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1、(10)授权公告号 CN 102805078 B (45)授权公告日 2013.07.31 CN 102805078 B *CN102805078B* (21)申请号 201210297803.9 (22)申请日 2012.08.20 A01N 3/00(2006.01) (73)专利权人 中国热带农业科学院橡胶研究所 地址 571737 海南省儋州市宝岛新村 (72)发明人 吴春太 黄华孙 李维国 高新生 张晓飞 王祥军 (74)专利代理机构 海口翔翔专利事务有限公司 46001 代理人 莫臻 (54) 发明名称 用于 RNA 提取的橡胶树叶片短期保存方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于。
2、 RNA 提取的橡胶树叶片 短期保存方法, 是采集处于小古铜期、 大古铜期、 变色期或淡绿期的橡胶树嫩叶, 装进离心管中, 加 入储藏缓冲液, 然后将离心管放入装有冰块、 温度 为 0 4的冰盒或冰桶中, 带回实验室后, 搁置 在温度为 0 4的冰块上, 待用。本发明利用储 藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片 组织, 可有效地实现短时间保持橡胶树叶片的新 鲜度, 便于远距离采样、 材料运输和贮存, 具有工 艺简单、 成本低、 效果好等特点, 提高了样品 RNA 提取质量的保险性。 (51)Int.Cl. 审查员 周伟 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102805078 B CN 102805078 B *CN102805078B* 1/1 页 2 1. 一种用于 RNA 提取的橡胶树叶片短期保存方法, 其特征是采集处于小古铜期、 大古 铜期、 变色期或淡绿期的橡胶树嫩叶, 装进 10 50ml 离心管, 分 2 次加入 5 25ml 储藏 缓冲液, 然后将离心管放入装有冰块、 温度为 0 4的冰盒或冰桶中, 带回实验室后, 搁置 在温度为 0 4的冰块上, 待用 ; 所述储藏缓冲液是将 Sodium Borate、 Na-EGTA、 PV。
4、P-40、 DTT 和蔗糖加入到无菌水中配制而成, 其中各组分的含量为 : Sodium Borate 150 250mM、 Na EGTA 7.5 12.5mM、 PVP-40 2 4%、 DTT 10 20mM、 蔗糖 3 5%, 其中 PVP-40、 蔗糖 含量为质量体积比含量。 权 利 要 求 书 CN 102805078 B 2 1/5 页 3 用于 RNA 提取的橡胶树叶片短期保存方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域, 涉及一种叶片组织保存方法, 具体是一种用于 RNA 提 取的橡胶树叶片短期保存方法。 背景技术 0002 橡胶树 (Hevea spp.) 是大戟科 (。
5、Euphorbiaceae) 橡胶树属 (Hevea) 多年生的异 花授粉乔木, 为热带地区产胶的特种林木, 是一类重要的经济作物。我国已具规模的天然 橡胶基地主要分布在海南、 云南和广东 3 省。从上世纪 90 年代开始, 随着分子生物学的 迅速发展, 橡胶树的研究也逐渐进入分子水平。从转录水平上对橡胶树产量、 抗逆、 生长 发育和代谢等相关基因表达及调控进行研究, 是橡胶树表达数量性状基因座 (expression quantitative traitlocus, eQTL) 定位、 转基因育种、 转基因品种鉴定、 辅助育种等工作的 一种重要手段, 而获取高质量的总 RNA 是开展分离基因。
6、和分析基因表达特性等分子生物学 研究的重要基础。 0003 目前, 提取橡胶树叶片基因组RNA的常规方法主要有热硼酸/蛋白酶K法和CTAB/ 酸酚法, 两种方法所提 RNA 浓度和纯度均能达到后续的 cDNA 文库构建或 PCR 扩增等分子生 物学实验的要求。离子型去污剂 SDS、 DOC 和 CTAB 都是通过使蛋白质变性, 破坏膜结构及解 开与核酸相连接的蛋白质, 从而实现核酸游离在裂解体系中。但用热硼酸 / 蛋白酶 K 法提 取的 RNA 的纯度更高、 质量更好, 原因是橡胶树组织富含酚类物质, 而选用硼酸缓冲液体系 的 RNA 提取液有利于去除组织中的酚类物质, 其中的硼酸可以与酚类化。
