技术领域
本公开内容涉及适于给予成人和儿童受试者的包括神经组分的营养组合物。神经组分可包括磷脂酰乙醇胺(“PE”)、鞘磷脂、胞苷二磷酸-胆碱(“CDP-胆碱”)、神经酰胺、尿苷、至少一种神经节苷脂及其两种或更多种的混合物。神经组分提供累加和/或协同的有益的健康益处，包括增强脑发育和改善记忆、认知、手眼协调和提高注意力。
此外，本公开内容涉及通过提供包含本文所述的神经组分的营养组合物来促进脑和神经系统健康的方法。
背景技术
脑只占总体重的2%，但却是使用高达30%每日热量和营养的需求性器官(Harris, J.J.等, The Energetics of CNS White Matter (CNS白质动能学). Jour. of. Neuroscience, Jan. 2012: 32(1): 356-371。人脑和神经系统在出生前生命的极早期就开始形成，且两者继续发育直到3岁左右。这种早期发育可对整个脑和神经系统健康具有终身作用。因此，脑营养物由于其促进早期脑发育并预防和保护脑和神经系统免遭损伤或疾病的能力，可以是婴儿、儿童和妊娠期和哺乳期妇女饮食中的重要添加剂。此外，脑营养物对成人是重要的，因为许多营养物促进神经系统修复，并提供神经保护健康益处。
许多营养物被认为参与支持健康的脑发育。然而，最近发现PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、神经酰胺和尿苷促进人脂肪来源的干细胞(“hADSC”)和人神经元干细胞(“hNSC”)的神经发生和/或神经元分化。
PE是存在于生物膜中的脂质，并且是动物和植物组织中第二最丰富的磷脂。它是膜双层的关键组件，存在于所有活细胞中，虽然在人类生理学中，它特别存在于神经组织例如脑白质、神经、神经组织和脊髓组织中。例如，PE可占脑磷脂的多达45%。在动物组织中，PE可以二酰基、烷基酰基和烯基酰基形式存在。此外，与其它磷脂(例如磷脂酰胆碱)相比，动物PE可含有较大部分的花生四烯酸(“ARA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。
鞘磷脂是指存在于动物细胞膜中，特别是存在于神经细胞轴突周围的髓鞘中的一类鞘脂。在人中，鞘磷脂通常构成10%-20%的质膜脂质。鞘磷脂被认为起电隔绝神经细胞轴突的作用，因为它构成围绕和隔绝中枢神经系统细胞的髓鞘的总脂质的25%。
CDP-胆碱是天然存在的化合物，是磷脂酰胆碱(一种脑组织灰质的主要组分)合成的必需中间体。磷脂酰胆碱构成总细胞磷脂的约50%，并占灰质脑组织的高达30%。CDP-胆碱是从胆碱产生磷脂酰胆碱的中间体。CDP-胆碱通过胆碱-磷酸-胞苷转移酶由P-胆碱和胞苷三磷酸(“CTP”)生物合成。CDP-胆碱的形成是磷脂代谢途径中最慢的步骤，从而限制了整个途径。因此，CDP-胆碱的细胞浓度在磷脂生物合成调节中是关键的。由CDP-胆碱代谢产生的胞苷和胆碱，能够跨过血脑屏障，并进入中枢神经系统，它们在此可掺入神经元细胞膜的磷脂部分。
神经酰胺是指由鞘氨醇和脂肪酸组成的脂质分子家族。一般来说，长链鞘氨醇类碱基(sphingoid base)通过酰胺键与脂肪酸连接。形成神经酰胺作为所有复杂鞘脂生物合成中的关键中间体。从哺乳动物细胞中已表征了超过200种结构上截然不同的神经酰胺的分子类别。神经酰胺存在于细胞膜中，它在膜中通常优先浓缩成为横向的液态有序微结构域，通常称为“筏”或“富神经酰胺平台”。这些神经酰胺筏在组成上显著不同于在由鞘磷脂或胆固醇组成的细胞膜上的其它结构域。
尿苷是存在于核糖核酸中的4种基本核苷之一。在人的饮食中，尿苷作为尿苷-5-一磷酸(“UMP”)存在。UMP还存在于哺乳动物的乳中。研究越来越多地表明，尿苷是神经生长和发育必不可少的。此外，尿苷是成人脑运作的必需营养物。此外，尿苷是胞苷的膳食源，胞苷是细胞膜和磷脂酰胆碱两者的组件，而磷脂酰胆碱是记忆所必需的，并且是细胞膜的主要组分。
神经节苷脂是由鞘糖脂与一个或多个在糖链上连接的唾液酸部分(例如n-乙酰神经氨酸)组成的化合物。神经节苷脂由疏水神经酰胺部分和亲水寡糖链组成，并且是质膜的组分。结构上，神经节苷脂以称为“筏”的结构集中在细胞膜表面上。
需要包含神经组分的营养组合物以支持脑和神经系统健康。神经组分包括以下的至少一种：PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、尿苷、神经酰胺或神经节苷脂。这些营养组合物可具有累加和/或协同的神经系统健康益处。此外，本公开内容涉及通过提供包含神经组分的营养组合物来促进和支持脑和神经系统健康的方法。
发明内容
简单地说，在一个实施方案中，本公开内容涉及包含神经组分的营养组合物，所述神经组分包括以下的至少一种：PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、神经酰胺、尿苷和/或至少一种神经节苷脂。
在某些实施方案中，营养组合物还可包含DHA、叶黄素、玉米黄质、白藜芦醇、胆固醇或其一种或多种的混合物。认为这些营养物可与神经组分的营养物一起协同作用以促进神经发生。
此外，在一些实施方案中，营养组合物可任选包含以下的一种或任何组合：ARA、益生元、益生菌、铁源、乳铁蛋白和/或β-葡聚糖。
在一个实施方案中，由于在生命的最初几年间的关键性脑发育所致，营养组合物是婴儿配方奶粉或儿童营养组合物。本文所述的营养组合物可用作药物或营养补剂以促进患有神经变性疾病和/或脑损伤的受试者的神经健康。此外，本公开内容的营养组合物可提供神经保护健康益处，并促进整体脑和神经系统健康。
在一些实施方案中，本公开内容涉及促进脑和神经系统健康的方法，所述方法包括向目标受试者提供包含神经组分的营养组合物。
要了解，前面的一般性描述和下面的详细描述两者提供本公开内容的实施方案，并意在提供用于理解如所要求保护的本公开内容的性质和特征的概观或框架。这类描述用来解释所要求保护的主题的原理和操作。本公开内容的其它和更多的特征和优势在阅读下面的公开内容时对于本领域技术人员将容易是显而易见的。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一张彩印绘图。根据要求并支付必要费用后，专利局将提供含彩图的本专利或专利申请公开文本的复本。
图1A是在无处理的神经元分化条件下hADSC的相衬显微照片。hADSC的形态表示未分化的情况，其具有大且扁平的形态，以及没有明显的神经突向外生长(neurite outgrowth)。
图1B是形成类似于双极、三极和多极神经细胞的形态的hADSC的相衬显微照片。
图2A是含有未用神经组分或DHA处理的hADSC的对照孔的相衬显微照片。(阴性对照)。
图2B是含有用DHA处理的hADSC的对照孔的相衬显微照片。
图2C是在用来源于植物的PE处理后的第2天hADSC的相衬显微照片。
图2D是在用来源于牛的PE处理后的第2天hADSC的相衬显微照片。
图2E是用来源于植物的PE与DHA协同处理后的第2天hADSC的相衬显微照片。
图3A是含有未用神经组分处理的hADSC的对照孔的相衬显微照片。
图3B是在用来源于牛的鞘磷脂处理后的第2天hADSC的相衬显微照片。
图3C是在用来源于脱脂乳的鞘磷脂处理后的第2天hADSC的相衬显微照片。
图4A是hADSC与DHA的对照孔的相衬显微照片。
图4B是未用神经组分或DHA处理的hADSC的对照孔的相衬显微照片。
图4C是用CDP-胆碱处理后hADSC的相衬显微照片。
图4D是用CDP-胆碱和10μM DHA处理后hADSC的相衬显微照片。
图4E是无处理的hNSC的倒置荧光显微照片。
图4F是hNSC与DHA的倒置荧光显微照片。
图4G是hNSC与CDP-胆碱的倒置荧光显微照片。
图4H是用CDP-胆碱和其它脑营养物处理后hNSC的倒置荧光显微照片，其它脑营养物包括DHA、N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、尿苷、胆固醇、白藜芦醇和纯化的或天然形式的叶黄素。
图5A是在暴露于DHA之后hADSC的相衬显微照片。
图5B是在暴露于N(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇后hADSC的相衬显微照片。
图5C是无神经组分或DHA处理的hADSC的相衬显微照片。
图5D是在用乳糖苷神经酰胺处理后hADSC的相衬显微照片。
图5E是在用N-辛酰基-D-苏型鞘氨醇处理后hNSC的倒置荧光显微照片。
图5F是在用DHA处理后hNSC的倒置荧光显微照片。
图5G是在用N-辛酰基-D-苏型鞘氨醇和DHA处理后hNSC的倒置荧光显微照片。
图5H是无神经组分或DHA处理的hNSC的倒置荧光显微照片。
图5I是在用N-辛酰基-D-苏型鞘氨醇和其它脑营养物处理后hNSC的倒置荧光显微照片，其它脑营养物包括DHA、CDP-胆碱、胆固醇、白藜芦醇、尿苷和叶黄素。
图6A是无神经组分或DHA处理的hADSC的相衬显微照片。
图6B是在转换到含尿苷的神经分化培养基后3小时观察到的用尿苷处理后的hADSC的相衬显微照片。
图6C是用尿苷处理后hNSC的倒置荧光显微照片。
图6D是用尿苷和其它脑营养物处理后hNSC的倒置荧光显微照片，其它脑营养物包括N-辛酰基-D-苏型鞘氨醇、DHA、CDP-胆碱、胆固醇、白藜芦醇、叶黄素。
用于实施本发明的最佳方式
下面将详细提及本公开内容的实施方案，下文简述了其一个或多个实例。各个实例通过解释本公开内容的营养组合物来提供，并且不是限制。实际上，对于本领域技术人员将是显而易见的是，可在不偏离本公开内容的范围的情况下对本公开内容的教义进行各种修改和变动。例如，作为一个实施方案的一部分阐明和描述的特征，可与另一个实施方案一起使用以产生又一个实施方案。
因此，预期本公开内容涵盖落入随附权利要求书的范围的这类修改和变动及其等同内容。本公开内容的其它目的、特征和方面公开于下面的详细描述，或从下面的详细描述来看是显而易见的。本领域普通技术人员要了解，本论述只是示例性实施方案的描述，并无意限制本公开内容的更宽泛的方面。
本公开内容总的来说涉及包含神经组分的营养组合物，其中神经组分可包含PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、神经酰胺、尿苷、至少一种神经节苷脂或其一种或多种的混合物。此外，本公开内容涉及通过向目标受试者提供含有本文所述神经组分的营养组合物以支持和促进脑和神经系统健康、神经发生和神经保护和认知发育的方法。
“营养组合物”意指满足受试者的营养需要的至少一部分的物质或制剂。术语“营养品”、“营养配方奶粉”、“肠内营养品”和“营养补剂”在整个公开内容中使用作为营养组合物的非限制性实例。而且，“营养组合物”可指液体剂、散剂、凝胶剂、糊剂、固体剂、浓缩剂、混悬剂或即用型的肠内配方奶粉、口服配方奶粉、婴儿配方奶粉、儿童受试者配方奶粉、儿童配方奶粉、成长乳和/或成人配方奶粉。
术语“肠内”意指通过或在胃肠道或消化道内可递送的。“肠内给予”包括经口进食、胃内进食、经幽门给予或任何其它给予进入消化道。“给予”比“肠内给予”更广义，包括胃肠外给予或使物质进入受试者身体的任何其它给予途径。
