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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710629285.9 (22)申请日 2017.07.28 (71)申请人 李华政 地址 530002 广西壮族自治区南宁市兴宁 区昆仑大道995号 (72)发明人 李华政 韦荣昌 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 靳浩 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) A01H 1/06(2006.01) (54)发明名称 促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法 (57)摘要 本发明公开了一种促进罗汉果。
2、UGT84A21基 因表达的方法， 包括： 步骤一、 罗汉果组培苗接种 在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 茉莉酸 甲酯在固体培养基中的浓度为50-400mol/L； 步骤二、 栽培罗汉果植株， 将浓度为50-400 mol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉 果表面； 在每次喷洒时， 预先将茉莉酸甲酯的乙 醇溶液降温至8； 每次喷洒之前， 先向罗汉果表 面喷水雾， 水雾温度为10， 每次喷洒之后， 再向 罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为15， 之后通风。 本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加 茉莉酸甲酯， 短期内快速诱导罗汉果甜苷V生物 合成途径中关键酶基因UGT84A21的高。
3、表达。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 107232065 A 2017.10.10 CN 107232065 A 1.一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 包括： 步骤一、 罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 其中， 茉莉酸甲酯 在固体培养基中的浓度为50-400 mol/L； 步骤二、 栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株， 在栽培期间， 将浓度为50-400 mol/L 的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面， 至表面滴水为止， 早、 中、 晚各喷洒一次， 连续喷施5d； 并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时， 预先将茉莉酸。
4、甲酯的乙醇溶液降 温至8； 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前， 先向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为10， 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后， 再向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为15， 之后通 风。 2.如权利要求1所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 所述步骤一 中， 所述培养条件为： 相对湿度60-66、 光照强度1400lux， 光照时间8h/d， 温度21-25条 件下培养30d。 3.如权利要求2所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 所述的固体 培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L， IBA 0.3mg/L， 琼脂3.5g/L，。
5、 蔗糖30g/l， 活性炭1.0g/L。 4.如权利要求3所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 所述步骤一 中， 所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到： 用体积百分比浓度为2的 乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯， 配制成10000 mol/L的茉莉酸甲酯母液， 并用0.22 m的微孔滤 膜灭菌， 将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中， 至茉莉酸甲酯的最终浓度为50- 400 mol/L， 将固体培养基灭菌并冷却至24-26。 5.如权利要求1所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 还包括： 步骤三、 利用qRT-PCR检测所述步骤二。
6、栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因表达。 6.如权利要求5所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 其特征在于， 所述步骤三 中， 采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107232065 A 2 促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法 技术领域 0001 本发明涉及基因技术， 尤其涉及一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法。 背景技术 0002 罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质， 罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是 异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)， 二者是通过甲羟戊酸(MVA)。
7、和甲 基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成， MVA途径发生在胞质中， MEP途径发生在质体中。 来 源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸 (GPP)， IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)， 然 后经角鲨烯合酶(SS)、 角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯， 葫芦二烯醇合酶 (CS)进一步催化形成葫芦二烯醇， 最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶(UGT)的作用下， 形成 罗汉果甜苷V。 0003 异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控， 一直被认为在其生物合成途 径中起。
8、着重要的调控作用。 作为异戊二烯途径中的限速酶， UGT基因的表达对罗汉果甜苷V 的生物合成起着决定性作用。 过表达UGT基因， 可以促进罗汉果甜苷V的积累； 相反， 如果抑 制UGT基因的表达， 罗汉果甜苷V的产量将显著降低。 现有技术中未见有促进罗汉果 UGT84A21基因表达的报道。 发明内容 0004 针对上述技术问题， 本发明设计开发了一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方 法。 0005 本发明提供的技术方案为： 0006 一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 包括： 0007 步骤一、 罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 其中， 茉莉酸 甲酯在固体。