7、合物依靠氢键形成 复合物, 抑制了酚类物质的氧化及其与 RNA 的结合。 0004 在提取植物叶片 RNA 的研究中, 常规方法多采用新鲜或冷冻的材料。提取 RNA 的 材料应当尽量保持新鲜, 样品保存的好坏, 将直接影响 RNA 的提取效果。因此胶园采集新鲜 材料时最好携带液氮罐、 干冰箱、 冰盒或冰桶, 但在实际工作中, 有时由于远距离采样无法 携带液氮罐, 而可携带的干冰箱、 冰盒或冰桶的缺点是维持时间短, 不能满足取样的需要, 此时植物样品的保存成为决定其 RNA 的结构保持完整与否的一个关键步骤。 0005 当满足试验要求的样品运回实验室后最好及时提取 RNA, 有时试验上的安排无法。
8、 对新鲜材料及时提取 RNA, 冷冻是保持植物样品组织成分最有效的方式之一, 目前冷冻主要 集中在超低温保存, -80冰箱保存的样品所提的总 RNA 的质量和数量都与新鲜叶片相当。 但野外携带液氮或干冰采样存在价格昂贵、 罐体笨重、 操作繁琐、 易挥发、 危险性高等缺点, 未能达到简单、 经济、 安全、 高效等效果。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于 RNA 提取的橡胶树叶片短 期保存方法, 其利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织, 可有效地实 现短时间保持橡胶树叶片的新鲜度, 便于远距离采样、 材料运输和贮存, 有效地提高了样品 RNA 提取。
9、质量的保险性。 说 明 书 CN 102805078 B 3 2/5 页 4 0007 本发明所采用的技术原理 : 硼酸盐缓冲液 ( 四硼酸钠 , Sodium Borate, SBX, PH9.0) 提供一个缓冲环境, 防止核酸被破坏, 研究表明, 提取缓冲液中含有的硼酸在弱碱 性条件下可以与酚类以氢键形成复合物, 抑制酚类物质的氧化及其与 RNA 的结合, 同时具 有防腐朽菌、 蛀虫作用, 用于橡胶木的浓度为 30 50mM ; EGTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子, 抑制 RNase 活性 ; 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 是一种高分子合成树脂, 可溶于水、 乙醇及氯仿, 工业上 常用。
10、作澄清剂、 稳定剂, 能络合多酚类物质, 防止多酚物质氧化成醌类物质, 避免溶液变褐 而具有抗氧化作用 ; 二硫苏糖醇 (DTT) 是常用还原剂, 具有与 - 巯基乙醇同样的抗氧化 作用, 可有效地防止橡胶树叶片中酚类物质的氧化, 避免褐变, 有助于酚的去除, 但 DTT 和 - 巯基乙醇相比, DTT 的刺激性气味要小很多, 毒性也比 - 巯基乙醇低很多, 而且 DTT 比 - 巯基乙醇的浓度低 7 倍时, 两者效果相近, 仅 DTT 价格略高一些。蔗糖 (Sucrose) 为叶 片提供碳源, 离体叶片自养能力较差, 就难免会影响其生理代谢, 蔗糖经熬煮和高压灭菌后 就会分解成叶片细胞能够直。
11、接吸收的葡萄糖和果糖形式。 0008 本发明所采用的技术方案 : 0009 一种用于 RNA 提取的橡胶树叶片短期保存方法, 是采集处于小古铜期、 大古铜期、 变色期或淡绿期的橡胶树嫩叶, 装进 10 50ml 离心管, 分 2 次加入 5 25ml 储藏缓冲 液, 然后将离心管放入装有冰块、 温度为 0 4的冰盒或冰桶中, 带回实验室后, 搁置在 温度为 0 4的冰块上, 待用。所述储藏缓冲液是将 Sodium Borate、 Na-EGTA、 PVP-40、 DTT 和蔗糖加入到无菌水中配制而成, 其中各组分的含量为 : Sodium Borate 150 250mM、 Na EGTA 7。
12、.5 12.5mM、 PVP 2 4%(W V) 、 DTT 10 20mM、 蔗糖 3 5%(W V) , 其 中 PVP、 蔗糖含量为质量体积比含量。 0010 根据保存周期长短确定样品处理方式 : 0011 1、 短期保存 : 需将样品管装入封口袋内, 写上标签, 待所有样品处理完毕统一放 置。对于试验安排在异地进行的研究, 材料的寄送是不可缺少的一个环节, 针对在 RNA 水平 上进行基因组学研究的实验, 只要将上述准备好的样品放置配备了冰袋的泡沫箱里 (0 4) , 盖严箱子, 用胶带密封, 即使路上耽误, 高温天气, 冰袋也溶化, 一周后, 收到的样品仍 然保持绿色。 0012 2。
