技术领域
本发明属于肉食品生物发酵技术领域，涉及一种采用复合菌变温发酵降低发酵肉制品生物胺的方法。
背景技术
生物胺（Biogenic amines）是生物体内具有生物活性的低分子碱性含氮化合物的合称，体内含量过高时，有食品安全隐患，在肉食品生物发酵技术中减少生成生物胺是人们所期望的。
目前关于食品中生物胺的研究主要集中在生物胺的检测方法，降低发酵肉制品过程中生物胺含量的方法报道较少。发明申请专利（申请号201010111733.4）公开了一种食品中生物胺的检测方法，分别采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法对食品中的生物胺进行检测。发明专利（专利号ZL201010111735.3）公开了一种豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法。专利号 ZL03126225.2公开了一种戊糖乳杆菌在30℃情况下用于发酵肉制品发酵、发色、产生良好风味和降低生物胺；专利号ZL200910232405.7公开了一种植物乳杆菌菌株在摄氏37度温度条件下用于分解生物胺和抑制产胺菌的方法。专利申请号201180033860.X公开了一种使用具有转谷氨酰胺酶活性的酶在低蛋白食物例如饮料像葡萄酒和啤酒中减少生物胺含量对的方法；专利号ZL201210145209.8报道了一株抑制生物胺产生的棒状乳杆菌及其应用；授权专利号ZL 201210233412.0 公开了一种利用制曲过程添加甘氨酸和柠檬酸及发酵降低酱油中生物胺含量的方法。目前，未见利用微生物最适生长温度，通过改变发酵温度分阶段发酵降低发酵肉制品中生物胺含量的文献报道。
生物胺是动物、植物和微生物正常的新陈代谢产物。根据其化学结构，生物胺可以分为脂肪胺、芳香胺和杂环胺。生物胺主要是由氨基酸在脱羧酶的作用下脱羧后形成的，但是当底物缺乏时，氨基酸脱羧酶并具有严格的特异性，会利用结构类似的氨基酸脱羧形成其他生物胺，通过醛类和酮类的氨基化和转氨作用也可以生成生物胺。在食品加工中，生物胺广泛存在于各类食品和饮料中，含生物胺较高的食品包括鱼及鱼制品、乳制品、肉及肉制品、发酵蔬菜、豆酱制品和含酒精饮料等，食品中最常见的生物胺是组胺、酪胺、尸胺、2-苯乙胺、精胺、亚精胺、腐胺、色胺和胍丁胺，此外，酚乙醇胺和多巴胺也出现在鱼、肉及肉制品中。在肉品加工中，肉制品发酵或腐烂变质产生大量生物胺，当其累积到一定浓度时便具有毒性作用，当生物胺引起食物中毒时，出现呕吐、腹泻等症状。此外，亚硝酸胺具有致癌作用。基于生物胺的食品安全问题，有必要寻求最佳的安全控制方法降低发酵制品的生物胺含量。
乳酸杆菌能利用发酵糖类产生乳酸，广泛应用发酵食品，诸如酸奶、干酪、奶油、发酵香肠、火腿、鱼露、酒精饮料等的生产中。在发酵过程中，原料中的氨基酸或者原料中的蛋白类物质可以经由酶解产生的氨基酸在微生物的氨基酸脱羧酶作用下脱羧，生成相应的生物胺。具有氨基酸脱羧酶活性的微生物包括乳酸菌以及其它微生物菌株。乳酸杆菌的抑菌作用主要是通过乳酸杆菌产生的乳酸抑制某些细菌的生长，以及乳酸杆菌产生细菌素或类细菌素对其它细菌生长的抑制作用。而在食品发酵生产过程中比较容易被外界微生物污染，其中包括如大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。这些细菌不仅会导致发酵失败，还可能危害食用人群的健康。
发明内容
本发明的目的是克服现有肉食品生物发酵技术中，生成生物胺较多的问题，提供一种用低温菌和中温菌混合的复合菌发酵剂，发酵过程为变温发酵，可获得低生物胺量的发酵肉制品，以及使肉制品中生物胺含低的发酵方法。
采用复合菌变温发酵降低发酵肉制品中生物胺的方法，其特征在于：在被发酵的肉品中一次性混入复合菌，成为肉菌混合物，然后先进行低温发酵，低温发酵结束，立即将发酵温度升高进行中温发酵；即用复合菌对肉品进行先低温，后中温的两步法发酵；
所述的复合菌中，低温发酵菌为：戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3；中温发酵菌为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001和棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3；
