技术领域
本发明属于水产饲料和生物工程技术领域，具体的说是一种新型 对虾生物饲料及其应用。
背景技术
集约化的养殖模式对水产动物的养殖密度和养殖技术提出了很 高的要求，在高密度的养殖条件下，水产动物的生长缓慢、品质下降、 发病率增加、死亡率升高。目前，许多水产动物疾病的防治有赖于抗 生素和化学药物的使用，而长期使用抗生素和化学药物将会使病原菌 具有抗药性，药物的功效也将随之降低；而且抗生素和化学药物容易 造成养殖水体的污染和生态环境的破坏，一些水产动物体内的药物残 留还会对人类的食品安全产生威胁。生物饲料作为一种新型的绿色饲 料添加剂越来越受到饲料行业的关注和重视。生物饲料被国际上公认 为是极具潜力的“第四代饲料”，近年来得到国内外关注。所谓生物 饲料是指利用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等高新技术所开发的 新型饲料资源，如酶制剂、益生菌、生物活性肽和寡糖等。通过对饲 料原料进行生物工程发酵和酶解，产生益生菌和活性肽等，提高饲料 效价和利用率，有效节约资源，大幅度减少环境和水体污染；有效增 强动物的免疫抗病力，预防病害，保证安全，杜绝有害物和违禁品使 用等；实际效果表现为吸收消化好、诱食性强、水污染轻、发病少、 经济效益提升。在动物养殖生产中作为微生态制剂的生物饲料具有促 进生长繁殖、增强机体免疫力、调节机体微生态环境、改善动物产品 品质等功效。
生物饲料具有提高水产动物免疫力和抗病力的作用已在生产中 得到了证实。生物饲料配方中包含了经过益生菌发酵的产物，与传统 的配合饲料及添加有微生态制剂的饲料相比，其差别在于生物饲料中 的部分物料经益生菌降解后以易消化吸收的小分子蛋白、小肽、核酸、 核苷酸和壳寡糖等形式存在，其中的植物蛋白被转化为微生物的菌丝 蛋白，同时富含耐高温益生菌和各种酶类，具有促进水产动物免疫器 官发育和提高抗病力的作用，其促生长作用十分显著。此外，生物饲 料中的益生菌有稳定养殖生态的作用，它可以直接吸收或降解水中的 有机物质或有毒物质，改善养殖水体的水环境。进入水体后能迅速消 除水中的氨氮、硫化氢、有机酸等有害物质，改善水质，平衡酸碱度。 因此生物饲料是一种新型的功能饲料，物料经过发酵和酶解后抗营养 因子得以消除，营养物质也更易于消化吸收，在生产中推广应用后有 利于降低生产成本，提高养殖产量和效益。
最早应用生物饲料概念的是“发酵豆粕”，目前发达国家和我国 的台湾等地已普遍应用，国内近年在南方也有少数企业开始使用。国 内真正全面意义上的“生物发酵饲料”尚处于空白，因此新型对虾生 物饲料的研究与开发对水产养殖业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型对虾生物饲料及其应用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种新型对虾生物饲料，饲料为干料，成分按重量百分比计，发 酵豆粕10～15﹪、发酵生粕15～25﹪、酶解多肽15～20﹪、破壁酵 母5～7﹪、鱼粉5％～7﹪、虾壳粉3～5﹪、高筋面粉20～25﹪、大 豆磷脂1～2﹪、磷酸二氢钙1～2﹪、复合维生素0.5～1﹪和复合矿 物质0.5～1﹪。
所述发酵豆粕为将枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母接种在豆粕中 发酵获得；
所述发酵生粕将枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母接种在生粕中发 酵获得。