13、、 长期保存 : 倒去储藏缓冲液, 旋紧管盖, 放入盛有液氮的容器, 该处理主要是保 护 RNA 不降解, 待所有样品充分冷冻后统一放置 -70 -80冰箱 ; 样品随时可取用, 具备 携带液氮取样 -80保存或液氮冷冻过的新鲜叶片同样的效果。 0013 本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织, 可有效地实 现短时间保持橡胶树叶片的新鲜度, 便于远距离采样、 材料运输和贮存, 具有工艺简单、 成 本低、 效果好等特点, 提高了样品 RNA 提取质量的保险性。 附图说明 0014 图 1 为利用热硼酸 / 蛋白酶 K 法提取的橡胶树叶片组织总 RNA 电泳图谱。 0015 图。
14、中 : 1 为新鲜叶片, 2 为采用本发明方法短期保存叶片。 0016 图 2 为利用 CTAB/ 酸酚法提取的橡胶树叶片总 RNA 效果检测图。 0017 图中 : 1 为采用携带液氮采样后经超低温长期保存的叶片, 2 为采用本发明储藏缓 冲液短期保存及液氮速冻后经超低温长期保存的叶片。 说 明 书 CN 102805078 B 4 3/5 页 5 具体实施方式 0018 下面结合实施例, 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明, 但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法 , 通 常按照常规条件 , 或按照制造厂商所建议的条件。 0019 一。
15、、 缓冲液调配 0020 为提高储藏缓冲液的质量, 缓冲液需要调配, 对配方中五个主要因素各按三个水 平进行试验 (见表 1) 。寻求到最佳的水平组合, 保证缓冲液有效、 经济。采用该组配方配制 叶片组织保存储藏缓冲液。 储藏缓冲液配制后, 在121的高压下蒸气灭菌15min, 但因DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理, DTT 配制后过滤除菌, PVP-40 和 DTT 临用前加入储藏 缓冲液。 0021 表 1 储藏缓冲液五因子正交试验设计表 0022 0023 二、 叶片保存 0024 将采集到的嫩叶装进 10 50ml 离心管, 加入 5 25ml 储藏缓冲液, 放入随身携 。
16、带的冰盒或冰桶内 (0 4) , 带回实验室后, 倒去储藏缓冲液, 旋紧管盖, 放入盛有液氮的 容器中速冻 3 5min, 最后放置 -70 -80冰箱长期保存。需要寄送的样品, 先补充一定 量的储藏缓冲液, 旋紧管盖, 将样品管装入封口袋内, 写上标签, 待所有样品处理完毕统一 放置配备了冰袋的泡沫箱里, 盖严箱子, 用胶带密封, 外用纸箱包实, 打包带捆紧。 0025 三、 RNA 提取 0026 实施例一 说 明 书 CN 102805078 B 5 4/5 页 6 0027 1. 将经过短期或长期保存的样品, 分别从储藏缓冲液和冰箱 (-70 -80 ) 中 取出 1g 新鲜的叶片, 。
17、将叶片放入预冷研钵中, 液氮中研磨成细粉末, 转入两个 5ml 离心管 中。 (0.5g 左右就需要 1 个 5ml 离心管) 0028 2. 每个 5ml 管中加入 2.5ml 预热到 80的提取缓冲液 (200mM Sodium Borate PH9.0、 30mM EGTA、 1% SDS、 10mM DTT、 1% DOC、 2% PVP-40), 匀桨 2 min。( 匀桨转头先用 DEPC-H2O 多洗几次, 至少 3 次 ) 0029 3. 将匀桨液转入加有 200l 20mg/ml 蛋白酶 K 的新离心管中, 在 42摇床中以 100rpm 转速温浴 1.5h。 0030 4.。
18、 加入 500l 1.6mol/L KCl, 至终浓度 160mmol/L, 冰浴 1h。 0031 5. 4、 12000rpm 离心 20min, ( 或 4、 10000rpm 离心 30min) 转移上清到另一新 管, 弃沉淀。 0032 6. 上清中加入 1/2 体积 6mol/L LiCl, 至终浓度 2mol/L, -20沉淀 2h。 0033 7. 4、 12000rpm 离心 20min, 保留沉淀, 弃上清。 0034 8. RNA 沉淀用 70% 乙醇沉涤两次, 4、 10000rpm 离心 15min, 弃上清。 0035 9. 4、 12000rpm 离心 5min,。