所述的低温发酵为：将肉菌混合物放置于摄氏20～30℃条件下发酵；发酵24小时～36小时，当菌肉混合物的pH值变为pH5.5时停止低温发酵；
所述的中温发酵为：肉菌混合物放置于摄氏35℃-45℃进行发酵；进行中温发酵12～24小时，当菌肉混合物的pH值由5.5变为5.0后停止中温发酵，制成用复合菌变温发酵低生物胺的发酵肉制品。
上述制备方法在制作过程中，一次性向肉品中加入复合菌，即同时向肉品中加入低温菌和中温菌，这样生产过程更简单，不多次打开发酵罐，减少污染，低温菌和中温菌的比例不会与预计的有差别。肉品可以是肉糜、肉丁、小肉块。这种方法是首先使用发酵温度相对较低、不产生物胺或产生物胺量少的低温发酵微生物菌株进行低温发酵，低温发酵又可产生大量的酸、抑制有害菌和杂菌等不需要的微生物生长。低温发酵结束后，升温到适合中温发酵微生物生长需要的温度，让中温微生物继续发酵，分解低温发酵时产生的生物胺。经过两次不同温度和两次不同菌种或菌种组合的发酵，发酵肉制品中的生物胺含量显著低于只用低温发酵或只用中温发酵的肉制品，而且先低温后中温发酵的肉制品风味明显改善。
本发明所述的生物胺是发酵的肉制品中：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的合计量（重量）。
复合菌变温发酵降低肉制品生物胺的发酵剂，按重量比，和重量与活菌数比，其配方包括：
葡萄糖 8.0-12.0克；
戊糖 2.0-3.0克；
果聚糖 2.0-3.0克；
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3 106-108cfu；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001 106-108cfu；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3 106-108cfu；
复合菌为戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和棒状乳杆菌的混合物。
按上述发酵剂配方重量比，和重量与活菌数比，在使用时配原肉1000克。
本发明所述的低温发酵菌选用戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3，戊糖乳杆菌在肉食品生物发酵过程中不产生物胺或产胺量较少。
本发明所述的中温发酵菌选用棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001及类似具有生理特性和功能的菌。棒状乳杆菌和植物乳杆菌在肉食品生物发酵过程中不产生物胺。
本发明所述的上述三种发酵菌为购买产品，各菌的保藏号如下：
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3的保藏编号为CGMCC No.3166；简称戊糖乳杆菌；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001的保藏号为CGMCC No.3166；简称植物乳杆菌；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3的保藏编号为CCTCC NO:M 2012130；简称棒状乳杆菌。
低温发酵菌选用戊糖乳杆菌，戊糖乳杆菌能利用葡萄糖、戊糖大量产酸，降低pH值，抑制其它有害菌和杂菌生长，避免杂菌生成生物胺。
中温发酵菌选用棒状乳杆菌，植物乳杆菌发酵葡萄糖产酸和果聚糖，降低pH值，抑制其它杂菌生长，避免杂菌生成生物胺；植物乳杆菌还能够分解生物胺。
中温发酵菌选用植物乳杆菌，棒状乳杆菌能利用果聚糖，不产生生物胺；并不还原硝酸盐，避免硝酸盐被转化成生物胺。
本发明经过两次不同温度和两次不同菌种和菌种组合的发酵，发酵肉制品中的生物胺含量比采用单一微生物发酵方法的加工的发酵肉制品的降低80%以上（见表1和表2）、感官评价风味明显提高。
本发明采用复合菌变温发酵方法获得的发酵肉制品生物胺总量低于同一时间生产的未加发酵剂和未采用本发明技术加工的香肠样品(下称对照组) 的80％以上（见表1和表2），本发明的发酵产品在发酵结束时，检测不到有害肠细菌。而未添加本发明复合菌的对照样品中检出的有害肠细菌量为90～100cfu/g产品。