所述酶解多肽为用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解动物加工副产 品所得产物。
所述动物加工副产品为畜禽屠体、内脏、肉(骨)粉、血粉、鱼 排、鱼内脏、鱼粉蒸煮水浓缩物中的一种或几种的混合。
所述破壁酵母为将热带假丝酵母和产朊假丝酵母于培养基中发 酵培养所得发酵物经破壁处理后所得物质；其中，培养基为淀粉加工 副产物玉米浆等。
所述复合维生素成分为(g/kg)维生素A，15～20；维生素D， 11～15；维生素E，1～3；维生素K，2.5～5；维生素B1，4～8；维 生素B2，5～10；维生素B6，5～10；烟酸，20～25；泛酸，20～25； 生物素，1～2；胆碱，150～200；叶酸，10～20；维生素B12，1～ 2，余下为脱脂米糠。
所述复合矿物质成分为(g/kg)，磷酸二氢钙，550～600；硫酸 铬钾，5～10；碳酸铜，4～8；柠檬酸铁，10～20；氧化镁，26～30； 硫酸锰，5～10；单水柠檬酸钾，200～300；硫酸钾，50～100；氯 化钠50～100，余下为沸石粉。
按上述比例将发酵豆粕、发酵生粕、酶解多肽、破壁酵母、鱼粉、 虾壳粉、高筋面粉、大豆磷脂、磷酸二氢钙、复合维生素和复合矿物 质充分混合均匀，然后经过粗粉机和超微粉碎机，分选、制粒、熟化、 烘干即得到适合对虾幼体、成体等不同发育阶段的干粉饲料。
同时对虾在不同生长阶段具有不同特点，其营养需要也各有不 同，仅通过调整各种原料的用量和所必需添加的营养物质，即可实现 获得不同发育时期的系列饲料产品。
具体是，对虾幼体阶段需要优质的高蛋白质饲料，促使对虾生长 快、活力强、成活率高，给养殖打下基础。在中后期随着对虾对饲料 的消化吸收能力增强，对蛋白质的需求相对比幼虾低，因此针对对虾 不同生长阶段的生理特点，新型对虾生物饲料针对幼体阶段，提高富 含小肽的酶解多肽与复合维生素和复合矿物质的比例，优质蛋白质含 量相对较高；对于对虾中后期的生物饲料，提高发酵豆粕与发酵生粕 等植物性蛋白源比例，并且减低粗蛋白含量，特别适用于高密度养殖 对虾中后期，一方面降低饲料成本，同时可以减少水环境的污染。
本发明所具有的优点：
本发明通过利用来源于动物性、植物性、单细胞微生物的生物酶 解制备小肽、复合益生菌发酵植物蛋白、超微破壁制备酵母蛋白作为 主要的蛋白源，综合考虑其营养组成以降低饲料中鱼粉含量，与其他 原料经合理的配比开发出新型的对虾生物饲料。本发明适用于对虾幼 体及成体各阶段，能明显降低对虾饲料鱼粉用量和粗蛋白含量，与普 通对虾饲料相比粗蛋白含量降低3-5％，具有低蛋白、高消化率、富 含活性肽、益生活菌及有机酸等特点。
具体是，本发明饲料选择由生物酶解制备的动物蛋白多肽、复合 益生菌发酵的植物蛋白、超微破壁制备的酵母蛋白作为主要的蛋白 源，通过合理的配比降低对虾饲料中的鱼粉含量，再与其他原料经合 理的配比而形成本发明的新型对虾生物饲料。通过发酵工程、酶工程 等多元化生物技术的综合运用，将低质廉价的多种蛋白原料处理后获 得富含活性益生菌、功能活性肽等生物活性物质的优质蛋白原料。采 用功能性蛋白原料的对虾生物饲料最大限度的降低饲料中鱼粉用量， 将鱼粉用量降到8％以下，添加多种蛋白源克服单一蛋白源氨基酸不 平衡问题。