“神经组分”是指通过促进或抑制神经发生而影响神经发生的一种或多种化合物或组合物。因此，在一些实施方案中，神经组分促进神经发生，而在其它实施方案中，神经组分抑制或减少神经发生。
“儿童受试者”意指小于13岁的人。在一些实施方案中，儿童受试者是指介于出生和8岁之间的人类受试者。在其它实施方案中，儿童受试者是指介于1和6岁之间的人类受试者。在又一个实施方案中，儿童受试者是指介于6和12岁之间的人类受试者。术语“儿童受试者”可指如下所述的婴儿(早产儿或足月儿)和/或儿童。
“婴儿”意指年龄范围从出生到不满1岁的人类受试者，包括0-12个月校正年龄的婴儿。短语“校正年龄”意指婴儿的实足年龄减婴儿提早出生的时间量。因此，如果婴儿受孕至足月，则校正年龄是婴儿的年龄。术语婴儿包括低初生体重婴儿、极低初生体重婴儿和早产儿。“产早儿”意指妊娠第37周结束前出生的婴儿。“足月儿”意指妊娠第37周结束后出生的婴儿。
“儿童”意指年龄范围为12个月到约13岁的受试者。在一些实施方案中，儿童是年龄介于1和12岁之间的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童”是指介于1和约6岁之间或介于约7和约12岁之间的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童”是指介于12个月和约13岁之间的任何年龄范围。
“儿童营养制品”是指满足儿童的至少一部分营养需要的组合物。成长乳是儿童营养制品的一个实例。
“婴儿配方奶粉”意指满足婴儿营养需要的至少一部分的组合物。在美国，21 C.F.R.第100、106和107章阐述的联邦法规规定了婴儿配方奶粉的内含物。这些法规限定尽力模拟人母乳的营养和其它性质的常量营养物、维生素、矿物质和其它成分水平。
术语“成长乳”是指预期用作不同饮食的一部分以支持年龄介于约1和约6岁之间的儿童的正常成长和发育的一大类营养组合物。
“营养完全的”意指可用作唯一的营养来源的组合物，其可供应基本上所有每日必需量的维生素、矿物质和/或痕量元素以及蛋白质、碳水化合物和脂质。实际上，“营养完全的”描述了提供支持受试者的正常成长和发育所需要的足量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量的营养组合物。
因此，按定义，对早产儿是“营养完全的”营养组合物提供质量上和数量上足量的早产儿生长所需要的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
按定义，对足月婴儿是“营养完全的”的营养组合物提供足月婴儿生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
按定义，对儿童是“营养完全的”的营养组合物可提供儿童生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
当应用于营养物时，术语“必需”是指机体无法以足用于正常生长和维持健康的量合成，因此必须通过饮食供应的任何营养物。术语“条件必需”在应用于营养物时意指在机体出现无法获得用于内源合成的足量的前体化合物的条件下必须通过饮食供应的营养物。
“益生菌”意指对于宿主健康发挥至少一种有益作用的致病性低或无致病性的微生物。
术语“灭活益生菌”意指这样的益生菌，其中所提及的益生菌生物体的代谢活性或繁殖能力遭降低或破坏。然而，“灭活益生菌”在分子水平上的确仍保持至少一部分其生物糖蛋白和DNA/RNA结构。本文所用术语“灭活”是“无活力”的同义词。更具体地说，灭活益生菌的非限制性实例是灭活鼠李糖乳杆菌GG (“LGG”)或“灭活LGG”。
“益生元”意指通过选择性刺激消化道中可促进宿主健康的一种或数量有限的细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主的不消化的食物成分。
“β-葡聚糖”意指所有的β-葡聚糖，包括特定类型的β-葡聚糖，例如β-1,3-葡聚糖或β-1,3;1,6-葡聚糖。而且，β-1,3;1,6-葡聚糖是β-1,3-葡聚糖的一种类型。因此，术语“β-1,3-葡聚糖”包括β-1,3;1,6-葡聚糖。
本文所用的“非人乳铁蛋白”意指由人母乳以外的来源产生或获得的乳铁蛋白。在一些实施方案中，非人乳铁蛋白是具有不同于人乳铁蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的乳铁蛋白。在其它实施方案中，用于本公开内容的非人乳铁蛋白包括由遗传修饰的生物体产生的人乳铁蛋白。本文所用术语“生物体”是指任何连续的生命系统，例如动物、植物、真菌或微生物。
本文所用的所有的百分比、分数和比率以总制剂的重量计算，除非另有说明。
本公开内容的营养组合物可基本不含本文所述的任何任选的或所选择的成分，条件是其余的营养组合物仍含有本文所述的所有必需成分或特征。在这种情况下，且除非另有说明，否则术语“基本不含”意指所选的组合物可含有小于有用量的任选成分，通常小于0.1%重量，而且还包括0%重量的所述任选的或所选择的成分。
对本公开内容的单数特性或限制的所有提及应包括相应的复数特性或限制，反之亦然，除非另有说明或在作出提及的上下文中明确说明与之相反。
可以任何顺序进行本文所采用的方法或过程步骤的所有组合，除非另有说明或在作出所提及的组合的上下文中明确说明与之相反。
本公开内容的方法和组合物(包括其组分)，可包含本文所述实施方案的必需要素和限制以及本文或别处描述的可用于营养组合物的任何额外或任选的成分、组分或限制；由由本文所述实施方案的必需要素和限制以及本文或别处描述的可用于营养组合物的任何额外或任选的成分、组分或限制组成；或基本由它们组成。
本文所用术语“约”应解释为是指任何范围的端点所指定的两个数字。对范围的任何提及应视为对该范围内的任何子集提供支持。
脑和神经系统的发育在个体的整体健康和良好状态中起决定性作用。因此，本公开内容的营养组合物促进脑和神经系统健康。实际上，提供本文所述神经组分可促进NSPC迁移和信号转导、增加多巴胺受体密度、支持防止记忆减退、减少凋亡细胞数、降低神经元变性、增加整体脑代谢并降低氧化应激。在某些实施方案中，神经组分和DHA的组合具有支持脑和神经系统发育和健康的累加和/或协同的有益作用。
如上所述，神经组分可选自PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、神经酰胺、尿苷、至少一种神经节苷脂及其至少两种或更多种的混合物。
适于包含在神经组分中的PE的实例包括但不限于1,2-二芥酰基(Dierucoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-花生四烯酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸乙醇胺、N,1-二花生四烯酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸乙醇胺和在1和/或2位含有任何脂肪酸的磷酸乙醇胺。
在一些实施方案中，PE可以约3.7 mg/100 kcal-约37 mg/100 kcal的量存在。在其它实施方案中，PE可以约10 mg/100 kcal-约30 mg/100 kcal的量存在。在另外其它的实施方案中，PE可以约15 mg/100 kcal-约25 mg/100 kcal的量存在。
鞘磷脂在营养组合物的神经组分中可以约0.15 mg/100 kcal-约73 mg/100 kcal的量存在。在其它实施方案中，鞘磷脂在营养组合物中以约2.9 mg/100 kcal-约29.6 mg/100 kcal的量存在。在另外其它的实施方案中，鞘磷脂在营养组合物中以约11.1 mg/100 kcal-约18.5 mg/100 kcal的量存在。
适于包含在营养组合物的神经组分中的鞘磷脂的实例包括但不限于神经酰胺磷酰胆碱和神经酰胺磷酸乙醇胺、N-油酰基鞘磷脂、N-硬脂酰基鞘磷脂和/或D-赤型N-棕榈酰基鞘磷脂及其混合物。例如，在一个实施方案中，神经组分中所包括的鞘磷脂可以是按照Rochlin等人的美国专利7,687,652方法制备的合成鞘磷脂，然而，本公开内容还可包括生产合成鞘磷脂的其它方法。
当CDP-胆碱存在于神经组分中时，可以约7 mg/100 kcal-约295 mg/100 kcal的量存在。在其它实施方案中，CDP-胆碱可以约20 mg/100 kcal-约76 mg/100 kcal存在。在另外其它的实施方案中，CDP-胆碱可以约35 mg/100 kcal-约50 mg/100 kcal存在。
可将合成CDP-胆碱掺入神经组分中。例如，在一些实施方案中，CDP-胆碱可按照Maruyama等人的美国专利6,387,667的方法制备，然而，本公开内容还可包括生产合成CDP-胆碱的其它方法。
在一些实施方案中，神经酰胺可以约2.2 mg/100 kcal-约22 mg/100 kcal的量存在于营养组合物的神经组分中。在其它实施方案中，神经酰胺可以约4.4 mg/100 kcal-约16.3 mg/100 kcal的量存在。在另一个实施方案中，神经酰胺可以约7.4 mg/100 kcal-约14.8 mg/100 kcal的量存在。在另外其它的实施方案中，神经酰胺可以约9.6 mg/100 kcal-约13.3 mg/100 kcal的量存在。
适于包含在本文公开的营养组合物的神经组分中的神经酰胺的实例包括N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、N-(R,S)α-羟基十二烷酰基-D-赤型-鞘氨醇或乳糖苷神经酰胺及其组合或混合物。
在一些实施方案中，尿苷可以约0.15 mg/100 kcal-约37 mg/100 kcal的量存在于营养组合物的神经组分中。在其它实施方案中，尿苷以约0.7 mg/100 kcal-约11.1 mg/100 kcal的量存在。在另一个实施方案中，尿苷以约2.9 mg/100 kcal-约17.7 mg/100 kcal的量存在于营养组合物中。在另外其它的实施方案中，尿苷以约14.7 mg/100 kcal-约22.2 mg/100 kcal的量存在。在仍另外的实施方案中，尿苷以约25.9 mg/100 kcal-约37 mg/100 kcal的量存在。
本文所用的尿苷包括但不限于尿苷-5-一磷酸(“UMP”)、尿苷二磷酸、尿苷二磷酸葡糖醛酸和/或尿苷5’-三磷酸及其混合物。
神经组分还可包含至少一种神经节苷脂。至少一种神经节苷脂可以约0.9 mg/100 kcal-约14.8 mg/100 kcal的量存在于营养组合物中。在其它实施方案中，至少一种神经节苷脂可以约3 mg/100 kcal-约10 mg/100 kcal的量存在。在仍其它的实施方案中，至少一种神经节苷脂可以约5 mg/100 kcal-约7.8 mg/100 kcal的量存在。
