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1、(10)申请公布号 CN 102614619 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102614619 A *CN102614619A* (21)申请号 201110048168.6 (22)申请日 2011.03.01 CGMCC No. 4589 2011.01.30 A62D 3/02(2007.01) C02F 3/34(2006.01) A62D 101/20(2007.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 李正魁 赵琳 吴宁梅 周涛 冯露露 王易超 范念文 周莉 (74)专利代理机构 南京知识律师事务。
2、所 32207 代理人 胡锡瑜 (54) 发明名称 鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃降解中的应用 (57) 摘要 本发明属于环境污染物生物处理技术领域， 具体涉及鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃高效降解 中的应用。 本发明涉及的鞘氨醇单胞菌菌株， 能够 以多环芳烃菲、 芘为唯一碳源和能源生长繁殖， 将 菲、 芘完全矿化。其菌液、 休眠细胞以及固定化菌 株均可对多环芳烃菲和芘进行降解， 对多环芳烃 具有高效降解作用， 为含多环芳烃的工业废水、 生 活污水的处理提供了保障 ； 另外， 能将含 2mg/L 多 环芳烃菲、 芘的自然水体 （湖水） 降解 95% 以上， 为 自然水体生物修复提供了有效途径， 适用于。
3、含多 环芳烃工业废水、 生活污水的处理， 并可为受多环 芳烃污染的自然水体生物修复提供有效途径。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种鞘氨醇单胞菌属菌株、 游离生物菌制剂或固定化菌株在多环芳烃降解中的应 用。 2. 一种鞘氨醇单胞菌属菌株、 游离生物菌制剂或固定化菌株在受多环芳烃污染的工业 废水或生活污水处理中的应用。 3. 一种鞘氨醇单胞菌属菌株、 游离生物菌制剂或固定化菌株在受多环芳烃污染的自然 。
4、水体生物修复中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102614619 A 2 1/5 页 3 鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃降解中的应用 技术领域 0001 本发明属于环境污染物生物处理技术领域， 具体涉及鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳 烃高效降解中的应用。 背景技术 0002 多环芳烃 ( Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs) 是指一类具备由 2 个或 2 个以上苯环以线状、 角状或成簇形式构成的独特结构的持久性有机污染物。PAHs 污染物 主要分布在大气、 土壤、 水体沉积物及水体水相中， 由于 PAHs 会在生物体内积累并通过 细胞毒性、 遗传毒性和免疫毒。
5、性对生物体产生致癌、 致畸、 致突变作用， 对自然界生物安全 和人类健康构成巨大威胁， 美国EPA 已将16 种 PAHs 列入优先控制污染物黑名单， 我国国 家环保局在第一批公布的 68 种优先控制污染物中， 也将 7 种 PAHs 列入其中。因此， 控制和 去除多环芳烃具有重要的理论和现实意义。 0003 对于环境中的 PAHs 的去除， 自 20 世纪 70 年代开始， 研究人员就利用微生物 技术对受 PAHs 污染土壤进行修复尝试 （受菲、 芘或五氯苯酚污染土壤的蚯蚓强化修复 方法， 专利申请号 200910184601.1） ， 80 年代科学家认识到微生物技术是修复受 PAHs 污。
6、染最有前景的技术， 并将之应用于石油污染环境的修复， 如孙国华等采用不动杆菌 ( Acinetobacter sp . ) 对石油烃的降解进行了研究 （生物技术通报， 2010， 一株石油烃降解 菌分子鉴定及特性分析） 。 0004 目前， PAHs 在环境中的去除途径有微生物降解， 生物富集， 光降解、 化学氧化等 技术， 如宋兴良等分离出黄杆菌属 ( Flavobacterium ) 对多环芳烃进行降解 （海洋环境 科学， 2010 年， 多环芳烃蒽高效降解菌的筛选及其降解中间产物分析） ， 王丽平等分离出芽 胞杆菌属 (Bacillus sp. 对多环芳烃芘进行降解 （海洋环境科学， 2。