19、 弃上清。 0036 10. 真空干燥后再加入 100l 的 DEPC-H2O 使之充分溶解。 0037 11. 4、 12000rpm 离心 10min, 将上清转移到另一新管, 弃沉淀。 0038 12. 取 1l 用琼脂糖电泳检测 RNA 质量, 其余 RNA 于 -70下保存。 0039 注 : PVP-40 和 DTT 试剂在临用前加入。 0040 实施例二 0041 1. 将野外采集或外地寄送过来的样品从泡沫盒中取出, 或从 -70 -80冰箱中 取出的样品, 选取 800mg 橡胶树新鲜的幼嫩组织于研钵中, 加液氮充分研磨成粉末状, 转移 到 10ml 离心管中。 0042 2.。
20、 往 离 心 管 中 加 入 4ml 的 RNA 提 取 液 (1.4mol/L NaCl、 0.1mol/L Tris HCl(PH8.0 灭菌后加) 、 20mmol/L EDTA、 2% CTAB、 2% PVP、 1%(V/V) -Me (用时加) , 上 述除Tris HCl外其余药品先用0.1% DEPC-H2O配制, 摇晃12hs,再灭菌, 然后加入0.1mol/ L Tris, 用HCl调节PH值至8.0, 320l -Me, 振荡混匀, 65水浴约30min, 中途混和2-3 次。 0043 3. 再加入 0.6 倍体积的氯仿, 来回充分混匀, 然后冰浴 10min。 004。
21、4 4. 4、 9000rpm 离心 20min, 将上清液转移到另一新 10ml 离心管中。 0045 5. 再用等体积氯仿抽提一次, 4、 9000rpm 离心 20min。 0046 6. 上清液中加入 1/3 倍体积 (900l) 的 8mol/L LiCl(加终浓度为 0.1% DEPC 摇晃 12hs 后灭菌) 溶液, 混和均匀, 然后 -20 2h 以上。 0047 7. 4、 10000rpm 离心 20min, 弃去上部溶液, 沉淀用 70% 乙醇 (用灭菌后的 0.1% DEPC-H2O 配制) 沉涤, 并转移到一个 2ml 离心管中。 0048 8. 4000rpm 离心。
22、 5min, 吸去乙醇溶液, 用真空泵将沉淀抽干。 0049 9. 加1200l的H2O-DEPC溶解沉淀, 再加入1/3倍体积 (400l) 的8mol/L LiCl 溶液, 混和均匀, 然后 -20 1h 以上。 0050 10. 4、 9000rpm 离心 20min, 收集 RNA 沉淀。 说 明 书 CN 102805078 B 6 5/5 页 7 0051 11. RNA 沉淀用 70% 乙醇沉涤两次, 真空干燥后再加入 80l 的 DEPC-H2O 使之充 分溶解取 1l 用琼脂糖电泳检测 RNA 质量, 其余 RNA 于 -70下保存。 0052 注 : 器皿 240烘烤 4h。
23、s, 塑料器材用 0.1% DEPC-H2O 处理 24hs, 配制好的 0.1% DEPC-H2O 在 37下摇晃 2hs 后灭菌。 0053 四、 RNA 纯度和浓度的测定 0054 1、 紫外光吸收检测 : 取 1ul RNA 稀释至 200ul, 在紫外分光光度计上测定总 RNA 在 260nm 和 280nm 处的吸光值, 根据 A260/A280 确定 RNA 纯度。根据 260nm 处测定的光吸收值 估测样品 RNA 的浓度。结果见表 2。 0055 表 2 RNA 样品检测信息 0056 0057 2、 琼脂糖凝胶电泳检测 : 取 1ul 样品在含溴化乙锭 (EB) 的 1.2。
24、% 琼脂糖凝胶中进 行电泳, 电泳缓冲液为1TAE, 泳动速率为7V/cm, 紫外灯下观察RNA的质量和大致分子量。 0058 紫外分光仪分析表明来自新鲜叶片的 RNA 各检测指标分别为 28S:18S=1.4, OD260/280=2.03, OD260/230=2.06,本 方 法 保 存 叶 片 所 得 RNA 的 28S:18S=1.5, OD260/280=2.05, OD260/230=2.24, 两者间质量无显著差异, 不论质量还是数量, 两种不同 来源叶片均获得了完全满足后续试验要求的样品。基因组 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果见 图 1、 图 2, 图 1 为采用热硼酸 / 蛋白酶 K 法提取的橡胶树基因组 RNA 电泳图谱, 图 2 为采用 CTAB/ 酸酚法提取的 RNA 效果检测图。 0059 以上所述仅是本发明的优选实施方式, 应当指出, 对于本技术领域的普通技术人 员来说, 在不脱离本发明技术原理的前提下, 还可以做出若干改进和润饰, 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102805078 B 7 1/1 页 8 图 1图 2 说 明 书 附 图 CN 102805078 B 8 。