9、培养基中的浓度为50-400 mol/L； 0008 步骤二、 栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株， 在栽培期间， 将浓度为50-400 mol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面， 至表面滴水为止， 早、 中、 晚各喷洒 一次， 连续喷施5d； 并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时， 预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶 液降温至8； 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前， 先向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为 10， 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后， 再向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为15， 之 后通风。 0009 优选的是， 所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中， 所述步骤一。
10、中， 所述培 养条件为： 相对湿度60-66、 光照强度1400lux， 光照时间8h/d， 温度21-25条件下培养 30d。 0010 优选的是， 所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中， 所述的固体培养基配 比为MS+6-BA 1.5mg/L， IBA 0.3mg/L， 琼脂3.5g/L， 蔗糖30g/l， 活性炭1.0g/L。 说 明 书 1/4 页 3 CN 107232065 A 3 0011 优选的是， 所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中， 所述步骤一中， 所述含 有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到： 用体积百分比浓度为2的乙醇水溶 液溶解茉莉酸。
11、甲酯， 配制成10000 mol/L的茉莉酸甲酯母液， 并用0.22 m的微孔滤膜灭菌， 将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中， 至茉莉酸甲酯的最终浓度为50-400 mol/L， 将固体培养基灭菌并冷却至24-26。 0012 优选的是， 所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 还包括： 0013 步骤三、 利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因 表达。 0014 优选的是， 所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中， 所述步骤三中， 采用改 良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。 0015 本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果。
12、施加茉莉酸甲酯， 短期内快速诱导罗汉 果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT84A21的高表达， 从而促进罗汉果甜苷V含量的显著 提高。 本发明操作简便， 成本低， 对环境友好， 适于规模化生产， 具有较强的实用性和推广价 值。 具体实施方式 0016 下面对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文字能够据 以实施。 0017 实施例一 0018 一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 包括： 0019 步骤一、 罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 其中， 茉莉酸 甲酯在固体培养基中的浓度为50 mol/L。 所述培养条件为： 相对湿度60-66、 。
13、光照强度 1400lux， 光照时间8h/d， 温度21条件下培养30d。 所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L， IBA 0.3mg/L， 琼脂3.5g/L， 蔗糖30g/l， 活性炭1.0g/L。 0020 所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到： 用体积百分比浓度为 2的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯， 配制成10000 mol/L的茉莉酸甲酯母液， 并用0.22 m的 微孔滤膜灭菌， 将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中， 至茉莉酸甲酯的最终浓 度为50 mol/L， 将固体培养基灭菌并冷却至24-26。 0021 步骤二、 栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植。
14、株， 在栽培期间， 将浓度为50 mol/L 的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后22d的罗汉果表面， 至表面滴水为止， 早、 中、 晚各喷洒一次， 连 续喷施5d； 并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时， 预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温 至8； 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前， 先向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为10， 每 次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后， 再向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为15， 之后通风。 0022 步骤三、 利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因 表达。 0023 先将罗汉果果实进行处理， 挑取果肉， 切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好， 。
15、立即 置于液氮中速冻， 保存于-80备用。 0024 采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。 0025 采用ABI7500实时荧光定量PCR仪。 说 明 书 2/4 页 4 CN 107232065 A 4 0026 将RNA反转录为cDNA的反应体系为RNA 10.0 L， PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 L， RT Primer Mix 1.0 L， 5PrimeScript Buffer 2 4.0 L， RNase Free dH2O 4.0 L； 反应条件为37(15min)到85(5s)， 再到4。 0027 采用Primer Premier。
16、 5.0软件设计引物， 由生工生物工程(上海)股份有限公司合 成。 其中， UGT84A21引物序列为(FP： CGCCATATGCACCACCACCACCACCACATGGTAAAGGAAGTTGCAGATG(SEQ ID NO:1)， RP： CCGAGCTCTCAAGAAGTCGCCGAACAATGG(SEQ ID NO:2)， 内参基因用UBQ5， 序列为(FP： ATAAAAGACCCAGCACCACATTC(SEQ ID NO:3)， RP： CCCTTGCCGACTACAACATCC(SEQ ID NO:4)。 0028 qRT-PCR反应体系(20 L)为SYBR Premix。
17、 Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2) 10.0 L， PCR Forward Primer(10 M)0.8 L， PCR Reverse Primer(10 M)0.8 L， ROX Reference Dye of Dye II(50)0.4 L， Template 2.0 L， dH2O 6.0 L。 反应条件为95 (30s)， 接着进行40个cycles95(5s)， 95(34s)。 采用HPLC法测定罗汉果甜苷V的含量。 色谱条件为： 色谱柱： DIKMA Diamomsil(TM)C18(4.6mm250mm， 5 m)； 流动相： 乙腈-水(梯 度0-。
