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1、10申请公布号CN104211790A43申请公布日20141217CN104211790A21申请号201310544398022申请日20131106201310205883520130529CNC07K14/325200601C12N15/32200601C12N15/70200601C12N15/82200601C12N1/21200601C12N5/10200601A01H5/00200601A01N47/44200601A01P7/04200601C12R1/0720060171申请人吴小毅地址210009江苏省南京市鼓楼区芳草园1号303室72发明人吴小毅74专利代理机构南京知识。
2、律师事务所32207代理人汪旭东54发明名称一种高效杀灭同翅目害虫的BT蛋白CRY21NJ、编码基因及其应用57摘要本发明是一种对同翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌CRY21NJ基因，分离自对同翅目害虫具有极高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株，并从此菌株克隆了编码对同翅目害虫高毒力的CRY21NJ基因，其编码的蛋白质有序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本发明公开的基因，可转入玉米、大豆、棉花、油菜、水稻、蔬菜等农作物或微生物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表3页19中华人民共和国。
3、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表3页10申请公布号CN104211790ACN104211790A1/1页21一种对同翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌蛋白质CRY21NJ,其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的对同翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌蛋白质CRY21NJ,其特征在于SEQIDNO2所示的氨基酸序列经取代、缺失和或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，其序列同源性范围为80到100。3权利要求1所述的对同翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌蛋白质CRY21NJ获得方法,其特征在于，通过DNA表达或肽合成的方法得到，表达的引物为。
4、CRY21F5GCGCATATGTATATGACAAATCCAACTATAC3CRY21R5CGGAATTCTTATTGATTGTTGTTCATACTTG3。4编码权利要求1所述蛋白质的CRY21NJ基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO1所示。5一种核苷酸构建体或携有所述核苷酸构建体的载体，其特征在于含有编码权利要求1所述蛋白质的基因或者基因片段构建得到的构建体或载体。6权利要求5所述的载体转化的转化体，其特征在于，将权利要求5通过农杆菌介导法或基因枪法或花粉管通道法或其他基因转化方法，将基因或基因片段导入宿主，得到含有编码权利1所述蛋白质的基因或者基因片段的转化体。7根据权利要求6所述。
5、的转化体，其特征在于，转化体为植物宿主细胞或微生物细胞或玉米或大豆或棉花或油菜或水稻或小麦或蔬菜。8权利要求6所述转化体的应用，其特征在于，转化体具有对同翅目害虫的抗虫性，对转化体减少喷施相应的农药。9一种含有权利要求1所述蛋白质的杀虫剂，其特征在于，杀虫剂内含有权利要求1所述的蛋白质CRY21NJ。10权利要求1的应用，其特征在于，将权利要求4或5导入细菌或真菌形成转化体，发酵生产含有权利要求1所述蛋白质的BT蛋白。权利要求书CN104211790A1/7页3一种高效杀灭同翅目害虫的BT蛋白CRY21NJ、编码基因及其应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，具体涉及对同翅目害虫高毒力的B。
6、TCRY21NJ基因的氨基酸序列，涉及对同翅目害虫高毒力的BTCRY21NJ基因的核苷酸酸序列，涉及含有其编码基因的表达和应用。背景技术0002在农业生产中由害虫造成的损失占农作物损失总量的15以上，因此害虫防治是农业生产中的一项重要任务。苏云金芽孢杆菌生物农药是生物农药的重头戏。根据BCCRESEARCH的市场调查报告，2012年苏云金芽孢杆菌产品全球销售额144亿美元，占全球生物农药总销售额的675，而且每年还以1020的速度快速增长。苏云金芽孢杆菌对150多种农业害虫都有防效，且对所防治农作物虫害上表现出高效、无毒特性，具备替代部分化学杀虫剂的实力。苏云金芽孢杆菌生物农药，主要用于农业、。
7、林业以及卫生害虫的防治，给人们带来了明显的经济效益和生态效益。0003苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS，简称BT是一种革兰氏阳性细菌。根据血清型的不同，苏云金芽孢杆菌种中，又被划分为许多不同的亚种。苏云金芽孢杆菌在土壤、病死昆虫、储藏物、植被以及污水、尘埃等基质中均有广泛的分布。自1901年日本学者石渡首次从染病的家蚕中分离出该菌，并证明它对部分鳞翅目昆虫有杀虫活性以来，估计目前已分离的菌株超过了5万株。0004苏云金芽孢杆菌在生长代谢过程中，可以产生多种对昆虫有致病性的杀虫毒素。大部分杀虫苏云金芽孢杆菌菌株在芽孢形成过程中可以产生由内毒素（ENDOTOXIN）组成的晶。
8、体状内含物，又称为杀虫晶体蛋白（INSECTICIDALCRYSTALPROTEINS,ICPS）。其含量可以占到芽孢形成过程中菌体产生的总蛋白的2030，是苏云金芽孢杆菌中最主要的杀虫活性物质。已经发现其可以对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性。00051989年，HOFTE和WHITELEY根据杀虫晶体蛋白的的杀虫活性和一级结构，将当时己知的杀虫晶体蛋白分为5大类。CRYI对鳞翅目昆虫、CRYII对鳞翅目和双翅目、CRYIII对鞘翅目、CRYIV对双翅目、CYT对双翅目昆虫具有杀虫活性。为了避免这种杀虫谱与氨基酸序列之间。