本发明利用生物酶解小肽、发酵植物蛋白、破壁酵母作为主要的 蛋白源，生产低鱼粉配方的饲料，可以显著降低对虾饲料中鱼粉的使 用量，能够提高饲料效价和利用率、有效节约资源，减少环境和水体 污染、增强动物免疫抗病力，经过长期饲养实验结果表明，用本发明 的对虾低蛋白饲料饲养凡纳滨对虾，对其生长性能和饲料系数没有不 良影响，还可减少水体氮磷排放量。本发明有利于降低成本，节约资 源，提高饲料利用率，减少养殖过程中氮磷排放，以减少环境污染， 增强动物免疫抗病力、预防病害、保证安全等。
附图说明
图1为本发明实施例提供的生物料及普通料对凡纳滨对虾免疫 及消化酶指标的效果图。其中，A为生物池与普通池对虾血清中超氧 化物歧化酶活性含量比较；B为生物池与普通池对虾血清蛋白含量比 较；C为生物池与普通池对虾血清抑菌活性比较；D为生物池与普通 池对虾血清溶菌活性含量比较；E为生物池与普通池对虾肝胰腺蛋白 含量比较；F为生物池与普通池对虾总蛋白酶含量比较。
图2为本发明实施例提供的副溶血弧菌对两种饲料组对虾攻毒 试验结果图。
具体实施方式
本发明的一种新型对虾生物饲料，包含：发酵豆粕、发酵生粕、 酶解多肽、破壁酵母、鱼粉、虾壳粉、高筋面粉、大豆磷脂、磷酸二 氢钙、复合维生素以及复合矿物质原料组分。
下面结合具体较佳实施例和实验例对本发明作进一步说明，但本 发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1
饲料按重量百分比计，：发酵豆粕15﹪、发酵生粕18﹪、酶解 多肽20﹪、破壁酵母7﹪、鱼粉7﹪、虾壳粉5﹪、高筋面粉22﹪、 大豆磷脂2﹪、磷酸二氢钙2﹪、复合维生素1﹪、复合矿物质1﹪。
所述发酵豆粕是利用复合益生菌发酵的植物蛋白。筛选产蛋白酶 活性较高的枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母等混合于豆粕中发酵。其是 利用微生物混合固态发酵技术来制备发酵植物蛋白，通过微生物的发 酵最大限度地消除豆粕中的抗营养因子，有效地降解分子量较大的蛋 白为优质小肽蛋白源，并可产生益生菌、小肽、乳酸、UGF(未知生 长因子)等活性物质，成为具有小肽营养和益生特性的蛋白原料。
具体是，将枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母(体积比1:1)以10％ (体积质量比V/W)接种量接入经过灭菌处理的以豆粕原料的发酵基 质中，37℃恒温培养2-3天结束。
所述发酵生粕是利用复合益生菌发酵的植物蛋白。筛选产蛋白酶 活性较高的枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母等混合于生粕中发酵。其是 利用微生物混合固态发酵技术来制备发酵植物蛋白，通过微生物的发 酵最大限度地消除生粕中的抗营养因子，有效地降解分子量较大的蛋 白为优质小肽蛋白源，并可产生益生菌、小肽、乳酸、UGF(未知生 长因子)等活性物质，成为具有小肽营养和益生特性的蛋白原料。
具体是，将枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母(体积比1:1)以10％ (体积质量比V/W)接种量接入经过灭菌处理的以生粕原料的发酵基 质中，37℃恒温培养2-3天结束。
所述酶解多肽，是生物酶解陆生和水产动物加工副产品制备的动 物蛋白小肽。加工副产品包括畜禽屠体和内脏、肉(骨)粉、血粉、 鱼排、鱼内脏、鱼粉蒸煮水浓缩物等中的一种或几种的混合。这类原 料较鱼粉产量高，价格较低等，同时有着较高的蛋白含量和平衡的氨 基酸组成。通过蛋白酶酶解，将各种大分子蛋白降解为可溶性蛋白和 小分子多肽的混合物。经过酶解处理的蛋白更易于吸收，是对虾饲料 的理想蛋白源。