此外，包括在营养组合物的神经组分中的神经节苷脂可选自本领域已知的那些，其可与本文公开的营养组合物的其它组分相容，包括但不限于一唾酸神经节苷酯、二唾酸神经节苷脂、三唾酸神经节苷脂、四唾酸神经节苷脂、五唾酸神经节苷脂及其组合。本文所用的其它神经节苷脂包括所有的神经节苷脂功能等同物、神经节苷脂源、神经节苷脂代谢物和/或神经节苷脂前体。
神经节苷脂通常用速记命名系统限定，其中“G”是指神经节苷脂，“M”、“D”、“T”、“Q”和“P”分别是指一-、二-、三-、四-和五-唾酸神经节苷脂，下标数字1、2、3等是指薄层层析上神经节苷脂迁移的顺序。下标“a”、“b”和“c”表示通过糖基转移酶和唾液酸转移酶转化成更复杂的神经节苷脂的级数。因此，在一些实施方案中，神经节苷脂可选自GM3、GM2、GM1、GD3、GD2、GD1a、GD1b、GT3、GT2、GT1、GT1b、GQ1b、GP1及其组合。在其它实施方案中，神经节苷脂可包含GM1、GD1a、GD1b、GT1b和GQ1b及其混合物。
在一个具体的实施方案中，营养组合物中所包括的神经组分的至少一种神经节苷脂可包含GD3和GM3。在该实施方案中，GD3可包含营养组合物的总神经节苷脂的约20%-40%，GM3可包含营养组合物的总神经节苷脂的约20%和40%。在另一个实施方案中，GD3可包含营养组合物的总神经节苷脂的约30%，GM3可包含营养组合物的总神经节苷脂的约30%。
在又一个实施方案中，神经节苷脂包含GM3和GD3。在该实施方案中，GM3神经节苷脂可具有22:0、18:0、16:0和24:0的主要脂肪酸组成。同样，GD3神经节苷脂可具有18:0、16:0、19:0和22:0的主要脂肪酸组成。在一些实施方案中，存在于本公开内容的营养组合物中的神经节苷脂上的约30%-60%的脂肪酸具有20个或更多个碳原子的链长。在其它实施方案中，存在于本公开内容的营养组合物中的神经节苷脂上的约35%-50%的脂肪酸具有20个或更多个碳原子的链长。在某些实施方案中，本公开内容的神经节苷脂的脂肪酸选自长链多不饱和脂肪酸、油酸、含16个或更少个碳原子的脂肪酸及其组合。
在一些实施方案中，营养组合物可包含N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、N-(R,S)α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇和/或CDP-胆碱且另外包括以下的至少一种：DHA、尿苷、胆碱、胆固醇、白藜芦醇或叶黄素及其混合物。认为N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、N-(R,S)α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇和/或神经酰胺与这些营养物的至少一种的组合可促进神经发生。
营养组合物的神经组分中所包括的营养物可与营养组合物中的其它成分一起配制以为目标受试者提供合适的营养水平。在一些实施方案中，包含神经组分的营养组合物是适于支持正常生长且还有益于脑发育的营养完全的配方奶粉。在某些其它的实施方案中，设计神经组分中营养物的组成和浓度以模拟对人早期发育是健康的水平。
营养组合物中所包括的神经组分的营养物可包括功能等同物、来源、代谢物和/或前体。所述神经组分的营养物可能是天然存在的、合成的或通过生物体和/或植物的基因操作开发的，不论所述来源是现在已知的还是以后开发的。
本文所述神经组分的营养物源可以是不论强化与否的牛奶、其它乳制品、大豆、肉、蛋、鳕鱼、麦胚、甘蔗提取物、马铃薯、绿花椰菜、面包酵母、内脏肉、其它植物和任何其它资源，从中可获得神经组分的营养物，并可用于营养组合物中。优选，神经组分的营养物源应为具有食物来源的或微生物产生的食品级。此外，神经组分的营养物源可以是复杂混合物的一部分，所述复杂混合物通过目的在于富集这类复杂混合物的神经组分营养物的衍生物或前体的本领域已知的分离和纯化技术获得。
此外，神经酰胺可来源于本领域已知的获得磷脂酰胆碱的任何来源。虽然神经组分中所包括的神经酰胺可来源于植物或牛来源，但是优选植物来源。
此外，神经组分中一定量的营养物可固有地存在于已知成分中，例如常用于制备营养组合物的天然油、碳水化合物源或蛋白质源。在一些实施方案中，根据添加和固有的神经组分源两者，计算本文所述神经组分的浓度和比率。
此外，可通过本领域众所周知的任何方法，将神经组分加入或掺入营养组合物中。在一些实施方案中，可将神经组分加入营养组合物以补充营养组合物。例如，在一个实施方案中，可将神经组分加入市购可得的婴儿配方奶粉中。例如Enfalac、Enfamil?、Enfamil?早产儿配方奶粉、含铁Enfamil?、Enfamil? LIPIL?、Lactofree?、Nutramigen?、Pregestimil?和ProSobee? (可获自Mead Johnson & Company，Evansville，IN，U.S.A)中可补充合适水平的神经组分，且可用于本公开内容的实践中。
在其它实施方案中，神经组分可代替不含神经组分的营养物的另一种营养物源。例如，一定量的不含神经组分的脂肪源可用含有神经组分的营养物的另一种脂肪源替换。在另外其它的实施方案中，可改变通常添加到营养组合物中的成分来源，使得所选择的来源提供常添加到营养组合物的成分和神经组合物的营养物两者。
在一些实施方案中，可将神经组分包括在产前膳食补充剂中。可通过本领域已知的任何方法将神经组分掺入产前膳食补充剂中。产前给予神经组分可直接影响胎儿和胚胎的发育。因为脑发育在产前生命早期开始，因此产前膳食补充剂中包括神经组分可促进仍在子宫内时儿童受试者的脑发育和神经发生。
适宜地，可使用市购可得的产前膳食补充剂和/或产前营养制品。例如Expecta?补充剂(可获自Mead Johnson & Company, Evansville, Ind., U.S.A.)中可补充合适水平的神经组分，并可用于本公开内容的实践中。
可以每日一个或多个剂量给予产前膳食补充剂。在一些实施方案中，可以每日两个剂量给予产前膳食补充剂。在一个单独的实施方案中，以每日3个剂量给予产前膳食补充剂。可将产前膳食补充剂给予怀孕妇女或哺乳妇女。
本公开内容考虑了任何口服可接受的剂型。所述剂型的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软凝胶剂、液体剂、液体浓缩剂、散剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、锭剂、珠粒剂、扁囊剂及其组合。或者，可将本发明的产前膳食补充剂加入更完全的营养制品中。在该实施方案中，营养制品可含有蛋白质、脂肪和碳水化合物组分，并可用于补充饮食或可用作唯一的营养来源。
在一些实施方案中，营养组合物包含至少一种碳水化合物源。碳水化合物源是可用于本领域的任一种，例如乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精、蔗糖、淀粉、稻米糖浆固体等。营养组合物中碳水化合物组分的量通常可在约5 g/100 kcal和约25 g/100 kcal之间变化。在一些实施方案中，碳水化合物的量介于约6 g/100 kcal和约22 g/100 kcal之间。在其它实施方案中，碳水化合物的量介于约12 g/100 kcal和约14 g/100 kcal之间。在一些实施方案中，优选玉米糖浆固体。而且，水解、部分水解和/或充分水解的碳水化合物由于其易消化性包括在营养组合物中可能是合乎需要的。具体而言，水解的碳水化合物不太可能含有变应原表位。
适用于本文的碳水化合物材料的非限制性实例包括来源于玉米、木薯、稻或马铃薯的水解或完整的、天然或化学改性的淀粉，其呈蜡或非蜡形式。合适的碳水化合物的非限制性实例包括称为水解玉米淀粉、麦芽糖糊精、麦芽糖、玉米糖浆、右旋糖、玉米糖浆固体、葡萄糖和各种其它葡萄糖聚合物及其组合的各种水解淀粉。其它合适的碳水化合物的非限制性实例包括通常称为蔗糖、乳糖、果糖、高果糖玉米糖浆、不消化的寡糖(例如果寡糖)及其组合的那些。
而且，本公开内容的营养组合物可包含至少一种蛋白质源。蛋白质源是可用于本领域的任一种，例如脱脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可用于实施本公开内容的牛奶蛋白质源包括但不限于牛奶蛋白质粉、牛奶蛋白浓缩物、牛奶蛋白分离物、脱脂乳固体、脱脂乳、脱脂奶粉、乳清蛋白、乳清蛋白分离物、乳清蛋白浓缩物、甜乳清、酸乳清、酪蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钠钙、酪蛋白酸钙)、大豆蛋白及其任何组合。
在营养组合物的一个具体实施方案中，蛋白质源的乳清:酪蛋白比率与存在于人母乳中的类似。在一个实施方案中，蛋白质源包含约40%-约85%乳清蛋白和约15%-约60%酪蛋白。
在一些实施方案中，营养组合物包含约1 g-约7 g蛋白质源/100 kcal。在其它实施方案中，营养组合物包含约3.5 g-约4.5 g蛋白质/100 kcal。
在一些实施方案中，营养组合物的蛋白质作为完整蛋白质提供。在其它实施方案中，蛋白质作为完整蛋白质和水解蛋白两者的组合提供，其水解度介于约4%和10%之间。在某些其它的实施方案中，蛋白质是较大量水解的。在另外其它的实施方案中，蛋白质源包含氨基酸。在又一个实施方案中，蛋白质源中可补充含谷氨酰胺的肽。在另一个实施方案中，蛋白质组分包含充分水解的蛋白质。在又一个实施方案中，营养组合物的蛋白质组分基本由充分水解的蛋白质组成以使食物变态反应的发生降到最低。
在一些实施方案中，营养组合物的蛋白质组分包含部分或充分水解的蛋白质，例如来自牛奶的蛋白质。可将蛋白质用酶处理以分解一些或大部分的引起不良症状的蛋白质，其目的在于降低变态反应、耐受不良和致敏作用。而且，蛋白质可通过本领域已知的任何方法水解。
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白质。在这种情况下，术语“基本不含”意指本文优选的实施方案包含足够低浓度的完整蛋白质因此赋予配方奶粉低变应原性。本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白质(由此低变应原性)的程度通过2000年8月美国儿科学会政策声明(August 2000 Policy Statement of the American Academy of Pediatrics)确定，其中低变应原配方奶粉定义为在适当的临床研究中证实当在前瞻性随机双盲安慰剂对照试验中给予时，在90%的患有经证实的牛奶变态反应的婴儿或儿童中不引起反应(置信度为95%)的配方奶粉。
在一些实施方案中，营养组合物可不含蛋白质，并包含游离氨基酸作为蛋白质等同来源。在一些实施方案中，氨基酸可包含但不限于组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、肉碱、牛磺酸及其混合物。在一些实施方案中，氨基酸可以是支链氨基酸。在某些其它的实施方案中，可包括小的氨基酸肽作为营养组合物的蛋白质组分。所述小的氨基酸肽可以是天然存在的或合成的。营养组合物中游离氨基酸的量可由约1 g/100 kcal到约5 g/100 kcal变化。