9、的不一致，1998年CRICKMORE等提出了一种新的CRY杀虫晶体蛋白分类方法，CRICKMORE等根据氨基酸同源性进行分级分类，氨基酸同源性在45以下的，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在4578之间的，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在7895之间的，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95以上的，为第四等级，用阿拉伯数字表示。目前已发现740种杀虫晶体蛋白（HTTP/WWWBIOLSSUSXACUK/HOME/NEILCRICKMORE/BT/），被分为72类CRY蛋白和3类CYT蛋白。0006目前登记注册的杀虫剂已经超过上百种，然而大部分都是以野生菌株为基础生产的杀虫剂。
10、，野生菌株往往存在杀虫谱窄、持效期短、易产生抗性。随着对苏云说明书CN104211790A2/7页4金芽孢杆菌分子生物学和分子遗传学的深入研究，构建具有优良性能的重组菌株成为国内外微生物农药发展的一个方向。随着不同杀虫活性的杀虫晶体蛋白（ICP）基因的不断被分离克隆，将不同杀虫活性的基因进行体外重组，从而构建具有广谱杀虫活性的工程菌，成为杀虫剂研究的一个主要方向。0007BT还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。1996年转基因棉花及玉米在美国被批准商品化种植以来，转基因作物的种植面积已从1996年的170万公顷发展到2011年的16亿公顷，占全球总耕地面积的10。第一代的抗虫转基因性状含基因。
11、CRY1AB、CRY1AC或CRY1F。第二代抗虫转基因性状多为2种基因的叠加。孟山都公司和陶氏益农2010年推出的的SMARTSTEX中含有孟山都和陶氏益农相互许可的8个基因3个抗地上害虫基因，3个抗地下害虫基因和2个抗除草剂基因。我国转基因作物的研究起步较晚，但研究进展很快。我国的第一株转基因棉花于1991年问世，成为继美国之后第二个拥有自主知识产权，获得抗虫转基因棉的国家。0008但是以上的BT转基因作物对同翅目害虫都没有效果，寻找对同翅目害虫高毒力的基因资源，对我国的生物防治意义重大。发明内容0009发明目的本发明从我国国内BT菌株中分离克隆了新的基因CRY21NJ，该基因表达产物对同。
12、翅目害虫具有较高毒力。而本发明提供的该基因表达产物的氨基酸序列与已知的BTCRY蛋白存在显著差异。这种新的基因可以应用于转化微生物和植物，使之表现对相关害虫的高毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。0010技术方案0011一种对同翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌CRY21NJ基因，核苷酸序列如SEQIDNO1所示。0012一种CRY21NJ基因编码的蛋白质，其蛋白质是由CRY21NJ基因表达而得，蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0013一种CRY21NJ基因获得的方法，从BT菌株中克隆或分离得到，克隆的引物如下0014P15TATATGACAAATCCAACTATAC3。
13、0015P25TTATTGATTGTTGTTCATACTTG3。0016一种CRY21NJ基因编码的蛋白质获得的方法，其特征在于，通过DNA表达或肽合成的方法得到，表达的引物为0017CRY21F5GCGCATATGTATATGACAAATCCAACTATAC30018CRY21R5CGGAATTCTTATTGATTGTTGTTCATACTTG30019本发明是由本专利发明人（采集地址江苏省南京市溧水区，采集人吴小毅，联系方式南京市草场门大街芳草园1号0303室）于江苏省南京市附近土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS新菌株。通过对该菌株的毒力测试表明，该菌株。
14、对同翅目害虫具有极高的毒力。根据BTCRY类基因保守序列设计特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在CRY21类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到CRY21NJ基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，该序列全长3648BP，分析表明，GC含量为271，编码1215个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。本发说明书CN104211790A3/7页5明分析了CRY21NJ蛋白的氨基酸组成（见表1）。本发明进一步分析了CRY21NJ蛋白的生化特性（见表2）。0020表1CRY21NJ蛋白的氨基酸组成0021说明书CN104211790A4/7页60022。
15、0023表2CRY21NJ蛋白的生化特性0024说明书CN104211790A5/7页70025CLUSTALW蛋白序列同源性分析表明，CRY21NJ与任何已知BTCRY蛋白同源性都不超过75。CRY21NJ与CRY21类的CRY蛋白同源性最高，其与CRY21AA1和CRY21AA2,和CRY21BA1的同源性达到72、73和56（见表3）。0026表3CRY21NJ与CRY21蛋白同源比较数据00270028本发明的BTCRY21NJ基因编码蛋白可抑制同翅目的昆虫，包括飞虱、蚜虫及盲椿象。0029应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和或增加。
16、一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明BT蛋白还包括SEQIDNO2所示氨基酸序列经取代、替换和或增加一个或几个氨基酸，具有CRY21NJ蛋白同等活性的由CRY21NJ衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。0030本发明还涉及与用上述序列表中SEQIDNO1所限定的核苷酸序列，或与用上述核苷酸序列具有一定同源性的核苷酸序列，如序列同源性至少约60，优选至少约70，更优选至少约80同源性的核苷酸，只要这些序列能编码具有对同翅目害虫有活性的蛋白就属于本发明的范围。0031本发明还涉及与上述序列表中SEQIDNO2所示氨基酸具有一定同源性的氨基酸序列，如序列同源性至。