本发明产品发酵结束时，本发明的复合菌总含量为108cfu/g产品，对照组产品中乳酸菌数为1.4x104cfu/g产品。可见，戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌的迅速繁殖可有效抑制有害菌和杂菌，抑制生物胺产生，减少生物80%。
制备采用复合菌变温发酵低生物胺的发酵肉制品的制备方法，包括以下步骤：
首先确定配方：用复合菌变温发酵获得低生物胺的发酵肉制品，按重量比，和重量与活菌数比，其配方包括：
原肉 1000克；
葡萄糖 8.0-12.0克；
戊糖 2.0-3.0克；
果聚糖 2.0-3.0克；
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3 106-108cfu；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001 106-108cfu；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3 106-108cfu
复合菌为戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和棒状乳杆菌的混合物。
（1）、原肉处理：将原肉切碎成肉丁、肉片或搅成肉糜；
（2）、菌活化：将戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和棒状乳杆菌放入培养基中，在37℃～43℃的培养箱中将这三种菌混合成的复合菌进行活化；
（3）、肉和菌混合：肉丁、肉片或肉糜中放入葡萄糖、戊糖和果聚糖混合均匀，再放入已经活化的复合菌混合均匀，成为肉菌混合物；还可加入含硝精盐，亚硝酸钠，葡萄糖，蔗糖，五香粉，维生素C ，山梨酸钠，大豆蛋白，味精，鲜味素，琼胶等香辛料适量；还可将其灌肠或腌制后，待发酵处理；复合菌为戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和棒状乳杆菌的混合物；
（4）、低温发酵：将肉菌混合物放置于摄氏20～30℃条件下先进行低温发酵，发酵24小时～36小时，当菌肉混合物的pH值变为pH5.5时停止低温发酵；
（5）、中温发酵：低温发酵结束，立即将发酵温度升高到摄氏35℃-45℃，进行中温发酵12～24小时，当菌肉混合物的pH值由5.5变为5.0后停止中温发酵，制成用复合菌变温发酵低生物胺的发酵肉制品。
本发明所述的低温发酵菌选用戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3，戊糖乳杆菌在肉食品生物发酵过程中不产生物胺或产胺量较少。
本发明所述的中温发酵菌选用棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001及类似具有生理特性和功能的菌。棒状乳杆菌和植物乳杆菌在肉食品生物发酵过程中不产生物胺。
低温发酵菌选用戊糖乳杆菌，戊糖乳杆菌能利用葡萄糖、戊糖大量产酸，降低pH值，抑制其它有害菌和杂菌生长，避免杂菌生成生物胺。
中温发酵菌选用棒状乳杆菌，植物乳杆菌发酵葡萄糖产酸和果聚糖，降低pH值，抑制其它杂菌生长，避免杂菌生成生物胺；植物乳杆菌还能够分解生物胺。
中温发酵菌选用植物乳杆菌，棒状乳杆菌能利用果聚糖，不产生生物胺；并不还原硝酸盐，避免硝酸盐被转化成生物胺。
本发明经过两次不同温度和两次不同菌种和菌种组合的发酵，发酵肉制品中的生物胺含量比采用单一微生物发酵方法的加工的发酵肉制品的降低80%以上（见表1和表2）、感官评价风味明显提高。
本发明采用复合菌变温发酵方法获得的发酵肉制品生物胺总量低于同一时间生产的未加发酵剂和未采用该技术加工的香肠样品(下称对照组) 的80％以上（见表1和表2），产品发酵结束时检测不到肠细菌。而未添加本发明复合菌的对照样品中检出的肠细菌量为90～100cfu/g产品。
本发明产品发酵结束时复合菌含量为108cfu/g产品，对照组产品中乳酸菌数为1.4x104cfu/g产品。可见，戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌的迅速繁殖可有效抑制有害菌和杂菌，抑制生物胺产生，减少生物80%。