营养组合物还可包含脂肪源。本公开内容的营养组合物的合适的脂肪或脂质来源可以是本领域已知的或使用的任一种，包括但不限于动物源，例如乳脂、奶油、乳脂肪、蛋黄脂质；海洋源，例如鱼油、海产油、单细胞油；蔬菜和植物油，例如玉米油、油菜油(canola oil)、向日葵油、大豆油、棕榈油、椰子油、高油酸向日葵油、月见草油、菜籽油、橄榄油、亚麻仁(亚麻籽)油、棉籽油、高油酸红花油、棕榈硬脂酸甘油酯、棕榈仁油、麦胚芽油；中链甘油三酯油和脂肪酸的乳液和酯；及其任何组合。
在一个实施方案中，营养组合物可含有一种或多种益生菌。本领域已知的任何益生菌在该实施方案中都是可接受的。在一个具体的实施方案中，益生菌可选自任何的乳杆菌属(Lactobacillus)菌种鼠李糖乳杆菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC号53103)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌种长双歧杆菌BB536 (Bifidobacterium longum BB536) (BL999，ATCC：BAA-999)、长双歧杆菌AH1206 (NCIMB：41382)、短双歧杆菌AH1206 (Bifidobacterium breve AH1205) (NCIMB：41387)、婴儿双歧杆菌35624 (Bifidobacterium infantis 35624) (NCIMB：41003)和动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12) (DSM No. 10140)或其任何组合。
如果包括在组合物中，则益生菌的量可由约1 x 104到约1.5 x 1010 cfu的益生菌/100 kcal，更优选由约1 x 106到约1 x 109 cfu的益生菌/100 kcal变化。在某些其它的实施方案中，益生菌的量可由约1 x 107 cfu/100 kcal到约1 x 108 cfu/100 kcal变化。
在一个实施方案中，益生菌可以是有活力的或无活力的。本文所用术语“有活力的”是指活的微生物。术语“无活力的”或“无活力的益生菌”意指无生命的益生菌微生物、其细胞组分和/或其代谢物。所述无活力的益生菌可能被热杀或以别的方式灭活，但是它们保持有利地影响宿主健康的能力。可用于本公开内容的益生菌可能是天然存在的、合成的或通过生物体的基因操作开发的，不论所述来源是目前已知的还是以后开发的。
在某些实施方案中，营养组合物还可含有一种或多种益生元(亦称益生元源)。益生元可刺激摄入的益生菌微生物的生长和/或活性、选择性降低存在于肠中的病原体、并有利地影响肠的短链脂肪酸分布。所述益生元可能是天然存在的、合成的或通过生物体和/或植物的基因操作开发的，不论这种新的来源是目前已知的还是后来开发的。可用于本公开内容的益生元可包括寡糖、多糖，和含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的其它益生元。
更具体地说，可用于本公开内容的益生元可包括聚葡萄糖、聚葡萄糖粉、乳果糖、乳蔗糖、棉子糖、葡-寡糖、菊糖、果-寡糖、异麦芽-寡糖、大豆寡糖、乳蔗糖、木-寡糖、壳-寡糖、甘露-寡糖、阿拉伯-寡糖、唾液酸-寡糖、岩藻-寡糖、半乳-寡糖和龙胆-寡糖。在一些实施方案中，存在于营养组合物中的益生元的总量可为约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在某些实施方案中，存在于营养组合物中的益生元的总量可为约0.3 g/100 kcal-约0.7 g/100 kcal。而且，营养组合物可包含含有聚葡萄糖(“PDX”)和/或半乳-寡糖(“GOS”)的益生元组分。在一些实施方案中，益生元组分包含至少20% GOS、PDX或其混合物。
在一个实施方案中，如果PDX用于益生元组合物中，则营养组合物中PDX的量的范围可为约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中，聚葡萄糖的量的范围为约0.2 g/100 kcal-约0.6 g/100 kcal。而在另外其它的实施方案中，营养组合物中PDX的量可为约0.1 mg/100 kcal-约0.5 mg/100 kcal或约0.3 mg/100 kcal。
在一个实施方案中，如果GOS用于益生元组合物中，营养组合物中GOS的量可为约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中，营养组合物中GOS的量可为约0.2 g/100 kcal-约0.5 g/100 kcal。在其它实施方案中，营养组合物中GOS的量可为约0.1 mg/100 kcal-约1.0 mg/100 kcal或约0.1 mg/100 kcal-约0.5 mg/100 kcal。
在营养组合物的一个具体实施方案中，与GOS组合给予PDX。在该实施方案中，可以介于约9:1和1:9之间的PDX:GOS的比率给予PDX和GOS。在另一个实施方案中，PDX:GOS的比率可介于约5:1和1:5之间。在又一个实施方案中，PDX:GOS的比率可介于约1:3和3:1之间。在一个具体的实施方案中，PDX与GOS的比率可为约5:5。在另一个具体的实施方案中，PDX与GOS的比率可为约8:2。
在一个具体的实施方案中，将GOS和PDX以至少约0.2 mg/100 kcal或约0.2 mg/100 kcal-约1.5 mg/100 kcal的总量补充到营养组合物中。在一些实施方案中，营养组合物可包含总量为约0.6-约0.8 mg/100 kcal的GOS和PDX。
如所注意到的，所公开的营养组合物可包含β-葡聚糖源。葡聚糖是多糖，具体而言是葡萄糖的聚合物，其是天然存在的并且可存在于细菌、酵母、真菌和植物的细胞壁中。Beta葡聚糖(β-葡聚糖)本身是不同子集的葡萄糖聚合物，其由通过β型糖苷键连接起来以形成复杂的碳水化合物的葡萄糖单体链构成。
β-1,3-葡聚糖是碳水化合物聚合物纯化形式，例如酵母、蘑菇、细菌、藻或谷类(Stone BA, Clarke AE. Chemistry and Biology of (1-3)-Beta-Glucans ((1-3)-β-葡聚糖的化学和生物学). London:Portland Press Ltd; 1993. London:Portland Press Ltd；1993)。β-1,3-葡聚糖的化学结构取决于β-1,3-葡聚糖源。而且，各种生理化学参数，例如溶解度、一级结构、分子量和分支，在β-1,3-葡聚糖的生物活性中起作用。(Yadomae T., Structure and biological activities of fungal beta-1,3-glucans (真菌β-1,3-葡聚糖的结构和生物活性). Yakugaku Zasshi. 2000;120:413-431)。
β-1,3-葡聚糖是天然存在的多糖，含或不含存在于各种植物、酵母、真菌和细菌的细胞壁中的β-1,6-葡萄糖侧链。β-1,3;1,6-葡聚糖是含有具有在(1,6)位连接的侧链并带有(1,3)键的葡萄糖单元的葡聚糖。β-1,3;1,6葡聚糖是具有结构共性的一组异源葡萄糖聚合物，包括通过β-1,3键链接的直链葡萄糖单元骨架与从该骨架延伸的β-1,6连接的葡萄糖分支。虽然这是本发明所述β-葡聚糖类别的基本结构，但可能存在一些变化。例如，某些酵母β-葡聚糖具有从β(1,6)分支延伸的β(1,3)分支的其它区域，这进一步增加了其相应结构的复杂性。
来源于面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的β-葡聚糖由在1和3位连接的D-葡萄糖分子链组成，其具有在1和6位上连接的葡萄糖侧链。酵母来源的β-葡聚糖是不溶性纤维样复糖，具有如下总体结构：含β-1,3骨架的葡萄糖单元直链，中间散布着长度一般为6-8个葡萄糖单元的β-1,6侧链。更具体地说，来源于面包酵母的β-葡聚糖是聚-(1,6)-β-D-吡喃葡糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖。
此外，β-葡聚糖在儿童受试者中耐受性良好，不产生或引起过量产气、腹胀、胃气胀或腹泻。将β-葡聚糖添加至营养组合物中用于儿童受试者，例如婴儿配方奶粉、成长乳或其它儿童营养制品，可通过提高针对侵入的病原体的抗性并因此维持或改进整体健康，来提高受试者的免疫应答。
在一些实施方案中，营养组合物中β-葡聚糖的量介于约3 mg/100 kcal和约17 mg/100 kcal之间。在另一个实施方案中，β-葡聚糖的量介于约6 mg/100 kcal和约17 mg/100 kcal之间。
在一些实施方案中，营养组合物可包含β-1,3;1,6-葡聚糖。β-1,3;1,6-葡聚糖可来源于面包酵母。营养组合物可包含全葡聚糖颗粒β-葡聚糖、微粒β-葡聚糖、PGG-葡聚糖(聚-1,6-β-D-吡喃葡糖基-1,3-β-D-吡喃葡萄糖)或其任何混合物。
本公开内容的营养组合物可包含乳铁蛋白。乳铁蛋白是含有1-4个聚糖的约80 kD的单链多肽，这取决于物种。不同物种的乳铁蛋白的3-D结构非常相似，但不相同。各乳铁蛋白包含2个同源叶，称为N-叶和C-叶，分别是指分子的N端和C端部分。各叶另外还由2个亚叶或结构域组成，其形成三价铁离子(Fe3+)与碳酸(氢)根阴离子协同配合在其中紧密结合的裂口。这些结构域分别称为N1、N2、C1和C2。乳铁蛋白的N端具有负责多个重要结合性质的强阳离子肽区域。乳铁蛋白具有非常高的等电点(~pI 9)，且其阳离子性质在其防御细菌、病毒和真菌病原体的能力中起重要作用。在介导乳铁蛋白针对各种微生物的生物活性的乳铁蛋白N端区内，有几簇阳离子氨基酸残基。
用于本公开内容的乳铁蛋白可从例如非人动物乳中分离或通过遗传修饰的生物体产生。在一些实施方案中，本文所述口服电解质溶液可包含非人乳铁蛋白、通过遗传修饰的生物体产生的非人乳铁蛋白和/或通过遗传修饰的生物体产生的人乳铁蛋白。
用于本公开内容的合适的非人乳铁蛋白包括但不限于与人乳铁蛋白的氨基酸序列具有至少48%同源性的那些。例如，牛乳铁蛋白(“bLF”)具有与人乳铁蛋白有约70%序列同源性的氨基酸组成。在一些实施方案中，非人乳铁蛋白与人乳铁蛋白具有至少65%同源性，而在一些实施方案中，有至少75%同源性。用于本公开内容可接受的非人乳铁蛋白包括而不限于bLF、猪乳铁蛋白、马乳铁蛋白、水牛乳铁蛋白、山羊乳铁蛋白、鼠乳铁蛋白和骆驼乳铁蛋白。
