孢萌发。
29、慢， 萌发率低而导致的防 治效果差， 效果不稳定的问题； 0030 首次利用萎缩芽孢杆菌发酵液直接与载体， 填料等相关可湿性粉剂原料进行制备 可湿性粉剂， 减少了工艺流程， 减少了萎缩芽孢杆菌在制备可湿性粉剂过程中芽孢的损失 率； 0031 提供了一种芽孢含量不低于100亿cfu/g， 悬浮率不低于82%， 润湿时间不高于75s， 水分含量低于5%， 真空包装的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法。 具体实施方式 0032 本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现， 但这些实施例仅作为说明， 而不 是对本发明进行限制。 0033 实施例1 0034 一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成： 萎。
30、缩芽孢杆菌发酵液60份； 填 料： 高岭土28份； 润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 3份； 分散剂： Morwet D-425 1份； 芽孢萌发剂： 果糖0.8份， 苏氨酸0.4份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.5份； 紫外保护剂： 海藻糖1.8份， 羧甲基纤维 素0.8份； 干燥保护剂： 蔗糖4份， 谷氨酸钠0.8份。 0035 一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法， 由以下几步骤组成： 说 明 书 4/6 页 6 CN 105638651 B 6 0036 一、 萎缩芽孢杆菌发酵液的制备 0037 取出菌种保藏管(萎缩芽胞杆菌Bacillus atrophaeus CICC 23590， 购置于。
31、中国 工业微生物菌种保藏管理中心， 能防治枯萎病)， 用营养肉汤固体培养基划平板进行复苏， 30培养48小时。 在平板下挑取单个菌落接种至50毫升营养肉汤培养基中， 在培养箱中30 震荡培养24小时。 种子采用5%的接种量， 接种至5L大三角瓶中的萎缩芽孢杆菌液体培养 基， 装液量为2L， 30震荡培养16-28小时， 检测其菌液浓度， 菌液含量超过30亿/毫升， 即可 作为萎缩芽孢杆菌种子液； 将萎缩芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中， 装液量为600L 的发酵培养基， 通气量为前16小时为每分钟液气比为1： 0.8， 其后通气量为1： 1； 培养温度前 24小时为30， 开搅拌， 转。
32、速为160r/min， 其后， 每2小时将温度提高1， 培养30小时， 检测 其芽孢含量为112亿CFU/ml， 即可结束发酵， 作为萎缩芽孢杆菌发酵液； 0038 其中， 所述营养肉汤培养基： 蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 氯化钠5g， 水1000mL， pH7.2， 固 体培养基中加入琼脂2%； 其中， 所述萎缩芽孢杆菌液体培养基： 葡萄糖15g/L， 牛肉膏10 g/ L， 蛋白胨5 g/L， 鱼粉5 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢 二钾0.5 g/L， 氯化钙0.5 g/L， pH7.2； 0039 其中， 所述的发酵培养基。
33、： 葡萄糖15g/L玉米粉10 g/L， 玉米浆30 g/L， 蛋白胨10 g/L， 硫酸镁0.5 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 磷酸氢二钾0.5 g/L， 氯化钙0.5 g/L， 碳酸钙5g/L， pH7.2； 0040 各培养基灭菌的条件为： 0.10-0.15MPa， 121灭菌30分钟； 0041 二、 将萎缩芽孢杆菌发酵液60份； 填料： 高岭土28份； 紫外保护剂： 海藻糖1.8份， 羧 甲基纤维素0.8份； 干燥保护剂： 蔗糖4份， 谷氨酸钠0.8份； 混匀后喷雾干燥， 得到萎缩芽孢 杆菌粉剂； 0042 三、 将润湿剂： 十二烷基苯磺酸钠 3份；。
34、 分散剂： Morwet D-425 1份； 芽孢萌发剂： 果糖0.8份， 苏氨酸0.4份， 2， 6-吡啶二羧酸钙0.5份； 混匀得到萎缩芽孢杆菌的助剂； 0043 四、 将步骤二与步骤三所得到的萎缩芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎 机粉碎过400目筛， 检测其芽孢含量为124亿cfu/g， 悬浮率为91%， 润湿时间为62s， 水分含量 为3.55%， 真空包装， 即为萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂。 0044 实施例2 0045 含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂在黄瓜上的应用效果。 0046 1 试验地点： 湖南省隆回县桃洪镇某农户蔬菜大田。 0047 2 试验方法： 分9区， 每区6。
35、7平米， 做三个重复 0048 试验组： 移植时将幼苗用200倍实施例1制备的含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿 性粉剂稀释液沾根20分种， 在定植后10天后， 用含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 1000倍稀释液灌根1次， 在黄瓜生长期间， 叶面喷施1： 500倍可湿性粉剂， 20天1次， 连喷3次； 0049 对照组一： 移植时将幼苗用200倍未含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂稀 释液沾根20分种， 在定植后10天后， 用未含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍 稀释液灌根1次， 在黄瓜生长期间， 叶面喷施1： 500倍未含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿 性粉剂， 20天1次， 。
36、连喷3次； 0050 对照组二： 用清水喷施与沾根。 0051 3 试验结果： 移植后， 发现试验组与对照组一沾根了萎缩芽孢杆菌的植株叶片比 说 明 书 5/6 页 7 CN 105638651 B 7 较新鲜， 而且生长势好， 没有打蔫的了， 喷过含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的植 株 （试验组） 比清水组 （对照组二） 提前6天现花； 喷过未含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿 性粉剂的植株 （对照组一） 比清水组 （对照组二） 提前3天现花； 在大部分的都开过花后观察 发现， 发现萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的花开的比喷清水的鲜艳的多， 而且花的质量很好， 色 艳， 花大， 花看上去就比较 “。
37、壮” ， 而且从整个植株的生长来看， 生长势明显好于没喷过芽孢 杆菌的， 期间用过的黄瓜表现为叶色翠绿、 植株整齐且土壤表现为疏松， 从口感上黄瓜要清 脆、 香甜。 而对照组二 （清水组） 则叶色黄绿、 植株参差不齐。 实际测产时， 从表1可看出加芽 孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 （试验组） 比清水 （对照组二） 的增产35.8%， 未加芽孢 萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 （对照组一） 比清水 （对照组二） 的增产约14.6%， 从枯萎 病的防治情况看， 加芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 （试验组） 的防治效果达到 86.01%， 未加芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 （对照组一） 的防治效果也达到了60%， 但较加了芽孢萌发剂的防治效果还是差了26%左右。 0052 表1 含芽孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂在黄瓜上的应用效果 0053 处理产量 （kg）增产率(%)枯萎病病指防效(%) 试验组149735.82.7786.01 对照组一126314.67.9260 对照组二1102 19.80 说 明 书 6/6 页 8 CN 105638651 B 8 。