18、40min； 10线性升至40； 40.01-45mm； 回至10)； 流速： 1.0ml/min， 检测波长： 203nm。 供试品样液的配制为： 取罗汉果粉末2g， 精密称定， 置于100ml具磨口塞锥形瓶中， 精 密加入甲醇25ml， 摇匀， 称定重量。 超声处理1h， 放冷， 再称定重量， 并用甲醇补足减失的重 量， 摇匀， 以0.45 m的滤液微孔滤膜过滤即可。 0029 对比例一 0030 步骤一、 将罗汉果组培苗接种不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养； 步骤二、 不 对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯； 其他条件与实施例一一致。 0031 qRT-PCR检测结果显示， 在对比例一中， 罗。
19、汉果UGT73AF1基因的表达量为1， 而在实 施例一中， 罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达10.8， 较对比例一提高了980， 可见， 实施例 一可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。 HPLC检测结果显示， 在对比例一中， 罗汉果 甜苷V含量为0.79， 而在实施例一中， 罗汉果甜苷V含量高达2.13， 较对比例一提高了 169.62， 可见， 实施例一还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。 0032 实施例二 0033 一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 包括： 0034 步骤一、 罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 其中， 茉莉酸 甲酯在固。
20、体培养基中的浓度为200 mol/L。 所述培养条件为： 相对湿度60-66、 光照强度 1400lux， 光照时间8h/d， 温度25条件下培养30d。 所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L， IBA 0.3mg/L， 琼脂3.5g/L， 蔗糖30g/l， 活性炭1.0g/L。 0035 步骤二、 栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株， 在栽培期间， 将浓度为200 mol/ L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后24d的罗汉果表面， 至表面滴水为止， 早、 中、 晚各喷洒一次， 连 续喷施5d； 并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时， 预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温 至8； 每次喷洒茉莉。
21、酸甲酯的乙醇溶液之前， 先向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为10， 每 次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后， 再向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为15， 之后通风。 0036 其他条件均与实施例一一致。 0037 对比例二 0038 步骤一、 将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养； 步骤二、 说 明 书 3/4 页 5 CN 107232065 A 5 不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯； 其他条件与实施例二一致。 0039 qRT-PCR检测结果显示， 在对比例二中， 罗汉果UGT73AF1基因的表达量为1， 而在实 施例二中， 罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达17.9， 较对比例。
22、二提高了1690， 可见， 实施 例二可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。 HPLC检测结果显示， 在对比例二中， 罗汉 果甜苷V含量为0.78， 而在实施例二中， 罗汉果甜苷V含量高达2.24， 较对比例二提高了 187.18， 可见， 实施例二还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。 0040 实施例三 0041 一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法， 包括： 0042 步骤一、 罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养， 其中， 茉莉酸 甲酯在固体培养基中的浓度为300 mol/L。 所述培养条件为： 相对湿度60-66、 光照强度 1400lux， 光照时间。
23、8h/d， 温度25条件下培养30d。 所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L， IBA 0.3mg/L， 琼脂3.5g/L， 蔗糖30g/l， 活性炭1.0g/L。 0043 步骤二、 栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株， 在栽培期间， 将浓度为300 mol/ L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后28d的罗汉果表面， 至表面滴水为止， 早、 中、 晚各喷洒一次， 连 续喷施5d； 并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时， 预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温 至8； 每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前， 先向罗汉果表面喷水雾， 水雾温度为10， 每 次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后， 再向罗汉果表。
24、面喷水雾， 水雾温度为15， 之后通风。 0044 其他条件均与实施例一一致。 0045 对比例三 0046 步骤一、 将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养； 步骤二、 不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯； 其他条件与实施例三一致。 0047 qRT-PCR检测结果显示， 在对比例三中， 罗汉果UGT73AF1基因的表达量为1， 而在实 施例三中， 罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达15.3， 较对比例三提高了1430， 可见， 实施 例三可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。 HPLC检测结果显示， 在对比例三中， 罗汉 果甜苷V含量为0.71， 而在实施例三中， 。
25、罗汉果甜苷V含量高达2.11， 较对比例三提高了 197.18， 可见， 实施例三还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。 0048 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107232065 A 6 SEQUENCE LISTING 李华政 促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法 2016 4 PatentIn version 3.5 1 49 DNA 人工序列 1 cgccatatgc accaccacca ccaccacatg gtaaaggaag ttgcagatg 49 2 30 DNA 人工序列 2 ccgagctctc aagaagtcgc cgaacaatgg 30 3 23 DNA 人工序列 3 ataaaagacc cagcaccaca ttc 23 4 21 DNA 人工序列 4 cccttgccga ctacaacatc c 21 序 列 表 1/1 页 7 CN 107232065 A 7 。