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物包含非人乳铁蛋白，例如bLF。bLF是属于铁转运蛋白或转移家族的糖蛋白。它从牛奶中分离，其中它作为乳清组分存在。在人乳铁蛋白和bLF的氨基酸序列、糖基化方式和铁结合能力间存在已知的差异。此外，存在涉及从牛奶中分离bLF的多个序贯加工步骤，其影响所得bLF制备物的生理化学性质。另据报道，人乳铁蛋白和bLF在其结合存在于人肠中的乳铁蛋白受体的能力上有差异。
虽然不希望受该理论或任何其它理论的束缚，但是认为与从奶粉分离的bLF相比，从全脂奶分离的bLF具有较少的最初结合的脂多糖(LPS)。此外，认为具有低体细胞计数的bLF具有较少的最初结合的LPS。具有较少最初结合的LPS的bLF具有在其表面上可获得的较多结合部位。这被认为有助于bLF与合适的位置结合，并破坏感染过程。
适于本公开内容的bLF可通过本领域已知的任何方法产生。例如在美国专利号4,791,193 (通过引用以其整体结合到本文)中，Okonogi等人公开了生产高纯度的牛乳铁蛋白的方法。一般来说，所公开的方法包括3个步骤。首先使原料乳与弱酸性阳离子交换体接触以吸收乳铁蛋白，接着是进行洗涤以除去未吸收物质的第二步。吸收步骤后是取出乳铁蛋白以产生纯化的牛乳铁蛋白。其它方法可包括美国专利号7,368,141、5,849,885、5,919,913和5,861,491中描述的步骤，其公开内容均通过引用以其整体予以结合。
用于某些实施方案的乳铁蛋白可以是自全脂乳分离和/或具有低体细胞计数的任何乳铁蛋白，其中“低体细胞计数”是指体细胞计数小于200,000个细胞/mL。举例来说，合适的乳铁蛋白可获自新西兰Morrinsville的Tatua Co-operative Dairy Co. Ltd.；荷兰Amersfoort的FrieslandCampina Domo或新西兰奥克兰的Fonterra Co-Operative Group Limited。
出乎意料的是，本文包括的乳铁蛋白保持某些杀细菌活性，即使暴露于低pH (即低于约7，甚至低到约4.6或更低)和/或高温(即高于约65℃，甚至高到约120℃)中，预期该条件破坏或严重限制人乳铁蛋白的稳定性或活性。在本文所述类型的营养组合物的某些加工方案(例如巴斯德灭菌法)期间，可预期这些低pH和/或高温条件。因此，甚至在加工方案后，乳铁蛋白具有针对存在于人肠中的有害细菌病原体的杀细菌活性。
在一些实施方案中，营养组合物可包含量为约25 mg/100 Lm-约150 mg/100 mL的乳铁蛋白。在其它实施方案中，乳铁蛋白以约60 mg/100 mL-约120 mg/100 mL的量存在。在另外其它的实施方案中，乳铁蛋白以约85 mg/100 mL-约110 mg/100 mL的量存在。
本公开内容的营养组合物还可含有长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”)源。合适的LCPUFA包括但不限于DHA、二十碳五烯酸(“EPA”)、ARA、亚油酸(18:2 n-6)、γ-亚麻酸(18:3 n-6)、n-6途径中的双高-γ-亚麻酸(20:3 n-6)、α-亚麻酸(18:3 n-3)、十八碳四烯酸(18:4 n-3)、二十碳四烯酸(20:4 n-3)、二十碳五烯酸(20:5 n-3)和二十二碳五烯酸(22:6 n-3)。
营养组合物中LCPUFA的量有利地为至少约5 mg/100 kcal，并且可从约5 mg/100 kcal到约100 mg/100 kcal、更优选从约10 mg/100 kcal到约50 mg/100 kcal变化。
LCPUFA源包括像蛋和乳脂的乳制品；海产油，例如鳕鱼、鲱鱼、沙丁鱼、金枪鱼和许多其它鱼；某些动物脂肪、猪油、牛脂和微生物油，例如真菌油和藻油，或来自从中可获得LCPUFA并用于营养组合物的强化或未强化的任何其它来源。LCPUFA可以是复杂混合物的一部分，所述复杂混合物通过本领域已知的目的在于富集所述混合物中的LCPUFA和LCPUFA的衍生物或前体的分离技术获得。
在营养组合物中可如下提供LCPUFA：以游离脂肪酸的酯形式；甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；磷酸甘油酯，包括卵磷脂；和/或其混合物。此外，在营养组合物中可以磷脂，尤其磷脂酰胆碱的形式提供LCPUFA。
在一个实施方案中，尤其如果营养组合物是婴儿配方奶粉，则营养组合物中补充了DHA和ARA两者。在该实施方案中，ARA:DHA的重量比可介于约1:3和约9:1之间。在一个具体的实施方案中，ARA:DHA的重量比为约1:2-约4:1。
在一些实施方案中，DHA以至少约17 mg/100 kcal有利地存在于营养组合物中，且可从约5 mg/100 kcal到约75 mg/100 kcal变化。在一些实施方案中，DHA以约10 mg/100 kcal-约50 mg/100 kcal存在。
可采用本领域已知的标准技术，在营养组合物中补充含有DHA和/或ARA的油。例如，可通过替换正常存在于组合物中等量的油(例如高油酸向日葵油)，将DHA和ARA加入组合物中。再举例来说，通过替换正常存在于没有DHA和ARA的组合物中的等量的其余的总脂肪混合物，将含有DHA和ARA的油加入组合物中。
DHA和/或ARA源如使用，则可以是本领域已知的任何来源，例如海产油、鱼油、细胞油、蛋黄脂质和脑脂质。在一些实施方案中，DHA和ARA来源于单细胞Martek油DHASCO?和ARASCO?，或其变化。DHA和ARA可呈天然形式，条件是LCPUFA源的其余部分不导致对婴儿有任何重大的有害作用。或者，DHA和ARA可以精练形式使用。
在一个实施方案中，DHA和ARA源是美国专利号5,374,567、5,550,156和5,397,591教导的单细胞油，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。然而，本公开内容不仅仅限于所述油。
此外，营养组合物的一些实施方案可模拟人母乳的某些性质。然而，为了实现一些受试者的特殊营养需要，与人乳相比，营养组合物可包含较高含量的某些营养组分。例如，营养组合物可包含比人母乳较高含量的DHA。营养组合物中DHA水平升高可补偿现有的营养性DHA缺乏。
在一些实施方案中，所公开的本文所述营养组合物还可包含有效量的铁。铁可包含囊化铁形式，例如囊化富马酸亚铁或囊化硫酸亚铁或较低反应性的铁形式，例如焦磷酸铁或正磷酸铁。
在一些实施方案中，本文公开的营养组合物另外包含叶黄素。除非另有说明，否则本文所用叶黄素是指游离叶黄素、叶黄素酯、叶黄素盐或本文所描述的或其它部分提出的相关结构的其它叶黄素衍生物的一种或多种。在一些实施方案中，叶黄素以约0.343 mg/100 kcal-约6.0 mg/100 kcal存在。在另外其它的实施方案中，叶黄素以约1.0 mg/100 kcal-约4.0 mg/100 kcal存在。
本公开内容的叶黄素源包括但不限于富含类葫萝卜素的植物来源，包括但不限于猕猴桃、葡萄、柑桔、马铃薯、西瓜、番木瓜和其它红色果实；或深色蔬菜，例如羽衣甘蓝、菠菜、萝卜叶、羽衣甘蓝叶、直立莴苣、花椰菜、西葫芦、豌豆和孢子甘蓝、菠菜和胡萝卜。此外，叶黄素源包括强化或未强化的其它植物和任何其它来源，从中可获得并用于营养组合物的叶黄素。叶黄素可以是复杂混合物的一部分，其通过本领域已知的目的在于富集所述混合物中叶黄素和叶黄素的衍生物或前体的分离技术获得。
用于本文的叶黄素包括已知用于口服营养品或另外为用于口服营养品的可接受来源的任何天然或合成来源，包括婴儿配方奶粉。叶黄素源作为单独的成分或以与包括以下来源的其它材料或来源的任何组合提供：例如多种维生素预混合物、混合的类胡萝卜素预混合物、纯的叶黄素源和婴儿配方奶粉固有的叶黄素组分。可根据添加和固有的叶黄素源两者，计算本文所述叶黄素的浓度和比率。在一个实施方案中，营养组合物是婴儿配方奶粉，其包含总叶黄素重量的至少约10%、25%，更优选约50%-约95%作为固有的叶黄素。在其它实施方案中，营养组合物是婴儿配方奶粉，优选包含总叶黄素重量的至少约85%叶黄素作为固有的叶黄素。
在某些实施方案中，营养组合物可包含玉米黄质。在一些实施方案中，玉米黄质可以约0.143 mg/100 kcal-约4.0 mg/100 kcal的量存在。在其它实施方案中，玉米黄质可以约0.50 mg/100 kcal-约3.0 mg/100 kcal的量存在。在另外其它的实施方案中，玉米黄质可以约1.5 mg/100 kcal-约2.5 mg/100 kcal的量存在。适于包括在营养组合物中的玉米黄质包括但不限于内消旋玉米黄质(3R，3’S)和其它立体异构体例如(3R，3R’)和(3S，3’S)。在一些实施方案中，营养组合物可包含叶黄素和玉米黄质。叶黄素与玉米黄质的比率可为95:5至5:95的范围。
胆固醇也可存在于本公开内容的营养组合物中。在一些实施方案中，胆固醇以约1 mg/100 kcal-约100 mg/100 kcal存在。在其它实施方案中，胆固醇以约5 mg/100 kcal-约25 mg/100 kcal的量存在于营养组合物中。在其它实施方案中，胆固醇以约15 mg/100 kcal-约40 mg/100 kcal存在。在另外其它的实施方案中，胆固醇以约50 mg/100 kcal-约75 mg/100 kcal的量存在于营养组合物中。
在一个实施方案中，本公开内容的胆固醇源包括但不限于从中可获得并用于营养组合物的胆固醇的强化或未强化的乳、其它乳制品、蛋、肉、牛脂、家禽、鱼、贝类和任何其它来源。胆固醇源还包括前体例如角鲨烯、羊毛甾醇、二甲基甾醇、methostenol、7-烯胆甾烷醇和链甾醇。胆固醇可以是复杂混合物的一部分，其通过本领域已知的目的在于富集所述混合物中的胆固醇和胆固醇的衍生物或前体的分离技术获得。
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物包含白藜芦醇。白藜芦醇可以约5 mg/100 kcal-约120 mg/100 kcal的量存在。在其它实施方案中，白藜芦醇可以约9 mg/100 kcal-约60 mg/100 kcal的量存在。
本公开内容的白藜芦醇源包括但不限于植物来源的提取物，包括但不限于苹果提取物和葡萄籽提取物。此外，适用于本公开内容的营养组合物的富含白藜芦醇的植物的非限制性实例包括：浆果(acai、葡萄、越橘(bilberry)、蓝莓(blueberry)、越橘(lingonberry)、黑醋栗、北美稠李、黑莓、覆盆子、樱桃、红醋栗、酸果蔓、岩高兰、兴安悬钩子、黑果越橘(whortleberry)、花楸浆果)、紫玉米、紫马铃薯、紫胡萝卜、红甘薯、红球甘蓝、茄子。白藜芦醇可以是复杂混合物的一部分，其通过本领域已知的目的在于富集所述混合物中的白藜芦醇和白藜芦醇的衍生物或前体的分离技术获得。
虽不受任何特殊理论的束缚，但是认为与神经组分组合的DHA、叶黄素、白藜芦醇和/或胆固醇可具有累加和/或协同的脑和神经系统健康益处。在某些实施方案中，包含DHA、叶黄素、胆固醇、乳脂和/或白藜芦醇及其混合物的营养组合物可与神经组分的营养物协同作用以促进神经细胞组织的神经发生。