7、010 年， 一株高效多 环芳烃芘降解菌株的筛选鉴定及其特性研究） ； 卓胜等采用黑麦草摩西球囊菌蚯蚓等 对多氯联苯污染土壤进行了联合修复 （环境科学学报， 2010 年， 黑麦草菌根蚯蚓对多 氯联苯污染土壤的联合修复效应） ， 在天然水体中， 魏研等采用假单胞菌属 （Pseudomonas citronellolis 对水体中的多环芳烃进行了降解研究 （化学与生物工程， 2010， 多环芳烃降 解菌的筛选及其对天然水的净化效果分析） ， 取得了一定的效果。研究表明， 多环芳烃的水 解和光解速率都非常缓慢， 生物降解成为它们从环境中缓慢消失的主要途径， 并具有环保、 高效、 廉价的优点， 因此。
8、高效降解菌的筛选成为修复多环芳烃污染的生态系统的关键， 被 公认为是去除环境中 PAHs 的主要途径之一。 0005 迄 今 为 止， 虽 然 筛 选 出 多 种 多 环 芳 烃 降 解 菌 种， 但 主 要 是 不 动 杆 菌 ( Acinetobacter sp . )， 黄杆菌属 ( Flavobacterium )， 芽胞杆菌属 (Bacillus sp.) 和假单胞菌属 （Pseudomonas citr onellolis） 等， 在鞘氨醇单胞菌方面虽有报导， 但主 要集中于混合菌种或原生质体融合技术对多环芳烃的降解 （如由pseudomonas sp. GP3A 和Pandora。
9、ea Pnomenusa GP3B 混合菌种降解芘 （华南理工大学， 党志等， 一种多环芳烃 高效降解菌系及其应用， 专利申请号 200710031821.1） ， 以及由鞘氨醇单胞菌 GYZB ( 说 明 书 CN 102614619 A 3 2/5 页 4 sphingomonas ） 和假单胞菌 GP3A ( Pseudomonas ） 两株菌的原生质体进行融合， 构建出基 因工程菌降解菲 （华南理工大学， 党志等， 降解多环芳烃的高效菌株及其构建方法和应用， 专利申请号 201010265121 . 0） ， 而采用单一高效鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃鲜有报导， 因此， 筛选高效鞘氨醇单胞。
10、菌降解多环芳烃具有重要意义。 发明内容 0006 本发明的需要解决的问题是针对现有降解多环芳烃存在的弱点， 提供一种多环芳 烃高效降解菌系及其应用途径， 主要是在废水生物处理和环境污染修复中用于降解多环芳 烃的应用。 而从自然界中分离出的一株鞘氨醇单胞菌属菌， 分离自我国太湖水体， 为本土菌 种， 生物安全性高， 能够以菲、 芘为碳源和能源生长繁殖， 将菲、 芘完全矿化成 CO2和 H2O。在 纯培养条件下， 该菌系 12 天能将无机盐培养基中 15mg/L 的菲、 芘降解 85 以上 ； 在流 化床运行条件下， 22 天左右能将 15mg/L 的菲、 芘降解 95， 22 天左右能将 50m。
11、g/L 的菲、 芘 降解 75， 对多环芳烃具有高效降解作用， 为含多环芳烃的工业废水、 生活污水的处理提 供了保障 ； 另外， 在对自然水体 （湖水） 中含2mg/L菲、 芘的多环芳烃菲、 芘的去除可达95%以 上， 取得了显著效果， 为自然水体生物修复提供了有效途径。 0007 本发明的技术解决方案是， 本发明提供的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ， 于 2011 年 1 月 30 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 地址 “北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号” ， 其保藏号 CGMCC No. 4589， 参见 “鞘氨醇单胞菌菌株及其在 水处。
12、理中的应用” ， 申请号 ： 201110044056.3。 0008 本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃菲的降解能力极强， 经该菌株作用后， 菲大幅度降解， 从而降低废水中的菲浓度。 0009 该鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃芘的降解能力极强， 经该菌株作用后， 芘大幅 度降解， 从而降低废水中的芘浓度。 0010 该鞘氨醇单胞菌属菌株可在以多环芳烃菲、 芘为唯一碳源及能量的基础培养基中 生长。 0011 本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株， 可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化菌株对 菲和芘进行降解处理。 0012 本发明所达到的有益效果是 ： 本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃菲和 芘具有。