表1 本发明所用的单菌种发酵对比试验在香肠中生物胺含量，mg /kg
表2 本发明所用的两种复合菌发酵在香肠中生物胺含量，mg /kg
本发明的优点是：经过两次不同温度和两次不同菌种或菌种组合的发酵，发酵肉制品中的生物胺含量显著低于只用低温发酵或只用中温发酵的肉制品，而且先低温后中温发酵的肉制品风味明显改善。
本发明采用复合菌变温发酵方法获得的发酵肉制品生物胺总量低于同一时间生产的未加发酵剂和未采用该技术加工的香肠样品(下称对照组) 的80％以上（见表1和表2），产品发酵结束时检测不到肠细菌。而未添加本发明复合菌的对照样品中检出的肠细菌量为90～100cfu/g产品。
本发明产品发酵结束时复合菌含量为108cfu/g产品，对照组产品中乳酸菌数为1.4x104cfu/g产品。可见，戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌的迅速繁殖可有效抑制有害菌和杂菌，抑制生物胺产生，减少生物80%。
结合戊糖乳杆菌在较低生长温度生长繁殖产大量酸抑制有害菌、中温棒状乳杆菌发酵不产胺和中温植物乳杆菌利用果聚糖发酵分解生物胺的特点，效控制肉制品发酵中的生物胺累积量。该技术中发酵剂制备工艺简单，发酵剂在食品发酵生产中能有效抑制肠细菌的生长繁殖，控制生物胺的产生，其产生的生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和组胺的含量，该技术用于发酵肉制品加工可有效减少生物胺的累积80%。
本发明涉及一种采用复合菌变温发酵降低发酵肉制品生物胺的方法，是降低发酵肉制品生物胺技术。该技术在生产发酵肉制品过程中，将三种有益菌紧密结合起来，根据各种菌的发酵特点，通过控制发酵温度，将发酵肉制品的生物胺含量降低到最低。该技术的主要内容包括：首先控制发酵原料初始微生物含量，在加工过程尽量避免微生物污染；然后，选择不同阶段发酵微生物菌种组合及控制发酵温度，降低发酵食品最终产品中生物胺含量。
戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌生长能力强，发酵剂制备工艺简单，发酵剂在食品发酵生产中能有效抑制肠细菌的生长繁殖，控制生物胺的产生，其产生的生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和组胺的含量，该“二次双重发酵”体系用于发酵肉制品加工可减少生物胺的累积80%以上。
具体实施方式
下面实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施例和保护范围不限于此。
实施例1、用复合菌变温发酵获得低生物胺的发酵新鲜猪肉制品的制备方法
一、称取原料：
去皮新鲜猪肉1000克，肥瘦比为3:7；
葡萄糖 10.0克；
戊糖 2.2克；
果聚糖 2.0克；
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3 106-108cfu；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001 106-108cfu；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3 106-108cfu；
含精盐2.5克，蔗糖1.5克，生抽1.0克，白酒4.0克，香辛料适量。
二、加工方法：
（1）菌株活化：在无菌操作条件下，将戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌分别接种于MRS液体培养基中，在37℃～43℃的培养箱中培养16小时～24 小时。
（2）发酵剂的制备：将活化后的三种菌在无菌操作条件下，分别接种在经巴氏杀菌后冷却至37℃～43℃的10～12.0% 脱脂乳培养基中，在37℃～43℃保温箱中培养4小时～6小时，使其活菌数达到106-108cfu/mL。
（3） 将肥肉切成约0.5cm3的肉块，拌上白酒，蔗糖，2℃～6℃腌制12小时。
（4）把瘦肉用绞肉机绞碎或用刀切成碎块，加入含精盐，香辛料，生抽和葡萄糖拌均，2℃～6℃腌制12小时～24 小时后，戊糖，果聚糖，戊糖乳杆菌，植物乳杆菌，棒状乳杆菌加入拌均，即把复合菌加入肉中成肉菌混合物。