具体是，利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶(均购自丹麦诺维信公司) 酶解动物加工副产品，两种酶的添加量各为0.5％(W/W)，在温和的 条件下进行，即恒温搅拌，在45～55℃下酶解1～2小时，然后灭酶 终止反应。
所述的破壁酵母，是利用超微粉碎方式破壁酵母，饲料酵母属单 细胞蛋白。破壁酵母超微粉富含氨基酸、小分子肽、核苷酸、维生素、 微量元素等物质，且营养成分的配比具有先天的协调性，实际上属于 一种复合营养源，对虾对其的利用度更高。
具体是，以淀粉生产企业的副产物，按照不同的质量比(W/W) 混合玉米浆(60％)、玉米麸(30％)、玉米皮(8.5％)为主要底物， 再添加少量尿素(1.5％)作为无机氮源，混合接种10％热带假丝酵母 和10％产朊假丝酵母液体种子(体积质量比V/W)，在28-32℃的适 宜温度下发酵1-2天，发酵终止后通过流化床干燥得到酵母产物。所 得酵母菌体及代谢产物等干物质采用超微粉碎技术，使超微后所有组 分都能够通过300目的筛网。
所述的复合维生素将下列成分为(g/kg，计量标准按照每kg维 生素预混料)均匀混合后的混合物：维生素A，15；维生素D，11； 维生素E，1；维生素K，2.5；维生素B1，4；维生素B2，5；维生 素B6，5；烟酸，20；泛酸，20；生物素，1；胆碱，150；叶酸，10； 维生素B12，1；脱脂米糠，754.5。
所述的复合矿物质将下列成分为(g/kg，计量标准按照每kg矿 物质预混料)均匀混合后的混合物：磷酸二氢钙，550；硫酸铬钾，5； 碳酸铜，4；柠檬酸铁，10；氧化镁，26；硫酸锰，5；单水柠檬酸 钾，200；硫酸钾，50；氯化钠50，沸石粉100。
制备方法是：将称取的上述原料混合均匀后，经过粗粉机和超微 粉碎机，使所有成分都能够通过80目的筛网；将所有原料加入到调 制器，通入90℃的水蒸气调制7分钟，然后在80℃的温度下进行挤 压制粒；在90℃条件下将饲料颗粒烘干；将烘干后的颗粒饲料冷却 后，经破碎、筛分、包装，即得到种对虾幼体开口的干粉生物饲料。
实施例2
对虾养成中期干粉生物饲料，按重量百分比计，发酵豆粕15﹪、 发酵生粕20﹪、酶解多肽18﹪、破壁酵母7﹪、鱼粉6％、虾壳粉5 ﹪、高筋面粉25﹪、大豆磷脂1.5﹪、磷酸二氢钙1.5﹪、复合维生 素0.5﹪、复合矿物质0.5﹪。
其中，复合维生素与复合矿物质的具体成分与实施例1相同。
实施例3
对虾养成后期干粉生物饲料，按重量百分比计，发酵豆粕15﹪、 发酵生粕25﹪、酶解多肽15﹪、破壁酵母5﹪、鱼粉5％、虾壳粉5 ﹪、高筋面粉25﹪、大豆磷脂1﹪、磷酸二氢钙1﹪、复合维生素0.5 ﹪、复合矿物质0.5﹪。
其中，复合维生素与复合矿物质的具体成分与实施例1相同。
实施例4
利用上述实施例制备的饲料对对虾生长、免疫抗病及环境的效果 检测：
两种饲料，饲料1为商用对虾饲料(普通料)，饲料2为本发明 上述实施例2制备的对虾幼体期和中期饲料(生物料)，于7、8月 在山东滨州乔庄镇养殖场进行了凡纳滨对虾生产性应用对比试验，以 一定时间间隔测定试验池和对照池对虾生长、免疫、消化指标及环境 指标等，并以副溶血弧菌进行了攻毒。以存活率、特定生长率及饲料 系数为生长性能评价指标，以血清中蛋白含量、溶菌活性、抑菌活性 及超氧化物歧化酶活性为免疫评价指标，以肝胰腺中总蛋白含量及总 蛋白酶含量为消化性能的评价指标，以PH、NH4-N、NO2-N等为环境评 价指标，