13、极强的转化能力， 降解速度快， 降解率高达8595%。 该菌株可作为游离生物菌制剂 或固定化菌株， 投加到现有的工业废水、 生活污水处理系统中， 对含多环芳烃废水进行降解 处理， 提高原处理系统的反应效率， 降低能耗， 缩短反应时间， 增强原处理系统的处理能力 和效率 ； 另外， 该菌株可对受多环芳烃菲和芘污染的自然水体进行修复处理， 广泛应用在工 业污水、 生活污水及受污染的自然水体中。 附图说明 0013 图 1 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及对菲降解作用的影响 鞘氨醇单胞菌细胞数量 （lg(Cell/L)） ， 菲去除率 图 2 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及对芘降解作用的影响 鞘氨醇单胞菌细胞。
14、数量 （lg(Cell/L)） ， 芘去除率 说 明 书 CN 102614619 A 4 3/5 页 5 图 3. 鞘氨醇单胞菌的细胞生长与菲的降解曲线关系图 鞘氨醇单胞菌细胞数量 （lg(Cell/L)） ， 菲去除率 图 4. 鞘氨醇单胞菌的细胞生长与芘的降解曲线关系图 鞘氨醇单胞菌细胞数量 （lg(Cell/L)） ， 芘去除率 图 5. 实验反应装置，（1） . 流化床 ；（2） . 取样口 ；（3） . 转子流量计 ；（4） . 空压机 ； （5） . 增压泵 ；（6） . 循环水槽 ；（7） . 加热装置 图 6 流化床反应器中对含菲、 芘废水降解的应用 菲浓度 （mg/L） ，。
15、 芘浓度 (mg/L)， 菲去除率， 芘去除率 图 7 流化床反应器中对含高浓度菲、 芘废水降解的应用 菲浓度 （mg/L） ， 芘浓度 (mg/L)， 菲去除率， 芘去除率 图 8 鞘氨醇单胞菌对受菲、 芘污染自然水体生物修复的应用 处理组菲浓度 (mg/L)， 处理组芘浓度 (mg/L)， 对照组菲浓度 (mg/ L) 对照组芘浓度 （mg/L） 。 具体实施方式 0014 实施例 1 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及菲降解作用的影响 1 在 250ml 的锥形瓶中加入 50ml 培养基 （使菲最终浓度为 15mg/L） 。 0015 2 将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 1 的锥形。
16、瓶中， 调节培 养基pH为310， 28, 80r/min , 好氧培养。 在初始菲浓度为 15mg/L条件下， 培养14d ， 测定 pH 值对鞘氨醇单胞菌数量及菲去除率的影响。 图 1 为 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及 对菲降解作用的影响。结果表明， 当 pH 为 3 时， 鞘氨醇单胞菌生长受到较大抑制， 细胞数最 低， 只有 103左右 ； 相对应的菲的降解率最小， 只有 12.3% ； 当 pH 上升到 7.2 时， 鞘氨醇单胞 菌生长最好， 对应的细胞数接近于108， 对菲的降解效果最好， 达到85%左右， 而当pH逐步升 高时， 鞘氨醇单胞菌数量逐渐下降， 对菲的降解效果也逐步下降，。
17、 pH 升高到 9.3 时， 鞘氨醇 单胞菌数量下降到 104左右， 对菲的降解率也下降到 23.4%， 表明鞘氨醇单胞菌最佳生长 pH 为 7.2。 0016 实施例 2 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及芘降解作用的影响 1 在 250ml 的锥形瓶中加入 50ml 培养基 （使芘最终浓度为 15mg/L） 。 0017 2 将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 1 的锥形瓶中， 调节培 养基pH为310， 28, 80r/min , 好氧培养。 在初始芘浓度为 15mg/L条件下， 培养14d ， 测定 pH 值对鞘氨醇单胞菌数量及芘去除率的影响。图 2 为 pH 对鞘氨醇单胞菌数量及 。
18、对芘降解作用的影响。结果表明， 当 pH 为 3 时， 鞘氨醇单胞菌生长受到较大抑制， 细胞数最 低， 只有 103左右 ； 相对应的菲的降解率最小， 只有 11.6% ； 当 pH 上升到 7.2 时， 鞘氨醇单胞 菌生长最好， 对应的细胞数接近于 108， 对菲的降解效果最好， 达到 84.1%， 而当 pH 逐步升高 时， 鞘氨醇单胞菌数量逐渐下降， 对芘的降解效果也逐步下降， pH 升高到 9.3 时， 鞘氨醇单 胞菌数量下降到104左右， 对菲的降解率也下降到19.2%， 表明鞘氨醇单胞菌最佳生长pH为 7.2。 0018 实施例 3 本发明在菲降解研究中的应用， 其步骤如下 ： 说。
19、 明 书 CN 102614619 A 5 4/5 页 6 1 在 250ml 的锥形瓶中加入 50ml 培养基 （使菲最终浓度为 15mg/L） 。 0019 2 将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 1 的锥形瓶中， 28 , 80r/min , 好氧培养。每隔 24 小时取样测定。图 3 为鞘氨醇单胞菌的细胞生长与菲的降 解曲线图。从图 3 可以看出， 当菌体浓度达到 107Cell/L 时足以使菲降解， 接种 12 天后， 菲 的去除率接近 85。 0020 实施例 4 本发明在芘降解研究中的应用， 其步骤如下 ： 1 在 250ml 的锥形瓶中加入 50ml 培养基 （使芘最。