所公开的营养组合物可以本领域已知的任何形式提供，例如粉剂、凝胶剂、混悬剂、糊剂、固体剂、液体剂、液体浓缩物、可复溶奶粉代用品或即用制品。在某些实施方案中，营养组合物可包含营养补剂、儿童营养制品、婴儿配方奶粉、人乳强化剂、成长乳或设计用于婴儿或儿童受试者的任何其它的营养组合物。本公开内容的营养组合物包括例如可口服摄入的促进健康的物质，包括例如食品、饮料、片剂、胶囊剂和散剂。而且，可使本公开内容的营养组合物标准化至特定的含热量，可作为即用制品提供，或可以浓缩形式提供。在一些实施方案中，营养组合物可呈粉末形式，其粒径范围为5 μm-1500 μm，更优选范围为10 μm-300 μm。
如果营养组合物为即用制品的形式，则营养组合物的重量摩尔渗透压浓度可介于约100和约1100 mOsm/kg水之间，更通常约200-约700 mOsm/kg水。
在某些实施方案中，营养组合物是低变应原。在其它实施方案中，营养组合物是犹太教食品和/或穆斯林教律的合法食物。在又一个实施方案中，营养组合物含有非遗传修饰的成分。在一个实施方案中，营养制剂不含蔗糖。营养组合物还可以不含乳糖。在其它实施方案中，营养组合物不含任何中链甘油三酯油。在一些实施方案中，组合物中不存在角叉菜胶。在其它实施方案中，营养组合物不含所有的树胶。
本公开内容的营养组合物不限于包含本文明确列举的营养物的组合物。任何营养物可作为组合物的部分递送用于满足营养需求的目的和/或使受试者的营养状态最优化。
而且，在一些实施方案中，营养组合物是营养完全的，含有是受试者的唯一营养来源的合适类型和适量的脂质、碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质。实际上，营养组合物可任选包括许多蛋白质、肽、氨基酸、脂肪酸、益生菌和/或其代谢副产物、益生元、碳水化合物和任何其它营养物或可向受试者提供许多营养和生理益处的其它化合物。此外，本公开内容的营养组合物可包含调味料、增味剂、甜味剂、色素、维生素、矿物质、治疗性成分、功能食品成分、食品成分、加工成分或其组合。
可使本公开内容的营养组合物标准化至特定的含热量，可作为即用制品提供，或可以浓缩形式提供。
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物是成长乳。成长乳是预期用于1岁以上(通常1-3岁、4-6岁或1-6岁)儿童的强化型基于牛奶的饮料。它们不是医用食品，并无意作为代餐或补充剂以解决特定的营养缺乏。取而代之的是，设计成长乳以期用作不同饮食的补充，为儿童获得所有的必需维生素和矿物质、常量营养物加其它功能性膳食组分(例如具有声称的促进健康性质的非必需营养物)的持续的每日摄取量提供额外的保障。
本公开内容的营养组合物的确切组成在市场之间可变化，这取决于地方法规和目标人群的饮食摄入量信息。在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物包括牛奶蛋白质源，例如全脂乳或脱脂乳，加上实现所需感官性能的添加的糖和甜味剂和添加的维生素和矿物质。脂肪组合物通常来源于乳品原材料。可设计总蛋白质的指标以与人乳、牛乳或下限值的相符。通常确定总的碳水化合物的指标以提供尽可能少的添加糖(例如蔗糖或果糖)以实现可接受的味道。通常，以符合地方性牛乳的营养基值的水平添加维生素A、钙和维生素D。此外，在一些实施方案中，可以提供膳食参考摄入量(DRI)的约20%或每份每日值(DV)的约20%的水平，添加维生素和矿物质。而且，根据已确定的预期人群的营养需求、原料基值和地区法规，营养值在市场间可变化。
还可以足以供应受试者每日营养需要的量将一种或多种维生素和/或矿物质加入营养组合物中。本领域普通技术人员要了解，维生素和矿物质需要将根据例如儿童的年龄而改变。例如，与年龄介于1岁和13岁之间的儿童相比，婴儿可具有不同的维生素和矿物质需要。因此，实施方案无意将营养组合物限于具体的年龄组，而是提供一定范围的可接受的维生素和矿物质组分。
在为儿童提供营养组合物的实施方案中，组合物可任选包括但不限于下列维生素或其衍生物的一种或多种：维生素B1 (硫胺、焦磷酸硫胺、TPP、三磷酸硫胺、TTP、盐酸硫胺、一硝酸硫胺)、维生素B2 (核黄素、黄素单核苷酸、FMN、黄素腺嘌呤二核苷酸、FAD、核黄素(lactoflavin)、核黄素(ovoflavin))、维生素B3 (烟酸、尼克酸、尼克酰胺、烟酰胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NAD、烟酸单核苷酸、NicMN、吡啶-3-甲酸)、维生素B3-前体色氨酸、维生素B6 (吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇)、泛酸(泛酸盐、泛醇)、叶酸盐(叶酸、叶酸(folacin)、蝶酰谷氨酸)、维生素B12 (钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷酰钴胺素、氰钴胺、羟钴胺素、腺苷酰钴胺素)、生物素、维生素C (抗坏血酸)、维生素A (视黄醇、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、与其它长链脂肪酸的视黄酯、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯)、维生素D (骨化醇、胆骨化醇、维生素D3、1,25,-二羟基维生素D)、维生素E (α-生育酚、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚烟酸酯、α-生育酚)、维生素K (维生素K1、叶绿醌、萘醌、维生素K2、甲基萘醌-7、维生素K3、甲基萘醌-4、甲萘醌、甲基萘醌-8、甲基萘醌-8H、甲基萘醌-9、甲基萘醌-9H、甲基萘醌-10、甲基萘醌-11、甲基萘醌-12、甲基萘醌-13)、胆碱、肌醇、β-胡萝卜素及其任何组合。
在提供儿童营养制品(例如成长乳)的实施方案中，组合物可任选包括但不限于以下矿物质或其衍生物的一种或多种：硼、钙、乙酸钙、葡糖酸钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、氯化物、铬、氯化铬、吡啶甲酸铬、铜、硫酸铜、葡糖酸铜、硫酸铜、氟化物、铁、羰基铁、三价铁、富马酸亚铁、正磷酸铁、铁研制剂、多糖铁、碘化物、碘、镁、碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硬脂酸镁、硫酸镁、锰、钼、磷、钾、磷酸钾、碘化钾、氯化钾、乙酸钾、硒、硫、钠、多库酯钠、氯化钠、硒酸钠、钼酸钠、锌、氧化锌、硫酸锌及其混合物。无机化合物的非限制性示例性衍生物包括任何无机化合物的盐、碱性盐、酯和螯合物。
可按以下盐的形式将矿物质加入成长乳或其它儿童营养组合物中：例如磷酸钙、甘油磷酸钙、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰和亚硒酸钠。可加入本领域已知的其它维生素和矿物质。
在一个实施方案中，儿童营养组合物可含有任何指定国家最大膳食推荐的每份约10和约50%之间，或可含一组国家平均膳食推荐的约10和约50%之间的维生素A、C和E、锌、铁、碘、硒和胆碱。在另一个实施方案中，儿童营养组合物可供应任何指定国家最大膳食推荐的每份量约10-30%，或一组国家平均膳食推荐的约10-30%的B-维生素。在又一个实施方案中，儿童营养制品中的维生素D、钙、镁、磷和钾水平可与存在于牛奶中的平均水平一致。在其它实施方案中，儿童营养组合物中的其它营养物的每份量可以任何指定国家最大膳食推荐的约20%，或一组国家平均膳食推荐的约20%存在。
本公开内容的营养组合物可任选包括下列矫味剂的一种或多种，包括但不限于调味提取物、挥发油、可可或巧克力调味料、花生酱调味料、饼干屑、香草或任何市购可得的调味料。有用的矫味剂的实例包括但不限于纯茴香提取物、仿制香蕉提取物、仿制樱桃提取物、巧克力提取物、纯柠檬提取物、纯橙提取物、纯薄荷提取物、蜂蜜、仿制菠萝提取物、仿制朗姆酒提取物、仿制草莓提取物、葡萄和或葡萄籽提取物、苹果提取物、越橘提取物或香草提取物；或挥发油，例如蜜蜂花油、月桂油、香柠檬油、雪松木油、樱桃油、肉桂油、丁子香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味料、香草饼干屑、奶油糖果、太妃糖及其混合物。矫味剂的量可根据所用的矫味剂而大幅变化。可按本领域已知，选择矫味剂的类型和量。
本公开内容的营养组合物可任选包括针对成品的稳定性可添加的一种或多种乳化剂。合适的乳化剂的实例包括但不限于卵磷脂(例如来自蛋或大豆的卵磷脂或任何其它的植物和动物源)、α乳白蛋白和/或甘油单酯和甘油二酯及其混合物。其它乳化剂对技术人员而言是容易显而易见的，合适的乳化剂的选择将部分取决于制剂和成品。
本公开内容的营养组合物可任选包括还可添加以延长制品保存限期的一种或多种防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠、EDTA二钠钙及其混合物。
本公开内容的营养组合物可任选包括一种或多种稳定剂。用于实施本公开内容的营养组合物的合适稳定剂包括但不限于阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐树胶、西黄蓍胶、琼脂、红藻胶、瓜尔胶、吉兰糖胶、刺槐豆胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、微晶纤维素、CMC (羧甲基纤维素钠)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、DATEM (甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯)、葡聚糖、角叉菜胶、CITREM及其混合物。
本公开内容还提供通过向目标受试者提供包含本文所述神经组分的营养组合物来促进脑和神经系统健康的方法。虽不受任何特殊理论的束缚，但认为提供包含神经组分的营养组合物将支持神经发生。
在一些实施方案中，目标受试者可以是儿童受试者。此外，在一个实施方案中，向儿童受试者提供的营养组合物可以是婴儿配方奶粉。添加至婴儿配方奶粉中的神经组分可选自特定来源，且可调节其浓度以使健康益处达到最大。在该方法的另一个实施方案中，向儿童受试者提供的包含神经组分的营养组合物是成长乳。
研究显示，总磷脂含量在阿尔茨海默病受累脑的额皮质和海马两者中显著降低(相应为20%和10%)。此外，研究人员观察到阿尔茨海默病受累脑的额皮质中PE和磷脂酰胆碱两者20%-30%的降低。因此，在一个实施方案中，可向诊断为阿尔茨海默病或另一种变性脑病症的目标受试者提供营养组合物。
在另一个实施方案中，可向已患、目前患有或未来可能患有脑和/或神经系统损伤的目标受试者提供营养组合物。在又一个实施方案中，可向任何目标受试者提供包含神经组分的营养组合物以促进神经保护。在另外其它的实施方案中，该方法涉及通过向孕妇或哺乳母亲提供包含神经组分的营养组合物以促进神经发生。此外，包含本文所述神经组分的营养组合物可向目标受试者提供补充源的神经营养。