17、少约80，优选至少约8185，优选至少约8690，优选至少约9195，优选至少约9699，最优选为100，只要具有所述同源序列的蛋白质是具有相似的对同翅目害虫活性的蛋白，该序列就属于本发明的范围。0032由本发明分离的核苷酸序列编码的蛋白，具有序列表中SEQIDNO2所示氨基酸序列之对同翅目害虫活性至少约20，优选至少40，更优选至少60，甚至更优选至少80，甚至更优选90，最优选100。0033此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。0034本发明的基因和蛋白质可以从BT菌株中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成。
18、的方法得到。0035可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法，花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转CRY21NJ基因的转化体，使其具备抗虫活性。本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化玉米、大豆、棉花、油菜、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。0036此外，还可以通过发酵本发明菌株，得到含有CRY21NJ蛋白的发酵液，将其制备成说明书CN104211790A6/7页8杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将。
19、上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明BT蛋白。0037本发明的有益效果本发明分离了一个对同翅目害虫具有毒性的苏云金芽孢杆菌菌株，并从该菌株克隆了编码CRY21NJ蛋白的基因。本发明可以简化含有该基因的农作物的害虫防治方法，减少使用防治同翅目害虫的农药。本发明可以扩大含有该基因的生物防治菌株的杀虫谱，提高生物防治菌株对同翅目害虫的效果。具体实施方式0038实施例1CRY21NJ基因的克隆0039本发明从南京附近土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS新菌株，通过对该菌株的毒力测试表明，该菌株对同翅目害虫具有极高的毒力。0040BT菌株的采集与分离本发明。
20、从南京附近土壤中随机采集1000份土样，取地表层以下的土壤大约100G；向装有100ML无菌水的三角瓶中加入1G土样，30震荡30分钟；80热处理20分钟；吸取100L悬液均匀涂布在LB平板上，将其置于30培养箱内；48小时后，挑出类似于BT菌株的菌落镜检确认；0041毒力测试挑但菌落接种于LB液体培养基中，在30恒温摇床上200R/MIN培养48小时，离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物备用。称取定量的混合物加入定量蒸馏水，配制昆虫食饵。选取体态均一的适龄幼虫，每个处理挑取10头幼虫，设置3个重复，室温条件下饲养72小时，期间纪录幼虫死亡情况，计算校正死亡率，得到毒力较高的BT。
21、菌株，其校正死亡率为654。0042PCR扩增本例通过如下方法克隆得到CRY21NJ基因的全长序列。0043提取该菌株总DNA作为模板。0044设计引物序列如下0045P15TATATGACAAATCCAACTATAC30046P25TTATTGATTGTTGTTCATACTTG30047PCR反应体系00480049热循环反应94预变性5MIN；94变性1MIN，52退火1MIN，72延伸2MIN，35个循环；72延伸5MIN；4停止反应。扩增反应产物在L琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。通过扩增得到了约为3600BP的序列，将该序列进行测序，其核说明书CN1042117。
22、90A7/7页9苷酸序列如SEQIDNO1所示，与目的序列一致。0050实施例2CRY21NJ基因的表达及杀虫活性测定0051根据CRY21NJ基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物CRY21F5GCGCATATGTATATGACAAATCCAACTATAC30052CRY21R5CGGAATTCTTATTGATTGTTGTTCATACTTG30053分别在5端引物NDEI和ECORI酶切位点。以该菌株的质粒为模板进行扩增，扩增的产物采用NDEI和ECORI进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后酌载体PET30A连接，转化ECOLIDH5Q感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断。
23、大小符合预期目的后，再转入受体菌ECOLIBL21DE3。SDSPAGE分析表明CRY21NJ基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中，分子量约为136KDA左右，与预测的蛋白分子量相符。CRY21NJ基因表达产物分别对飞虱、蚜虫及盲椿象的生测结果表明（表4）表达产物对这三种虫都具有较好的杀虫活性。对飞虱杀虫活性LC50为351G/ML；对蚜虫的LC50为273G/ML；对盲椿象杀虫活性LC50为924G/ML。不含有CRY21NJ基因的受体菌ECOLIBL21DE3作为对照，生测结果表明，其对上三种昆虫不具有杀虫活性。0054表4CRY21NJ的杀虫活性0055供试昆虫LC50（G/ML）95CONFIDENCE（G/ML）飞虱351182513蚜虫273150428盲椿象92457212060056以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。说明书CN104211790A1/3页1000010002序列表CN104211790A102/3页110003序列表CN104211790A113/3页12序列表CN104211790A12。