生长与免疫指标的测定方法:
存活率(Survival rate,SR,％)＝成活尾数/总尾数×100％；
对虾特定生长率(SGR)和饲料效率(FER)计算公式如下：
SGR＝[(lnWf-lnWi)/T]×100％
FER＝(Wf-Wi)/Wt
Wf、Wi分别表示平均终体质量(g)、平均初体质量(g)；T表示饲养时 间(d)；Wt表示实验期间投入饲料量(g)。
血清中及肝胰腺中蛋白含量采用蛋白总量试剂盒测定。
溶菌活性：按Hultmark等(1980)的方法进行测定。溶壁微球菌 (Microeoecus lxsoleikticu)冻干粉用0.1M,pH＝6.4磷酸钾盐缓冲 液(PBS)配成OD570≈0.3的菌悬液,取3ml配制好的菌悬液放入试管, 加入200μl血清混匀,测其570nm透光值T0，对照组加入200μl 100U/ml溶菌酶标准品。然后将试管移入37℃水浴3Omin,取出后立 即置于冰浴中10min,让其终止反应,测570nm透光值T，溶菌酶活力 按下公式计算:
ALSZ(mU/mgprot)＝(T血清-T血清0)/(T标准-T标准0)×溶菌酶标准品 ALSZ(mU/mgprot)/蛋白浓度
抑菌活性：将大肠杆菌用LB液体培养基扩大培养，8000g离心弃上 清，后用等体积0.1M,pH＝6.4磷酸钾盐缓冲液(PBS)复溶成菌悬液, 使其OD570≈0.3,取3ml配制好的菌悬液放入试管,加入200μl血清混 匀,测其570nm透光值T0，对照组加入200μlPBS水。然后将试管移 入37℃水浴3Omin,取出后立即置于冰浴中10min,让其终止反应,测 570nm透光值T，溶菌酶活力按下公式计算:
A抑菌(mU/mgprot)＝(T血清-T血清0)/(T对照×蛋白浓度)
超氧化物歧化酶活性采用南京建成SOD试剂盒测定。
总蛋白酶含量：将240μl Tris-HCl(50mM，PH7.5)加入20μl肝 胰腺匀浆液及500μl 2％偶氮酪蛋白室温10min，后加入500μl 2％ 三氯乙酸室温5min终止反应，6500g离心5min，取上清液测定450nm 吸光值。定义每毫克蛋白每分钟吸光值下降0.001为一个酶活力单 位。
表1 生物料及普通料对凡纳滨对虾免疫及消化酶指标的影响
实验结果表明：生物饲料试验池成活率为91.5％，比对照池高出 5.3％；生物饲料饲料系数为0.96，而普通饲料为1.00；喂养一定时 间后，生物饲料组对虾的超氧化物歧化酶活性、血清总蛋白含量及溶 菌活性较普通饲料组有显著性提高(图1)；生物饲料组对虾总蛋白 酶活性有显著性提高(表1)；生物饲料组NH4-N、NO2-N等指标略 低于普通饲料组，但两者无显著性差异。攻毒试验(1.03×107CFU/ml， 200μl/尾)表明，24h内生物饲料组对虾的成活率高于普通饲料组 (图2)。另外，生物饲料试验池在对虾增长、增重和生长速度上均 好于对照池(使用对照组饲料)；试验池虾的平均体长大于对照池， 而且试验池对虾肠道粗长且清晰无炎症，虾粪较松软，说明在使用对 虾生物饲料有助于消化和吸收率的提高，并且经济效益显著。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何 形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技 术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属 于本发明技术方案的范围内。