涉及提供本文所述营养组合物的本公开内容的方法向其目标受试者提供提高的神经营养和健康益处。用于针对特定神经疾病或为特定目标受试者提供本文所述营养组合物的方法的公开内容不是限制性的，相反，它们还用作其中给予本文所述营养组合物是合适的实例。
实施例
提供实施例以说明包括在本文所述营养组合物的神经组分中的营养物的神经发生。简单地说，通过本文所述方法，测试了PE、鞘磷脂、CDP-胆碱、神经酰胺和尿苷对人脂肪来源的干细胞(“hACDSC”)和人神经元干细胞(“hNSC”)的神经发生能力。这些实施例不应解释为对本文公开的营养组合物的任何限制，而是用来说明神经组分的神经发生。预期本说明书以及实施例被视为只是示例性的，本公开内容的范围和精神受实施例后的权利要求书限定。Kuang等人提交的美国专利申请顺序号13/408,485和Kuang等人提交的美国专利申请顺序号13/408,490的方法可适于本公开内容的实践并因此通过引用结合到本文中。
实施例1
该实施例描述了与DHA和阴性对照相比由PE引起的hADSC的神经发生。
来自牛和植物的PE分别购自Matreya ? (目录号1069)和(目录号1301)。将来自牛的PE在100%乙醇中稀释为67.2mM。将来自植物的PE在100%乙醇稀释为67.6 mM。然后将这些溶液保存在4-8℃下。
hADSC购自美国加洲Carlsbad的Invitrogen，亦称Life Technologies，在100mm培养板中，在由含获自Invitrogen?的生长补充剂和L-谷氨酰胺的Complete MesenPro RS培养基组成的维持培养基内培养接近汇合单层。下面描述了培养、传代和接种hADSC的方法。
当细胞培养物达到汇合时进行hADSC的继代培养。为了传代hADSC，采用下列方法：i)从细胞中吸取Complete MesenPRO RS培养基；ii)通过将DPBS加到在贴壁细胞层对面的容器侧，并来回摇动容器几次，以将细胞层的表面区域用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DBPS)缓冲液冲洗；iii)通过吸取并丢弃以除去DPBS；iv)通过加入足够体积的预温热的无酚红胰蛋白酶-EDTA溶液以覆盖细胞层来剥离细胞；v)在37℃下孵育约7分钟；vi)在显微镜下观察细胞以确定是否需要额外的孵育；vii)将3mL维持培养基加入板中，混合细胞悬液，将悬液加入15mL离心管中，并以210g离心5分钟；viii)使用血细胞计数器测定细胞总数和百分比存活率；ix)将Complete MesenPRO RS培养基加入各容器中，使得最终的培养体积为0.2mL-0.5mL/cm2；x)通过将适当体积的细胞加入各容器中，接种细胞，并在37℃、5% CO2和90%湿度下孵育；和xi)接种后3或4天，完全除去培养基并更换为等体积的Complete MesenPRO RS培养基。
在新的培养板上接种传代的hADSC之前，培养皿的表面用无菌DPBS溶液3次，接着用无菌水多次冲洗。覆盖层的第一层是聚-L-鸟氨酸。通过加入约15-约20 μg/mL的聚-L-鸟氨酸和在37℃下孵育1小时，来制备覆盖层。板用DPBS洗涤3次，每次洗涤15分钟。覆盖层的第二层是牛血浆纤连蛋白。将纤连蛋白在DPBS中从原液稀释至1:1000，并将500 μL加入各孔中。将板置于室温下1小时。用500 μL/孔的DPBS进行最后一次洗涤，立即使用该板。
然后取出细胞，并以2x104个细胞/ml (1x104个细胞/孔)的密度再接种到24孔培养板中，该板含有聚-L-鸟氨酸和牛血浆纤连蛋白覆盖层。
在接种和引发(priming)之后3天；将培养基更换为神经元分化培养基。从培养箱中取出培养板，所有程序在层流罩超净台中进行。从各孔中完全除去培养基。然后将hADSC用约1ml/孔的量的无菌DPBS溶液洗涤以除去过量的培养基。除去DPBS溶液，更换成神经元分化培养基。如此配制神经元分化培养基，使得神经发生可归因于营养物而不是培养基。所用的神经元分化培养基是可获自Invitrogen?的NeurobasalTM培养基，其包含下表1中所列的下列成分。
表1：NeurobasalTM培养基
组分 分子量 浓度(mg/L) mM 氨基酸 甘氨酸 75 30 0.4 L-丙氨酸 89 2 0.0225 盐酸L-精氨酸 211 84 0.398 L-天冬酰胺-H2O 150 0.83 0.00553 L-半胱氨酸 121 31.5 0.26 盐酸L-组氨酸-H2O 210 42 0.2 L-异亮氨酸 131 105 0.802 L-亮氨酸 131 105 0.802 盐酸L-赖氨酸 183 146 0.798 L-甲硫氨酸 149 30 0.201 L-苯丙氨酸 165 66 0.4 L-脯氨酸 115 7.76 0.0675 L-丝氨酸 105 42 0.4 L-苏氨酸 119 95 0.798 L-色氨酸 204 16 0.0784 L-酪氨酸 181 72 0.398 L-缬氨酸 117 94 0.803 维生素 氯化胆碱 140 4 0.0286 D-泛酸钙 477 4 0.00839 叶酸 441 4 0.00907 烟酰胺 122 4 0.0328 盐酸吡哆醇 204 4 0.0196 核黄素 376 0.4 0.00106 盐酸硫胺 337 4 0.0119 维生素B12 1355 0.0068 0.000005 i-肌醇 180 7.2 0.04 无机盐 氯化钙(CaCl2) (无水) 111 200 1.8 硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.1 0.000248 氯化镁(无水) 95 77.3 0.814 氯化钾(KCl) 75 400 5.33 碳酸氢钠(NaHCO3) 84 2200 26.19 氯化钠(NaCl) 58 3000 51.72 磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O) 138 125 0.906 硫酸锌(ZnSO4-7H2O) 288 0.194 0.000674 其它组分 D-葡萄糖(右旋糖) 180 4500 25 HEPES 238 2600 10.92 丙酮酸钠 110 25 0.227
将PE按在无血清培养基中的不同浓度加入各孔中。预温热的无血清培养基含有具有L-谷氨酰胺、20ng/mL的bFGF、20ng/mL的EGF和N2补充剂的神经基础培养基。见下表2。
表2. N2补充剂。
组分 分子量 浓度(mg/L) mM 蛋白质 人运铁蛋白(Holo) 10000 10000 1 胰岛素重组全链 5807.7 500 0.0861 其它组分 黄体酮 314.47 0.63 0.002 腐胺 161 1611 10.01 亚硒酸盐 173 0.52 0.00301
以10μM、20μM和40μM的浓度，测试了来自牛和植物两者的PE的处理。在24小时、48小时和96小时，在相衬显微镜下，分别测试了不同浓度的PE，并与阳性对照、DHA和阴性对照(无处理)进行比较。实验以一式三份重复。
在收集照片后，进行数据分析和比较，以测定各PE在促进神经发生中的有效性。通过神经元形态学确定神经元分化。这些改变的一些包括胞质皱缩及轴突形成和树突样胞质突出(神经突)。这些改变始于hADSC的胞质向核回缩形成具有胞质延伸的收缩细胞体。细胞最终发展成类似于双极、三极和多极神经元细胞的形态。参见图1A和1B。
一般来说，在该实例PE中，如果hADSC显示神经元形态，则该结果归因于所添加的神经组分的神经发生能力。例如，无处理的对照孔中的hADSC保持其推定的形态，为培养物表面上大而扁平的铺展细胞，表明无明显的神经发生。参见图2A。
值得注意的是，在不同的上述浓度的PE添加中，20μM浓度的PE表明提高神经发生的最强作用，如图2C和2D中hADSC所示神经元形态所显示的那样。根据这些结果，确定了PE可用作具有神经发生作用的天然存在的营养物。当与阴性对照比较时，来自植物(图2C)和牛(图2D)两者的PE添加也促进神经发生。在不同的上述浓度的PE添加中，如所示，20μM浓度的PE显示提高神经发生的最强作用，显示出大量的神经突向外生长、胞质皱缩和神经元分化。
当与阴性对照比较时，将10μM的DHA加入hADSC中作为阳性对照增强hADSC的神经元形态。此外，在10μM的DHA存在下，少数hADSC从其推定形态显著变成神经元细胞形态，因为胞质皱缩，且神经突开始从hADSC伸出。参见图2B。当用来自牛的20 μM PE和10 μM DHA的组合处理hADSC时，两种营养物的协同作用增强神经发生，其还具有较长伸出的神经突向外生长和多极神经元分化(图2E)。
实施例2
该实施例描述了与DHA和阴性对照相比由鞘磷脂引起的hADSC的神经发生。
来自蛋(目录号1332)和脱脂乳(目录号1329)的鞘磷脂购自Matreya (Pleasant Gap，PA，USA)。将来自蛋和脱脂乳的鞘磷脂分别在100%乙醇中稀释为13.7mM。通过实施例1中概述的相同方法，将hADSC培养，传代，接种，并经过鞘磷脂处理。
在处理后24小时、48小时和96小时，在相衬显微镜下，观察包括10μM鞘磷脂，20μM鞘磷脂，40μM鞘磷脂，10μM DHA和阴性对照的hADSC。
甚至在低浓度的鞘磷脂下，大多数延伸，虽然不是非常长，但比阴性对照长，并且多许多。在该方案中，40 μM的牛鞘磷脂和20 μM的脱脂乳鞘磷脂比DHA更有效。参见图3A、3B和3C。
在不同的上述浓度的鞘磷脂添加中，发现40μM鞘磷脂增强hADSC的神经分化。根据这些结果，确定了鞘磷脂可用作具有神经发生作用的天然存在的营养物。
实施例3
与DHA和阴性对照相比该实施例描述了由CDP-胆碱引起的hADSC的神经发生。
CDP-胆碱获自Kyowa Hakko Gio Co。在层流罩超净台中，将CDP-胆碱溶于无菌H2O中至200μM，得到清澈原液。通过实施例1中概述的相同方法，将hADSC培养，传代，接种，并经过CDP-胆碱处理。
在5μM和10μM浓度下，测试CDP-胆碱的处理。分别测试不同浓度的CDP-胆碱，并与阳性对照进行比较，在处理后3小时、24小时和48小时，在相衬显微镜下的10 μM DHA (图4A)和阴性对照(图4B)。实验以一式三份重复。
此外，5μM浓度下的CDP-胆碱显示增强神经发生的作用，因为所观察到的神经突向外生长，并且在用CDP-胆碱处理的hADCS中观察到神经元形态改变。参见图4C。注意，胞质皱缩和神经突开始伸出。由于皱缩细胞体和来自显微镜的光反射增强所致，用神经元分化细胞可观察到光环(corolla)。观察到较长的神经突生长。
10μM的CDP-胆碱与10μM的DHA一起添加显示在hADSC中增效的神经发生。参见图4D。在CDP-胆碱和DHA的组合存在下，hADSC进行显著的神经发生。
此外，CDP-胆碱促进人神经元干细胞(“hNSC”)系的神经发生。本文公开了用于测试hNSC上CDP-胆碱的神经发生的方法和所得到的结果。