20、终浓度为 15mg/L） 。 0021 2 将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 1 的锥形瓶中， 28 , 80r/min , 好氧培养。每隔 24 小时取样测定。图 4 为鞘氨醇单胞菌的细胞生长与芘的降 解曲线图。从图 4 可以看出， 当菌体浓度达到 107Cell/L 时足以使芘降解， 接种 12 天后， 芘 的去除率接近 85。 0022 实施例 5 本发明在实验室模拟流化床反应器中对含菲、 芘废水降解的应用， 其步骤如下 ： 1 图 5 为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为 1.7L （内径 8cm， 高 50cm） 并带有保温夹套 （夹套内通 301的水） 的流化床。
21、反应器中进行， 鞘氨醇单胞菌属菌株的 固定化菌株投入反应器中， 固定化颗粒的填充率为 10%， 采用模拟废水间歇式进水， 同时进 行曝气， 调节空气流量， 定时从反应器取出水样， 分析其中的 DO 值、 pH、 菲、 芘的浓度， 并按 下式计算菲去除速率和芘去除率 ： 菲去除率 =（菲进水 菲出水） / 菲进水100% 芘去除率 =（芘进水 芘出水） / 芘进水100% 2 实验进水中菲和芘浓度分别为 15mg/L， 在 30， pH 7.0 7.2， 曝气量为 250ml/ min条件下进行反应， 每隔24个小时进行取样测定。 图6是流化床系统进水菲和芘浓度、 菲 和芘去除率随时间的变化， 。
22、结果表明， 在 15mg/L 菲和芘的浓度条件下， 经过 30 天的连续运 行， 流化床可以去除大部分的菲和芘， 22天左右去除率分别高达95%和93%， 去除效果显著。 0023 实施例 6 本发明在实验室模拟流化床反应器中对含高菲、 芘废水降解的应用， 其步骤如下 ： 1 图 5 为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为 1.7L （内径 8cm， 高 50cm） 并带有保温夹套 （夹套内通 301的水） 的流化床反应器中进行， 将鞘氨醇单胞菌属菌株 的固定化菌株投入反应器中， 固定化颗粒的填充率为 10%， 采用模拟废水间歇式进水， 同时 进行曝气， 调节空气流量， 定时从反应器取出。
23、水样， 分析其中的 DO 值、 pH、 菲、 芘的浓度， 并 按下式计算菲去除速率和芘去除率 ： 2 实验进水中菲和芘浓度分别为 50mg/L， 在 30， pH 7.0 7.2， 曝气量为 250ml/ min条件下进行反应， 每隔24个小时进行取样测定。 图6是流化床系统进水菲和芘浓度、 菲 和芘去除率随时间的变化， 结果表明， 在 50mg/L 高浓度菲和芘条件下， 经过 30 天的连续运 行， 流化床可以去除大部分的菲和芘， 22天左右去除率分别达到75%和74%， 去除效果明显。 0024 实施例 7 本发明的鞘氨醇单胞菌对自然水体 （太湖水） 中含菲、 芘的生物修复研究， 其步骤如。
24、下 ： 1 取 300ml 灭菌的富营养化太湖水加入 500ml 的锥形瓶中， 添加含菲芘的母液， 使 说 明 书 CN 102614619 A 6 5/5 页 7 菲、 芘最终浓度为 2.0mg/L。将分离纯化得到的鞘氨醇单胞菌菌株培养、 富集 , 取对数生长 期的菌液， 按接种量 3% 转接到装有灭菌湖水的三角瓶中。细菌密度设为 3.8108Cell/L， 于 28， pH 7.0 7.2， 80r/min 条件下好氧培养。每组均设 3 个平行， 以未接菌组作对照， 每隔 24 小时取样测定菲、 芘的残留量。实验结果表明， 经过连续 7 天时间的反应， 当鞘氨醇 单胞菌数量达到108时， 可以有效的去除多环芳烃中的菲和芘， 去除率达到95%， 为对自然水 体 （太湖水） 中含菲、 芘的生物修复提供了有效途径。 说 明 书 CN 102614619 A 7 1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102614619 A 8 2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102614619 A 9 3/4 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102614619 A 10 4/4 页 11 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102614619 A 11 。