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1、10申请公布号CN104195219A43申请公布日20141210CN104195219A21申请号201410472672222申请日20140917C12Q1/28200601C12Q1/2620060171申请人中国科学院天津工业生物技术研究所地址300308天津市滨海新区空港经济区西七道32号72发明人柏玮朱玥明李星硕门燕孙媛霞54发明名称一种基于双酶偶联高通量检测D阿洛糖的新方法57摘要本发明涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测D阿洛糖的新方法。具体涉及利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联，检测D阿洛糖。该方法既可用于液体培养基中反应产物D阿洛糖的检测，也可用于检测固体培养基中反应产物。
2、D阿洛糖的生成。当用于液体培养基的检测时，反应产物与N（2羟基3磺丙基）3，5二甲氧基苯胺钠（HSDA）作用产生蓝色水溶性醌类物质，利用96孔酶标板在583NM处读取吸光值。吸光值与其浓度成线性关系，能够根据标准曲线计算浓度，并利用96孔酶标板进行高通量检测。当该方法用于固体培养基中D阿洛糖的检测时，反应产物与二氨基联苯胺DAB作用生成不溶于水的褐色吩嗪聚合体，利用此显色反应可在培养皿中挑出阳性菌落。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104195219ACN104195219A1/1页。
3、21一种利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测D阿洛糖的高通量筛选新方法，当用于液体培养基时，步骤如下（1）将单菌落或纯化后的酶转入含转化底物的96深孔培养板中；（2）将96深孔培养板利用冷冻离心机在合适的条件下离心，取其上清液进行测定；（3）利用双酶偶联的方法，在96孔板板中结合试剂A测定上述上清液中D阿洛糖的含量。2一种利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测D阿洛糖的高通量筛选新方法，当用于固体培养基时，步骤如下（1）将菌群涂布到固体培养基表面的硝酸纤维素薄膜上，待单菌落长出后，将膜揭下置于一干净的培养皿中；（2）预制溶融状态的含试剂B、转化底物以及双酶的显色胶，接着覆盖到长有菌落。
4、的硝酸纤维素薄膜上冷凝，利用双酶偶联的方法实时观测上述膜上各菌落生产D阿洛糖的进程。3按权利要求1中所述的方法，其特征是所述的双酶是吡喃糖氧化酶和过氧化物酶。4按权利要求1中所述的方法，其特征是结合试剂A是4氨替比林和HSDA的磷酸盐缓冲溶液（包括但并不局限于）。5按权利要求1中所述的方法，其特征是待试剂A、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的双酶以及样品加入到深孔板中后，37下反应20MIN。6按权利要求1中所述的方法，其特征是所述的测定条件为在583NM波长下测光吸收（包括但并不局限于）。7按权利要求2中所述的方法，其特征是所述的双酶是吡喃糖氧化酶和过氧化物酶。8按权利要求2中所述的方法，其特征是结。
5、合试剂B是DAB的磷酸盐缓冲溶液（包括但并不局限于）。9按权利要求2中所述的方法，其特征是待试剂、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的双酶以及样品加入到深孔板中后，37下反应124H。权利要求书CN104195219A1/4页3一种基于双酶偶联高通量检测D阿洛糖的新方法0001技术领域本发明属于糖转化工业微生物的筛选和开发利用领域，特别涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测D阿洛糖的新方法。0002技术背景高通量筛选的意义近年来，随着系统代谢工程与合成生物学的日新月异的发展，以及蛋白质构象预测、结构分析和定点突变方法研究的不断深入，加速了人们利用微生物以及微生物来源的关键酶的步伐。0003然而，由于生物体。