（5）将肥瘦肉放在一起拌匀、斩拌、灌肠，用温水洗去肠体表面浮油，并用针在肠表面扎孔，便于放气。
（6）、低温发酵：将灌肠的肉菌混合物放置于摄氏20～30℃条件下先进行低温发酵，发酵24小时～36小时，当菌肉混合物的pH值变为pH5.5时停止低温发酵。
（7）、中温发酵：低温发酵结束，立即将发酵温度升高到摄氏35℃-45℃，进行中温发酵12～24小时，当菌肉混合物的pH值由5.5变为5.0后停止中温发酵，然后再日晒或烟熏2～3天后，阴干成熟1个月制成用复合菌变温发酵低生物胺的发酵肉制品，即可食用。
检测发酵新鲜猪肉制品生物胺总量：16.68 mg生物胺/kg新鲜猪肉制品，检测不到有害肠细菌。
本实施例用的去皮新鲜猪肉还可用去骨鸡肉、鸭肉、羊肉、牛肉或鱼肉代替。
实施例2、用复合菌变温发酵获得低生物胺的发酵新鲜猪肉制品的制备方法
一、称取原料：
去皮新鲜猪肉1000克，肥瘦比为3:7；
葡萄糖 12.0克；
戊糖 3.0克；
果聚糖 3.0克；
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3 106-108cfu；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001 106-108cfu；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3 106-108cfu；
含精盐2.5克，蔗糖1.5克，五香粉2.0克、维生素C 30g、山梨酸钠10克、乳酸粉1.5×108 cfu/1000克肉、酵母菌1.0克。
二、加工方法：
（1）菌株活化：在无菌操作条件下，将戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌菌株分别接种于MRS 液体培养基中，在37～43℃的培养箱中培养16～24小时。
（2）发酵剂的制备：将活化后的戊糖乳杆菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌在无菌操作条件下，分别接种在经巴氏杀菌后冷却至37～ 43℃的10～12.0% 脱脂乳培养基中，在37～43℃保温箱中培养4～ 6 小时，使其活菌数达到106-108cfu/mL。
（3）猪肉是屠宰后当天获取的，保存时间不超过两天，最好瘦肉在使用前冷冻至温度为-5～0℃，脂肪冷冻至-10～-5℃，瘦肉与脂肪的比例为8:2～6:4。
（4）按照常规的腌制馅料的方式腌制瘦肉和肥肉，经过绞肉、斩拌、乳化，下述为原料配方，
去皮新鲜猪肉1000克，
葡萄糖 12.0克；
戊糖 3.0克；
果聚糖 3.0克；
戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus ）R3 106-108cfu；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) xlbf001 106-108cfu；
棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3 106-108cfu；
含精盐2.5克，蔗糖1.5克，五香粉2.0克、维生素C 30g、山梨酸钠10克、乳酸粉1.5×108 cfu/1000克肉、酵母菌1.0克；
把上述原料全部混合均匀，即把复合菌加入肉中成肉菌混合物，将各原料混匀后灌肠。
（5）、低温发酵：将肉菌混合物放置于摄氏20～30℃条件下先进行低温发酵，相对湿度80～90％，发酵24小时～36小时，当菌肉混合物的pH值变为pH5.5时停止低温发酵。
（6）、中温发酵：低温发酵结束，立即将发酵温度升高到摄氏35℃-45℃，进行中温发酵12～24小时，当菌肉混合物的pH值由5.5变为5.0后停止中温发酵，然后再日晒或烟熏2～3天后，通风处挂晾20-30 天，制成用复合菌变温发酵低生物胺的发酵肉制品，即可食用。
检测发酵新鲜猪肉制品生物胺总量：19.12 mg生物胺/kg新鲜猪肉制品，检测不到有害肠细菌。
本实施例用的去皮新鲜猪肉还可用去骨鸡肉、鸭肉、羊肉、牛肉或鱼肉代替。
以上各实施例不是对本发明的具体限制。