简单地说，hNSC购自Millipore, Bellerica, MA, U.S.A.，具有组成型表达绿色荧光蛋白(“GFP”)的遗传修饰。按生产商的推荐，将hNSC培养在层粘连蛋白包被板上。层粘连蛋白和DEME/F12两者获自Millipore。将层粘连蛋白用DMEM/F12稀释成20μg/mL。将10 ml稀的层粘连蛋白溶液加入10cm组织培养皿中。然后将培养皿在37℃、5% CO2培养箱中孵育过夜。临用前，吸取层粘连蛋白溶液，用无菌DPBS溶液冲洗一次。将hNSC在37℃、5% CO2培养箱中在补充20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的ReNcell NSC维持培养基(Millipore)中培养。之后每隔一天用含有bFGF和EGF的新鲜培养基更换培养基。在该步骤后2-3天，细胞达到80%汇合。
在hNSC达到80%汇合后，hNSC准备好用于分化实验。在接种前，将96孔板现用20 μg/mL层粘连蛋白溶液新鲜包被，接着如上所述短暂的DPBS冲洗。小心地除去培养基，在37℃、5% CO2培养箱中，将hNSC在3ml Accutase (Millipore)内解离3分钟。然后加入5ml补充20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的ReNcell NSC维持培养基(Millipore)。然后将细胞悬液转移到无菌15ml锥形管中，通过以300 × g离心5分钟使细胞沉淀。除去上清液。然后将2ml培养基加入管中，使hNSC充分地再悬浮。以1x104个细胞/ml (1000个细胞/孔，100 μl/孔)的密度将hNSC接种到96孔板中。
在粘附在培养表面上后，更换培养基为在CDP-胆碱或DHA存在下或无处理的无血清分化培养基。在更换前现制备无血清分化培养基，该培养基包括40 ml DMEM/F12 (Millipore)、400 μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺(Life Technologies，Carlsbad，CA)、400 μl B27溶液(Life Technologies，Carlsbad，CA)和40 μl浓度为10mg/mL的Heperin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI)溶液。
在倒置荧光显微镜下，在72小时后观察细胞的形态改变。将整个96孔板放置在Leica DMI4000B荧光显微镜下，在用UV光源的显微镜下用GFP滤光片拍摄照片。
当与无处理相比时，4μM的CDP-胆碱显著促进神经发生。参见图4E。所观察到的hNSC具有皱缩细胞体，突出的神经突，并正出现树突。参见图4F。在CDP-胆碱存在下，神经突向外生长的长度与20 μM DHA的相当，这表明对神经发生的良好作用。参见图4G。
此外，12.5 μM的CDP-胆碱与包括以下的其它脑营养物协同起作用，以快速方式显著地促进神经发生：5 μM DHA、0.1 μM N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、20 μM尿苷、25 μM胆固醇、8.8 μM白藜芦醇和0.3 μM叶黄素。图4H所示形态改变，表示用CDP-胆碱和这些其它的脑营养物处理后hNSC的神经元形态改变。这些形态改变包括更多少突胶质细胞分化的出现，这表明髓鞘形成功能。
实施例4
该实施例描述了与DHA和阴性对照相比由神经酰胺引起的hADSC的神经发生。用于下列实验的神经酰胺为N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇、乳糖苷神经酰胺和N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇。
本文公开了用于测试N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇对hADSC的神经发生的方法和所得到的结果。
N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇购自Matreya? (目录号2042)，以1mM溶于100%乙醇中，并作为原液保存在-80℃下以避免物理和化学性质改变。采用实施例1中概述的相同方法培养，传代，接种细胞，并使之经历N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇处理，不同的是以2x104个细胞/ml (1x104细胞/孔)的密度将细胞接种在含有聚-L-鸟氨酸和牛血浆纤连蛋白覆盖层的24孔培养板中。
在处理后24小时，在相衬显微镜下，测试浓度为20 μM和40 μM的N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇的处理，并与阳性对照、10 μM DHA和阴性对照进行比较。实验以一式三份重复。
在更换到神经分化培养基中后24小时，用浓度为10μM DHA处理，最先观察到早期神经发生。参见图5A。
在用浓度为40μM的N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇处理hADSC后24小时，也观察到早期神经发生，参见图5B。
在无处理的对照孔中hADSC保持其推定形态，为培养表面上大而扁平的铺展细胞，表明了在该时间点上无明显的神经发生。参见图5C。
此外，当与DHA比较时，N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇的处理显示促进神经发生的中等作用。此外，用N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇处理的hADSC就形态而言的确显示明显的神经元改变，表明了N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇可具有与DHA不同的神经发生途径。
同样，发现乳糖苷神经酰胺在hADSC中促进神经发生。在大多数动物组织中发现少量的乳糖苷神经酰胺，亦称乳糖脑苷脂，但其具有多种重要的生物功能，并且作为大多数神经寡糖基神经酰胺、硫脑苷脂和神经节苷脂的生物合成前体具有重要性。
乳糖苷神经酰胺获自Metreya (目录号1500)，将其以9mM浓度溶于100%乙醇。采用针对N-(R,S)-α-羟基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇的上述方法，发现测试浓度为10μM的乳糖苷神经酰胺显示对hADSC的神经发生作用。参见图5D。
此外，发现N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇在hNSC中促进神经发生。将N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇以11.7 mM溶于100%乙醇中，并作为原液保存在-80℃下。人神经元干细胞购自Millipore?，具有组成型表达绿色荧光蛋白的遗传修饰。按照实施例3中所述的方法，hNSC经培养，接种，并暴露于N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇中。
10μM N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇显著促进神经发生，因为hNSC出现皱缩细胞体，突出的神经突和形成中的树突。参见图5E。
而且，实验浓度为10 μM的N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇与10 μM DHA协同作用进一步促进神经发生。参见图5G。将其与只含有DHA的阳性对照组(参见图5F)和含有无处理的阴性对照组(参见图5H)进行比较。
此外，发现早在应用后3小时，N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇能够与其它脑营养物协同作用以显著促进神经发生。参见图5I，在应用0.1 μM N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇以及12.5μM CDP-胆碱和包括以下的其它脑营养物后3小时，其显示神经元形态改变：5 μM DHA、20 μM尿苷、25 μM胆固醇、8.8 μM白藜芦醇和0.3 μM纯化的或天然形式的叶黄素。神经元形态改变显示为出现更趋向少突胶质细胞分化，这表明了髓鞘形成功能。
实施例5
该实施例描述了与DHA和阴性对照相比由尿苷引起的hADSC的神经发生。该实施例还描述了由尿苷引起的hNSC的神经发生。
尿苷购自Sigma-Aldrich? (目录号U3003)，在层流罩超净台中，将其溶于无菌水中至50 mg/ml，得到清澈原液。按照实施例1中描述的方法，将hADSC培养，传代，接种，并暴露于尿苷中。
分别测试20μM尿苷，并与阳性对照、20μM DHA和作为阴性对照的无处理进行比较。在hADSC接种到包被的培养表面上后3天，将尿苷和DHA直接加入神经分化培养基中。在处理后3小时、24小时和48小时，在相衬显微镜下观察样品。实验以一式三份重复。
在无处理的对照孔中，hADSC保持其推定的形态为在培养表面上大而扁平的铺展细胞，这表明在该时间点上无明显的神经发生。参见图6A。
在更换为含20 μM尿苷的神经分化培养基后3小时观察到早期神经发生。参见图6B。
值得注意的是，实验浓度为0.5mM的尿苷显示增强早期神经发生的最强作用。而且，所述神经元形态改变持续直到48小时培养时程。
同样，发现尿苷在hNSC中促进神经发生。按照实施例3中所述方法，将hNSC培养，传代，接种，并暴露于尿苷中。
20μM的尿苷显著促进神经发生，因为hNSC显得具有皱缩细胞体、突出的神经突和发生中的树突。参见图6C。在尿苷存在下神经突向外生长的长度表明神经发生的良好作用。
此外，还发现尿苷能够与其它脑营养物协同作用，以快速方式显著促进神经发生。参见图6D，其显示在应用尿苷以及5 μM DHA、0.1 μM N-辛酰基-D-苏型-鞘氨醇、25 μM胆固醇、8.8 μM白藜芦醇和0.3 μM纯化的或天然形式的叶黄素后的神经元形态改变。神经元形态改变显示为表现更趋向少突胶质细胞分化，这表明了髓鞘形成功能。
制剂实施例
表1提供可掺入或加入本文所述营养组合物中的神经组分实施例实施方案。该实施例提供包括在营养组合物每100kcal份量中各成分的量。
表1. 实施例神经组分的营养概况
表2提供本公开内容的营养组合物的实施例实施方案并描述了每100 kcal份量中包括的各成分的量。
表2. 实施例营养组合物的营养概况
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