6、的复杂性和人类认识的局限性，除了少数成功的实例外，设计合成的工程菌株经常不能完全达到高效的生产要求，企图通过理性设计达到改善生产关键酶性能的目的也仍然非常困难。因此，需要通过诱变进化的方法进一步弥补理性设计的不足，而非理性的诱变则通常需要结合高效高通量的筛选。只有建立有效的高通量筛选方法，在先进的现代自动化技术和仪器设备帮助下，才能大大突破人工筛选在速度、效率和标准化等方面的限制。0004阿洛糖的生理活性和筛选意义在碳水化合物研究领域中，稀少糖是一类重要的研究内容。尽管在自然界中含量极少，但稀少糖却在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。D阿洛糖是一种功能广泛的稀少糖。它可以显著抑制中。
7、性分叶核白细胞的生成，因此能够在器官和组织移植中作为一种免疫抑制剂显示重要功能。此外，D阿洛糖还能够有效抑制肿瘤细胞的增生繁殖，并诱导卵巢癌细胞OVCAR3的凋亡。D阿洛糖的衍射物因其结构特点在许多具有生物活性的天然化合物、糖类衍射物、核苷类似物及非糖化合物的合成中应用广泛。0005D阿洛糖的生物转化目前主要是以D阿洛酮糖为底物，利用L鼠李糖异构酶将D阿洛酮糖转化为D阿洛糖。然而，目前发现的L鼠李糖异构酶大多催化效率不高，作用条件严苛，并不适用于工业化大生产。筛选和诱变筛选表达高效L鼠李糖异构酶或其生产菌株因此极为重要。0006传统检测方法的局限传统定性或定量检测D阿洛糖的方法非常有限。主要的。
8、检测方法为液相色谱法和以半胱氨酸咔唑法为代表的化学方法。液相色谱法操作繁琐，仪器、耗材的成本高，示差检测的灵敏度也比较低，如果检测的样品比较多，也会存在保留时间的偏移等问题。半胱氨酸咔唑的化学检测方法需要浓硫酸试剂，操作比较危险，而且对样品的纯度要求严格，受其他物质的干扰比较多。因此，研究建立简便、快速、准确、处理量大和应用广泛的分析方法，可以促进生物法生产D阿洛糖的理论研究，加快其产业化进程，对L鼠李糖异构酶及其生产菌株的快速进化也能起到很好的促进作用。发明内容0007本发明的目的说明书CN104195219A2/4页4本发明的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测D阿洛糖的新方法。通。
9、过吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测定D阿洛糖，高通量筛选目标微生物或酶。与传统筛选方法相比，基于双酶偶联反应的高通量筛选方法具有成本低、效率高、目的性强，能够批量操作的优点，能够从广泛的自然界中筛选性能优良的菌株。0008本发明的思路利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法，测定D阿洛糖和的含量。该方法包含两个方面内容。0009一方面，在氧气存在条件下，D阿洛糖被其吡喃糖氧化酶氧化，生成过氧化氢，形成的过氧化氢与4安替比林和HSDA在过氧化氢酶作用下形成一种水溶性的蓝色醌类物质，在583NM处有特征吸收值。借助96孔黑色微孔板和酶标仪，筛选高产D阿洛糖的菌株或高效的催化用酶，为基础和应用研究。
10、提供宝贵的菌种和酶资源。0010另一方面，D阿洛糖被吡喃糖氧化酶作用形成的过氧化氢与DAB作用生成不溶于水的褐色吩嗪聚合体，可以用于固体培养基中指示D阿洛糖的生成。同样可以用于高效菌株和酶的筛选。0011本发明的技术路线技术路线1液体反应液中（1）将固体培养基上长出的单菌落或者一种纯化后的酶转入到含有液体培养基和转化底物的96深孔培养板中，每个孔对应一个单菌落或一种酶，用硅胶盖盖好，培养024小时；（2）将96深孔培养板利用冷冻离心机进行离心，去除菌体；（3）将96深孔培养板中的上清液与HSDA、4安替比林、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶在96孔板中反应，37保温20分钟；（4）将反应结束的96孔板。
11、板利用酶标仪测定583NM处的光吸收值，并将测得的吸收值与标准曲线进行比对，计算D阿洛糖的浓度。0012技术路线2固体培养基上（1）利用培养基将待筛选样品进行活化培养1224小时；（2）将富集培养的混合菌利用无菌水进行稀释，获得单菌落，涂布到表面有灭菌醋酸纤维素薄膜的固体培养基上，培养618小时；（3）将长有单菌落的醋酸纤维素薄膜揭下置于一干净的培养皿中；（4）制备转化显色胶含有DAB、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶和转化底物的琼脂糖凝胶；（5）将溶融态的转化显色胶倒入步骤（7）所得的培养皿里，转化显色胶冷凝后覆盖在醋酸纤维素薄膜上，37保温，实时观察胶上的褐变效应。0013本发明的优点（1）效率高。
12、，吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联能够快速检测D阿洛糖的含量；（2）通量高，96深孔培养板和96孔板板结合酶标仪一起使用，大大提高了筛选的速度，固体培养基上的筛选也很直观，一个平板可以同时筛选上百个单菌落；（3）操作简便，检测过程不需要任何危险试剂的参与，反应条件温和，显色结果灵敏；（4）成本低，能够以较低成本获得大量菌种。说明书CN104195219A3/4页5具体实施例0014实施例1步骤在96孔板上依次加入1G/LD阿洛糖50L，150L试剂A，吡喃糖氧化酶和过氧化氢酶液100L，总体积300L。对照组加10G/LD阿洛酮糖。设置酶标仪温度为37，读取021MIN的583NM光吸收值。从时间。
13、变化图（附图1）中可以看出，随着时间的增加，光吸收值增加，因此可以设定一个合适的时间观测点，如反应开始后20MIN为检测的时间点。此外，对照组的光吸收值一直非常低，可以认为，反应底物D阿洛酮糖对检测无干扰。0015实施例2利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测D阿洛糖的标准曲线。0016步骤在96孔板上依次加入0、02、04、06、08和10G/LD阿洛糖50L，150L试剂A，吡喃糖氧化酶和过氧化氢酶液100L，总体积300L。设置酶标仪温度为37，读取20MIN的583NM光吸收值（附图2）。R20997，说明D阿洛糖在一定范围内与测定的AB583NM值呈显著线性关系。0017实施例3液。
14、体反应体系中筛D阿洛糖的生产菌步骤固体培养基上培养含有待筛选L鼠李糖异构酶及其突变体的大肠杆菌，将得到的单菌落转接到含有液体培养基LB（添加抗生素AMP和IPTG）和底物10G/L的DPSICOSE的96深孔培养板中，每个孔接种一个单菌落，用硅胶盖盖好，37培养12小时；将96深孔培养板离心，取上清液50L转入96孔板中，加入含HSDA、4安替比林的溶液A以及含吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的溶液，37保温20分钟，再在583NM测光吸收。对照组用液体培养基LB（添加抗生素AMP和IPTG）代替培养液上清参加反应，测583NM的光吸收（附图3）。对照组的光吸收值在21MIN内一直很低，可以认为液体培。
15、养基（LBAMPIPTG）对检测无干扰。0018实施例4固体培养基上的D阿洛糖的生产菌的筛选步骤在固体培养基LB含抗生素AMP和IPTG表面覆盖一层灭过菌的硝酸纤维素薄膜，并在薄膜上涂布含有待筛选L鼠李糖异构酶及其突变体的大肠杆菌，待单菌落长出后，将膜揭下置于一干净的培养皿中；预制溶融状态的含DAB、转化底物D阿洛酮糖、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的显色胶，覆盖到长有单菌落的硝酸纤维素薄膜上冷凝，至于37的培养箱中实时观测上述膜上各菌落生产D阿洛糖的进程（附图4）。0019实施例5液体反应体系中筛D阿洛酮糖3差向异构酶和L鼠李糖异构酶的双酶共表达工程菌步骤构建D阿洛酮糖3差向异构酶和L鼠李糖异构酶。
16、的双酶共表达工程菌，以D果糖为底物，转化生产D阿洛糖。将固体培养基上培养含有待筛选D阿洛酮糖3差向异构酶和L鼠李糖异构酶的双酶共表达工程菌，将得到的单菌落转接到含有液体培养基LB（添加抗生素AMP和IPTG）和底物100G/L的D果糖的96深孔培养板中，每个孔接种一个单菌落，用硅胶盖盖好，37培养12小时；将96深孔培养板离心，取上清液50L转入96孔板中，加入含HSDA、4安替比林的溶液A以及含吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的溶液，37保温20分钟，再在583NM测光吸收。对照组用液体培养基（LB添加抗生素AMP、IPTG和100G/L的D果糖）代替培养液上清参加反应，测583NM的光吸收（附图5。
17、）。对照组的光吸收值在21MIN内一直很低，可以认为液体培养基对检测无干扰。说明书CN104195219A4/4页60020附图表说明附图1D阿洛糖（DALLOSE）和D阿洛酮糖（DPSICOSE）吸光随时间变化的曲线附图2双酶偶联法检测D阿洛糖的标准曲线附图3液体培养基（LBAMPIPTG）的吸光值随时间的变化曲线附图4固体培养基上的D阿洛糖的生产菌的筛选附图5液体培养基（LBAMPIPTGD果糖100G/L）的吸光值随时间的变化曲线。说明书CN104195219A1/3页7图1图2说明书附图CN104195219A2/3页8图3图4说明书附图CN104195219A3/3页9图5说明书附图CN104195219A。